全 文 ：
综述与专论

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2006年增刊
可转化人工染色体文库的构建与鉴定
宋琳琳 1
赵茂林 2
( 1 首都师范大学生命科学学院, 北京
100037;
2北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心,北京
100089 )


摘
要:
随着人类和植物基因组计划的实施, 能容纳大片段的人工染色体载体发展迅速。而用 YAC、BAC
和 PAC等基因组文库进行目的基因的筛选, 在获得候选克隆后,通常要进行亚克隆,然后对每个亚克隆逐一进行基
因功能互补试验, 不仅工作量大,而且有遗漏目的基因的危险。TAC载体含 P1质粒和 R i质粒的复制子, 可直接转
化植物, 大大加速了工作进程。概括性的叙述了 TAC载体的发展, TAC文库构建的程序及文库鉴定的问题。
关键词:
可转化人工染色体
文库构建
鉴定
Construction and Identification of Transformation
Competent
Artificial Chromosome L ibrary
Song L in lin
1
ZhaoM ao lin2*
( 1Colleg e of Life Science, Cap italN orm al University, Beijing 100037;
2B eij ing Agriculture B io techno logy Research C enter, Beijing Academy
of Agriculture and Forestry Sciences , B eij ing 100089)


Abstrac:t
Artific ia l chrom osome vec to rs wh ich can take larger fragm en tDNA deve lop qu idklyw ith the actua lizing of
hum an and plant genom ic p lan. It w ill take the dangerase to lo se the a im gene and havem uch w ork ifw e use theYAC、BAC
and PAC genom ic libra ry, for it is usually necessary to subc lone and take the gene fuc tion
comp lement exper im ent after we
ge t the poss ible c lones. TAC vectors have the P1
plasm id and R i
plasm id or ig in o f replication and acce le ra te work course
for it can be transferred to p lant directly. Th is paper presents a br ie f introduction to the deve lopm ent of TAC, and the
process o f TAC library construc tion and identification.
Key words:
T ransfo rm ation
com pe tent a rtific ia l chrom osom e
L ibrary construc tion
Identification


基金项目:国家自然科学基金 ( 30370905)项目和北京市优秀人才培养专项经费资助


作者简介:宋琳琳 ( 1981
) ,河南新乡人,主要从事多枝赖草可转化人工染色体文库的构建


通讯作者:赵茂林, E
m ai:l zh aom aol in@ baafs. net. cn


随着人类和植物基因组计划的实施, 构建基因
组文库己成为遗传研究实验室的常规策略。构建基
因组文库的载体很多,克隆载体的整体结构、克隆能
力和转化效率也都随着研究的需要而迅速发展。早
期的
噬菌体、cosm id载体等由于其克隆能力相对
较小 ( 噬菌体 24kb左右, cosm id35~ 45kb)而严重
限制了它们的应用。后期发展起来的酵母人工染色
体 ( yeast art ific ia l chromosome, YAC)、细菌人工染色
体 ( bacterial artificia l chromosome, BAC )、P1人工染
色体 ( P1
derived artificia l chromosom e, PAC)和哺乳
动物人工染色体 ( m ammalian artificia l chromosome,
MAC )等,能容载大片段 DNA的能力大大增加, 使
构建高等真核生物的基因组文库成为可能。应用这
些载体已成功构建了很多生物的基因组文库。而用
YAC、BAC和 PAC等基因组文库进行目的基因的筛
选,在获得候选克隆后, 通常要进行亚克隆, 然后对
每个亚克隆逐一进行基因功能互补试验, 不仅工作
量大,而且有遗漏目的基因的危险。能够直接进行
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2006年增刊
植物功能转化的双元细菌人工染色体 ( ( b inary
BAC, B IBAC)和可转化人工染色体 ( transformation

competent artificial chromosome, TAC )便应用而生。
1
B IBAC载体和 TAC载体的发展
1. 1
双元细菌人工染色体 ( BIBAC )载体
1996年, Ham ilton等 [ 1, 2]结合根癌农杆菌介导
转化双元载体和细菌人工染色体 ( BAC )载体的特
点,构建了双元 BAC载体 ( B IBAC)。B IBAC有大肠
杆菌 F因子的复制子, 同时又具有发根农杆菌 R i质
粒的复制子和抗卡那霉素筛选标记及 T
DNA的左
右边界。因此,能在大肠杆菌和根癌农杆菌中以单
拷贝形式复制。应用 B IBAC载体已成功地将一段
30kb的酵母 DNA和一段 152kb的人类基因组 DNA
在农杆菌介导下导入烟草核基因组并稳定遗传 [ 2]。
1. 2
可转化人工染色体 ( TAC )载体及其发展
L iu等 [ 3]结合 PAC载体和双元载体的特点, 构
建了 TAC载体 pYLTAC7。 pYLTAC7载体具有以下
特点: ( 1)具有H ind
和 Bam H I等一系列的酶切
位点, 有利于各种不同酶切片段的 DNA的插入。
( 2)其具有 P1复制子和 R i质粒 pR iA4复制子, 能
在大肠杆菌和农杆菌中以单拷贝形式穿梭复制。因
此在获得候选克隆后,不必进行亚克隆,而直接可以
进行植物功能转化, 大大加速了工作进程。 ( 3)同
时含有 P1裂解复制子, 在异丙基硫代


D
半乳糖
苷 ( Isoprophy lth io


D
ga lactoside, IPTG )诱导产生
多拷贝,有利于克隆 DNA的提取和文库筛选。 ( 4)
重组筛选标记是卡那霉素抗性基因 (Kanr )和蔗糖
致死基因 ( sacB )。 sacB 基因编码果聚糖蔗糖酶
( Levansurase), 催化从蔗糖转移果糖残基到各种受
体蛋白上,影响受体的正常功能。当琼脂培养基中
含有 5%的蔗糖时, sacB基因产物能使大肠杆菌和
农杆菌致死。当有外源 DNA片段插入到 pYLTAC7
的克隆位点后, sacB基因失活,阳性克隆在含有 5%
的蔗糖的琼脂培养基中可以生长,而未插入外源基
因的阴性克隆致死。利用 Kanr和 sacB 的双重选择
作用,使在空载体不能在 LB+ K an+ 5%蔗糖的平板
上生长,而长出的均为有插入片段的阳性克隆,减少
了假阳性的发生,更有利于筛选。 ( 5)在其 T
DNA
右边界处插入了植物选择标记潮霉素磷酸转移酶基
因 ( hp t), 在 Pnos启动子作用下发挥作用。
表 1
五种 TAC载体的比较
V ector System s Plan t SelectableM arker R ep licon C lon ing SelectionM ark er G ene length of the Vector sys tem s ( kb )
pYLTAC7 Pnos
H ptNos3
P1 Lyt icP1 Plasm idpR iA4 Sac B 22, 898
pYLTAC 17 A ct1
B arNos3
P1 Lyt icP1 Plasm idpR iA4 Sac B 23. 2
pYLTAC 27 A ct1
H p tNos3 P1 Lyt icP1 Plasm idpR iA4 Sac B 23. 8
pYLTAC 68H P35S
HPT
35S

P1 Lyt icP1 Plasm idpUC oripVS1 ccdB 18. 2
pYLTAC747H P35S
HPT
35S P1 LyticP1 Plasm idpVS1 Sac B 18. 9


由于 Pnos启动子在单子叶植物中的启动能力
较弱, L iu等 [ 4] 对 pYLTAC7进行了改造, 构建了
TAC载体 pYLTAC17(见表 1 )。主要改造之处为:
( 1)选用水稻肌动蛋白 Act
强启动子,更适合用做
构建单子叶植物, 如小麦等的文库。 ( 2)把植物选
择标记基因 hp t替换为 bar基因。 bar基因编码对磷
化麦黄酮 ( PPT)和双丙胺类 ( bia laphos)除草剂的抗
性,适合用作禾本科作物转化体的选择。
用 bar基因作为筛选标记基因, 在进行候选克
隆的功能互补转化中存在筛选困难, 假阳性率高,有
基因型限制等问题。因此, 结合前两者的特点构建
了载体 pYLTAC27。该载体以 A ct
为启动子, hp t
为筛选标记基因。
L in等 [ 5]用受体载体 pYLTAC747和供体载体
pYLV、pYLSV, 建立了能高效连接和转移多个基因
的多基因排列和转化载体系统。Cre / loxP重组系统
和寄主体内的核酸内切酶能够使基因排列, 因此可
使多个基因依次转移到 pYLTAC747载体,再将含有
多个外源基因的 TAC克隆转化植物。
TAC载体与 B IBAC载体相比, 首先大肠杆菌中
84
2006年增刊 宋琳琳等:可转化人工染色体文库的构建与鉴定
的复制起点不同, TAC源于 P1噬菌体; 而 B IBAC源
于 F因子。其次, TAC载体中具有 P1裂解子 ( 1yt ic
replicon) ,可以在 IPTG的诱导下产生 5 ~ 20个拷
贝,提高了质粒产量。TAC载体系统已被证明能够
高效的转化拟南芥,并把含有 sgr1基因的 2个 TAC
克隆转化到 sgr1突变体中, 使其恢复了重力感
应 [ 3]。目前, 应用 TAC 载体已成功构建了拟南
芥 [ 3]、小麦
簇毛麦易位系 6VS /6AL[ 6 ]、高抗黄矮病
基因的小麦
中间偃麦草易位系 [ 7]、籼稻品种
H359
[ 8 ]、稻瘟菌 [ 9]、百脉根 [ 10]、水稻 [ 11]、桃 [ 12]、六倍
体小麦 [ 13]、番茄 [ 14]等的基因组文库。
2
TAC文库的构建程序
其过程主要包括载体 ( vector)及胶片 ( p lug)或
胶珠 ( bead)的制备, 部分酶切 ( part ial digestion)、大
片段 的选择 ( 1arge size DNA selection ) , 连接
( 1 igation )、转化 ( transformation ) 及克隆的挑取
( pick ing )。
2. 1
载体的制备
载体的制备主要包括单克隆菌的培养、质粒
DNA的提取和纯化、载体的酶切、载体的脱磷酸化、
透析除盐、浓度估测和分装保存等步骤。载体质量
的高低直接影响文库构建中后续的连接、转化问题。
酶切不足,则影响载体和目的 DNA的连接, 影响转
化效率;酶切过量, 对载体造成损坏, 造成假阳性的
提高 [ 15]。如果载体脱磷不足,连接反应中载体会首
先自连,也会大大降低转化效率 [ 16]。脱磷后的载体
不能在 - 80
长期保存,否则会导致载体迅速降解。
2. 2
高分子量 (HMW )核 DNA的获得
将材料在液氮中研磨成粉末。要确保液氮充
分,防止研磨过程中核 DNA的降解。去除细胞器和
其他杂质现在主要有两种方法: 一种是用核提取液
反复的清洗,将叶绿体和其他杂质清除掉;另一种是
提取出细胞核裂解后直接通过一次脉冲场电泳,回
收 Mb级 DNA, 得以纯化。第二种方法较第一种方
法既简单方便效果又好, 所以是现在常用的一种方
法 [ 17]。将核 DNA包埋在低熔点琼脂糖中形成栓塞
( plugs)可有效的防止核 DNA的降解 [ 16]。
2. 3
部分酶切和大片段的选择
对核 DNA进行酶切,最终目的是通过酶切产生
大小比较集中的片段, 根据需要选择最佳酶用量。
一般通过两次脉冲场电泳进行片段选择。第二次脉
冲场选择的时候可以通过反向电泳对 DNA起到压
缩条带的作用。
2. 4
大片段核 DNA与载体连接及转化受体感受态
细胞
大片段核 DNA与载体的连接效率高低主要取
决于插入 DNA片段与载体的比例。因此,在大量的
连接反应之前一定要设置一些不同的比例, 摸索出
最佳连接条件。电转化因其高效的转化效率成为现
在构建文库中转化的常用手段。电转化效率与插人
片段的大小有关, 插人片段越大, 转化效率越低; 反
之,越高。此外,转化条件也直接影响转化效率、插
人片段大小及假阳性克隆的含量。因此, 在大规模
转化前需进行转化预试验,以选择最佳的转化条件。
2. 5
阳性克隆的保存
对克隆保存时的分检有人工和全自动分子生物学
工作台技术 ( robotics)两种。用单克隆的形式对阳性克
隆进行保存既费时又费力,并要占用大量的空间。现
在发展的混合克隆池方法不失为一个好的选择。
3
TAC文库的鉴定
3. 1
TAC文库的筛选
用与目的基因紧密连锁的单拷贝标记探针筛选
BAC文库以检验构建的 TAC文库是否具有很好的
代表性和实用性。现在发展起来的克隆池 PCR
( poo l PCR)的方法对混合池形式保存的文库筛选非
常方便有效。
3. 2
文库对基因组的覆盖率、插入片段大小及空载
率的鉴定
根据不同用途,对文库插入片段长度的要求有
很大的差别。库容也应根据研究的需要有所差异。
从文库中随机挑选一定量的 TAC克隆, 摇菌, 提取
质粒 DNA,酶切后,脉冲电泳检查插入片段的大小。
并根据数目计算空载率。
3. 3
细胞器污染程度的检测
细胞器 DNA的污染会降低文库的实际容载量,
并造成染色体步移向错误方向进行 [ 18 ]。因此, 一般
用线粒体和叶绿体的探针通过杂交的方法对文库进
行检测。
3. 4
TAC克隆经继代培养后的稳定性鉴定
挑选几个较大的 TAC克隆, 分别接种在培养基
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生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2006年增刊
上,连续继代培养后, 分别提取第 0代和第 100代
BAC克隆的质粒 DNA, 酶切后, 脉冲电泳检查 TAC
克隆中外源 DNA在继代培养中是否存在和发生突
变 [ 19]。
3. 5
TAC克隆在大肠杆菌菌株和农杆菌菌株的稳
定性鉴定
随机从文库中挑取几个大的克隆进行质粒的分
离。通过电转化的方法导入农杆菌株 EHA105中。
再从农杆菌转化子中重新分离, 再转化到大肠杆菌
DH10B中。限制性酶切分析这些质粒以鉴定其稳
定性。
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