全 文 ：RNA干扰技术抑制内源性绿色荧光蛋白的表达
陈维贤 黄爱龙 闫歌 唐霓 张娟 陈娟
(重庆医科大学病毒性肝炎研究所感染性疾病重点实验室,重庆 400016)
摘 要: 目的 建立稳定表达绿色荧光蛋白( GFP)的细胞株;构建短发夹 RNA( shRNA)表达质粒并观察其
对内源性 GFP的抑制作用。方法 转染 pEGFP-N1 至 HepG2 细胞, 利用 G418 筛选获得稳定表达 GFP 的细胞株
( H epG2. GFP ) ; 设计合成针对 GFP 基因的 siRNA 对应的 DNA 片段, 插入转录载体 pTZU6+ 1, 构建 shRNA 表达
载体 pSH GFP, 转染 H epG2. GFP ,荧光显微镜观察细胞荧光强度,以 w estern blot 检测 GFP蛋白水平,以 RT-PCR
检测 mRNA 水平。结果 利用 PCR 方法从 H epG2. GFP细胞基因组 DNA 中检测到 GFP基因; pSH GFP能够显著
抑制该细胞中 GFP的表达。结论 GFP 基因成功整合至 H epG2 细胞基因组中, pSH GFP 能够显著抑制内源性
GFP 的表达, 该系统能够用于 RNA 干扰机制等研究中。
关键词: RNA 干扰 绿色荧光蛋白 短发夹状 RNA
Inhibition of Intrinsic Expression of GFP by RNA Interferencing
Chen Weix ian Huang Ailong Yan Ge T ang Ni Zhang Juan Chen Juan
( Inst i tut e f or v i ral hep ati t is of chongqin g univ ersi ty of med ical sci ence , Chong qing 400016)
Abstract: Objectives T o const ruct a cell st rain expressing GFP stably and constr uct the plasmid containing
sho rt hair pin RNA of GFP to suppress the intrinsic expression of GFP . M et hods tr ansfected the HepG2 cells w ith
pEGFP-N1 and then screening w ith G418 to get a cell stra in( H epG2. GFP ) expr essing GFP stably; The plasmid o f
pSH GFP w as constr ucted by inser ting the r everse r epeated mo tif o f GFP int o pTZU6+ 1. T ransfected the H epG2.
GFP w ith pSH GFP and t hen the fluor escence was obser ved by fluor escent microscope and the pro tein and mRNA
level of GFP w as detected by w etern blot and RT-PCR, respectively. Results The GFP gene was detected in the ge-
nome DNA of H epG2. GFP by PCR; pSH GFP suppressed the intrinsic expr ession o f GFP significant ly. Conclusion
A cell str ain expr essing GFP stably w as constructed successfully and the expr ession of GFP can be suppressed by the
sho rt hair pin RNA efficiently.
Key words: RNA interferencing Green fluor escent protein Shor t hair pin RNA
RNA 干扰 ( RNA interferencing, RNAi)是短双链 RNA (即小干扰 RNA; small inter ferencing RNA,
siRNA)介导的对同源基因转录后水平的抑制作用,这种机制广泛存在于真菌、植物、果蝇、鱼类、蛙类以及哺
乳动物等生物种类中 [ 1, 2] ,是细胞发育基因水平的重要调节方式和宿主抵抗病毒感染的一种重要手段[ 3] ,也
成为功能基因组研究及基因治疗的重要工具。RNA干扰相关的应用性研究虽然引人注目,但其作用机制尚
仍未完全明了, 众多影响因素也未清楚,因此相关基础研究对该技术的应用有重要意义。
绿色荧光蛋白( GFP)是最早分离自水母 Aequorea Victo ria( Av) , 分子量为 27kDa 的胞浆蛋白。由于
GFP 对细胞无毒性,且利用荧光显微镜可以直接观察其在细胞中的表达,作为报告基因广泛应用于基因工
程实验中。本研究将绿色荧光蛋白的基因整合进 HepG2 细胞中, 得到稳定表达 GFP 的细胞株。并构建了
表达针对 GFP 的短发夹状 RNA ( small hairpin RNA, shRNA )的表达载体, 观察其对 GFP 表达的抑制作
收稿日期: 2005-08-10
基金项目:国家自然科学基金( 30400374)
作者简介:陈维贤( 1975- ) ,男(土家族) ,博士研究生。黄爱龙,教授,博士生导师
通讯地址:重庆市渝中区医学院路 16号 109信箱, 400016,联系电话: 023-68485232
生物技术通报
# 研究报告# BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 6期
用,从而建立起一个较为稳定而直观的 RNA干扰实验体系,为进行 RNA 干扰的机制研究奠定基础。
1 材料和方法
1. 1 材料
质粒 pEGFP-N1, pTZU 6+ 1和 pSHHCV 为重庆医科大学病毒性肝炎研究所保存并提供。高保真
DNA 多聚酶 py robest, T aq DNA 聚合酶, dNT P 及相应 buffer,限制性内切酶内切酶 Sal I 、XbaI 、HindⅢ、
EcoR I及相应 buffer购自 T akara 公司, 连接酶及 JM109菌株为 pr omega 公司提供。质粒小量抽提试剂
盒, PCR产物纯化及胶回收试剂盒为 omega产品。细胞转染用脂质体 Lipo fectamine为 inv itro gen公司产
品。HepG2细胞株为重庆医科大学病毒性肝炎研究所保存并提供。细胞培养用胎牛血清为 hyclone产品。
RNA 提取试剂盒, DN Ase Ⅰ( RNA free)及 RT-PCR试剂盒(一步法)为 Q iagen公司产品。兔抗 GFP 抗体
(一抗)为美国 BD公司产品; 羊抗 actin抗体(一抗) , HRP 标记的羊抗兔 IgG 和兔抗羊 IgG(二抗)购自北京
中山生物技术公司。化学发光显色试剂 SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substr ate Kit 购自
PIERCE公司。其余常用试剂均为本室自行配制。
1. 2 克隆构建
根据 siRNA 的设计原则 [ 3] ,合成针对cGFP编码区 126~ 144bp为靶向的 DNA 片段,设计 GFP sense:
5c-GCT GACCCT GAAGT TCAT C-3c和 GFP ant isense: 5c-GA TGAACTT CAGGGTCAGC-3c,茎环结构为
8个与 GFP 不互补的非同源碱基( gagtactg) ,末端终止子为 TT T TT ,在合成DNA的末端设计 Xho I和 Xba
I酶切位点,合成的 DNA片段如下:
5c-TCGAGGCT GACCCTGAAGTT CATCGAGT ACTGGATGAACT TCAGGGT CAGCTT T TT-3c
5cCT AGAAAAAGCT GACCCTGAAGTT CATCCAGTACT CGAT GAA CT TCAGGGT CAGCC-3c
在 genebank里用 BLAST 软件进行同源性检索,证实该 DNA 片段为 GFP 序列特异性。采用化学合成
方法合成单链寡核苷酸。取等量 100mmo l/ L 的 DNA 合成片段,在退火缓冲液( 100mmol/ L NaCl)中 95 e
加热 5m in,然后缓慢降至室温,乙醇沉淀法纯化,得到的双链 DNA 片段与用 Sal I和 Xba I双酶切的转录载
体 pT ZU6+ 1进行连接,转化大肠埃希菌 JM 109, Amp 抗性筛选,阳性克隆以酶切电泳鉴定,并进行序列测
定确定插入片段的正确性。该克隆命名为 pSHGFP。
1. 3 稳定表达 GFP 的细胞株的建立
1. 3. 1 细胞转染 选择生长状态良好的 HepG2细胞, 以 1 @ 105个细胞/孔接种 24孔细胞培养板, 待细胞
生长到 90%左右融合时,用 Life Technolog ies公司 Lipofectamine 阳离子脂质体转染试剂,将质粒 pEGFP-
N1转染细胞。转染时, 每孔脂质体用量为 2Ll, 质粒为 1Lg。
1. 3. 2 G418筛选阳性细胞克隆 转染后 24h将细胞传代至培养皿, 并换用含 500Lg/ m l G418的细胞培养
液继续培养。每两天换一次培养液,并每天利用荧光显微镜观察 GFP 表达情况。待 2~ 3 周正常细胞全部
死亡,而表达 GFP 的细胞形成肉眼可见的细胞团, 在荧光显微镜下挑取荧光表达较强的细胞,有限稀释接种
至 96孔板,使每孔接种单个细胞, 并继续用含 G418的细胞培养液培养。荧光显微镜下观察细胞荧光, 选择
荧光表达较强且均匀的孔,待细胞生长至较多时, 依次传代至 24孔板, 6孔板及 100m l培养瓶, 扩大培养后
液氮冻存。
1. 3. 3 PCR鉴定基因整合 酚氯仿法提取细胞基因组 DNA,以之为模板进行 PCR以确定 GFP 基因的存
在,以正常 HepG2细胞作对照。上游引物为 5c-GAT GGTA CCCTA TGGT GAGCAAGGGC-3c,下游引物为
5c-GA CAGT ACTGCTT GT ACAGCT CGT CCA-3c,产物约为 700pb。PCR 反应体系为 25Ll: PCR buffer
( w ith Mg ) 2. 5Ll, dNT P( 2. 5mM each) 2Ll, 上下游引物( 20LM)各1Ll,模板 DNA 1Lg, Taq聚合酶1U, DH 2
O补足25Ll。反应条件为: 94 e 5m in; 94 e 30sec, 57 e 30sec, 72 e 30sec,循环 35次后 72 e 保温 10min。扩增
产物采用含 EB的 1. 5%低熔点琼脂糖凝胶, 60V 电压电泳 1小时,凝胶成像仪观察并成像。
66 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 6期
1. 4 pSHGFP 对内源性 GFP 的干扰
1. 4. 1 细胞转染 将状态良好的整合 GFP 基因的细胞按 5 @ 105个细胞/孔接种 6 孔板, 待细胞生长到
90%左右融合时进行转染,每孔脂质体用量为 10Ll,质粒 pSHGFP 和对照质粒 pTZU 6+ 1, pSH-HCV 均分
别为 4Lg。
1. 4. 2 荧光显微镜直接观察细胞荧光表达 细胞转染后 1~ 5d持续在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的
表达情况,根据表达荧光的细胞的数量和强弱可以判断 GFP 的表达水平。
1. 4. 3 western blot检测 GFP 蛋白表达水平 细胞分别转染质粒 pSHGFP, pTZU 6+ 1,继续培养 4d 后收
集细胞。Western 杂交按《分子克隆第三版》实验操作指南进行,一抗稀释度为 1 B 400, 二抗稀释度为 1 B5
000, 以 act in的检测为内参照,磷酸盐缓冲液洗膜后, 加入化学发光反应试剂, 37bC 反应 5m in, 用化学发光
检测仪检测。
1. 4. 4 RT-PCR检测 GFP mRNA 水平 细胞分别转染质粒 pSHGFP 和 pT ZU6+ 1,继续培养 4d 后收集
细胞, 按试剂盒说明分别提取各组细胞的总 RNA, 并用 DnaseⅠ处理,操作按试剂说明书进行。RT-PCR检
测 GFP 基因的 mRNA时,以人 3c-磷酸甘油醛脱氢酶( hGA PDH)基因为内参。GFP 基因的上游引物为 5c-
GCAGCACGACT TCT TCAA-3c,下游引物为 5c-GTCCATGCCGAGAGTGAT-3c,扩增产物为 465bp( 240
~ 705bp)。hGAPDH 的上游引物为 5cGGAAGGT GAAGGTCGGAGT C 3c, 下游引物为 5cGACCACCT G-
GT GCT CAGT GT3c,扩增产物为 840bp。RT-PCR 反应体系如下: 5 @ Qiagen onestep RT-PCR Buffer 5Ll,
dNT P M ix 1Ll, 5 @ Q Solution 5Ll, GFP 基因和 hGAPDH 基因上下游引物均分别为 0. 6LM , RT-PCR En-
zyme M ix 1Ll, RNA 模板为 5Ll,以 Rnase free H2O 补足 25Ll。反应条件为: 50 e 30min; 95 e 15m in; 94 e
30sec, 57 e 30sec, 72 e 50sec,循环 35次后 72 e 保温 10min。扩增产物采用含 EB的 1. 5%低熔点琼脂糖凝
胶, 60V电压电泳 1小时,凝胶成像仪观察并成像。
2 结果
2. 1 pSHGFP 重组质粒的构建与鉴定
重组质粒 pSH GFP SalⅠ酶切位点丢失,但可以被 XbaⅠ酶切。而空载体可分别被 SalⅠ和 XbaⅠ酶切
图 1 PCR 方法检测整
合的 GFP基因
形成约3. 1kb的DNA片段。实验结果与预期相符,进一步用DNA测序方法证实重
组载体序列正确。
2. 2 稳定表达 GFP 的细胞株的鉴定
G418筛选的细胞株连续传代培养两月余,传代 30余次及冻存后再行复苏培养,细
胞绿色荧光的强度均未见减弱。以该细胞株基因组 DNA 为模板, PCR得到了 GFP 基
因特异性片段(如图 1)。由此可见, GFP基因已经成功地整合进细胞基因组。
2. 3 绿色荧光观察结果
细胞转染 pSH GFP 及对照质粒后继续培养, 并每天观察荧光表达情况。转染后
48h即可以看出转染 pSHGFP 的细胞比转染对照质粒的细胞荧光弱, 在转染后 96h
更为明显(如图 2)。而转染对照质粒 pTZU6+ 1与 pSHHCV 的细胞与未转染的细
胞荧光强度无明显差异。
2. 4 Western blot结果
图 3可见转染 pSHGFP 的细胞比转染 pT ZU6+ 1的细胞 GFP 条带明显减弱,
说明其 GFP 蛋白水平表达有显著降低。两个标本的内参对照 actin 蛋白条带亮度相近, 说明实验中两标本
除外转染质粒的不同而其它条件是基本一致的。
2. 5 RT-PCR结果
如图 4,转染pSHGFP 和pTZU6+ 1的细胞均扩增出两个特异的DNA片断, 电泳均见两条条 DNA 带。
672005年第 6期 陈维贤等: RNA 干扰技术抑制内源性绿色荧光蛋白的表达
图 2 转染不同质粒的细胞在转染后 96h的荧光
一条为约 800bp 的 hGAPDH 片断, 另一条为约
400bp的 GFP 片断。两个标本 hGAPDH 片断亮
度相近,而转染 pSHGFP 的标本 GFP 带明显弱于
对照组,证明 pSH GFP 特异地降低了 GFP mRNA
水平。
3 讨论
RNAi是生物体在进化上高度保守的基因组水
平的免疫监控机制,它通过一种 RNase III 内切酶
( Dicer 或其类似物)的作用,切割长双链 RNA 而产
生长约 19~ 26bp的短双链 RNA (即 siRNA) , siR-
NA 与细胞内多种酶类成分结合形成 RNA 诱导的
沉默复合物 ( RNA induced silencing complex,
RISC) , RISC在 siRNA 的指引下切割同源性 mR-
NA 并导致其降解,从而特异性地抑制目的基因的
表达。研究表明体外合成的 19~ 23bp的短 dsRNA
分子能够激活哺乳动物细胞内的 RNAi机制, 引起序
图 3 Western blot检测转染不同质
粒的细胞 GFP蛋白水平
列特异性的基因表达的下调[ 4]。目前 RNAi已成为功能基因组学研究的重
要手段,并在抗病毒和抗肿瘤的治疗等研究方面有较快的发展[ 5, 6]。
虽然 RNA i干扰技术的应用研究进展迅速,但其作用原理仍有许多不
明之处。细胞内 RNAi是一种精细的调节方式, 有着复杂的体系, 弄清这
些原理有着重大的理论与现实意义。作为一种基因表达调控的有效手段,
RNAi(通过 miRNA 方式)可以引起特定基因在特定时期与特定组织中表
达量的上调或下调, 从而保证细胞的正常发育和凋亡, 当这一机制受到影
响而失常时,就可能引起细胞功能异常及发育或凋亡的异常, 即导致疾病
产生或形成畸形与肿瘤[ 7, 8] 。RNAi作为一种抗病毒免疫防御手段危及了
病毒在细胞内的生存, 而许多病毒也在进化中获得了对抗该机制的能力。
图 4 RT-PCR 检测转染不同质粒的细胞
GFP mRNA水平
它们通过产生 RNAi抑制因子( RNAi suppressor) ,来抑制 RNAi 的
作用,从而增加自身的生存能力 [ 9~ 11]。这些 RNA i抑制因子同时可
能通过影响细胞正常的 RNAi作用,引起宿主细胞某些重要蛋白质
表达的异常,并导致细胞发育的异常或疾病的产生,这也可能成为病
毒导致肿瘤的机制之一[ 12, 13] 。
本研究选择 GFP 作为目标蛋白并将其整合进细胞基因组使其
稳定表达,是因为 GFP 可以在荧光显微镜下直接观察,使实验结果
直观可靠。而利用转录载体 pT ZU6+ 1构建的重组质粒 pSHGFP,
能在哺乳动物细胞中转录出针对 GFP 的短发夹状 RNA ( shRNA) ,
shRNA 在细胞内被 RNase III内切酶从茎环处剪切,产生 siRNA 发
挥 RNA 干扰的作用[ 14]。与对照组相比较,转染 pSH GFP 的细胞荧
光明显减弱, GFP 在蛋白水平及 mRNA 水平均明显降低, 证明本实
验构建的质粒 pSH GFP 可以显著地抑制 GFP 的表达。利用该体系可以进行 RNAi抑制因子的筛选,
(下转第 87页)
68 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 6期
Nested PCR和 sem-i nested PCR方法对大豆成品油(一级)的检测结果表明(表 2) , 20份申明原料为转
基因大豆的样品均没有阳性条带产生, 即未检测到转基因成分 DNA。同时, 本研究还对这些样品进行了三
级 PCR扩增,即利用 L1/ L2、L1/ L4、L3/ L4三对引物的一轮 PCR和二轮 sem-i nested PCR扩增, 在理论上
其灵敏度可达到 10~ 12 ng /Ll,结果均没有扩增得到特异性阳性条带,这表明, 大豆成品油(一级)中的转基
因成分 DNA 含量已极低,是否有更好的检测方法,有待进一步的研究。
相比普通 PCR而言, nested PCR和 sem-i nested PCR方法具有非常好的重复性和抗干扰性, 对反应体
系和模板 DNA 的要求均不是很苛刻。同时, nested PCR和 sem-i nested PCR具有很高的特异性,其结果一
般不需要再用其它方法检验[ 8] 。但是,由于 nested PCR和 sem-i nested PCR方法的高灵敏特性, 在实际检
测中,一定要规范操作,避免污染, 注意设置阴性对照和空白对照,防止假阳性结果的产生。
参 考 文 献
1 Lipp M, Brodmann P, Piet sch K, et al. Journ al OfAOAC Internat ional , 1999, 82( 4) : 923~ 929.
2 H ur st CD, Knight A Bruce IJ . Moleclar Breeding, 1999, 5: 579~ 586.
3 Pauli U, Liniger M Zimm ermann A. Z Lebensm U ntersForschA, 1998, 207: 264~ 267.
4 Tanzer A. Eppendorf A pplicat ionNotes, 2000, 6: 3~ 4.
5 Khan JA, S rivastava P, Singh SK. Cu rrent Science, 2004, 86( 11) : 1530~ 1533.
6 M ayer CL, Palmer C J. Applied and Environmental M icrobiology, 1996, 62( 6) : 2081~ 2085.
7 Van H oef AMA, Kok EJ, Bouw E, et al . Food Addit ives Contaminants, 1998, 15: 767~ 774.
8 M art in-Sanch ez J, Vis eras J, Adrother FJ, et al. Parasitol Res, 1999, 85: 243~ 245.
(上接第 68页)
并可以研究 RNA 干扰作用途径中的成分及影响因素。总之,利用 RNA 干扰机制干扰内源性 GFP 表达的
体系,为进一步研究 RNAi作用机制及其影响因素奠定了基础。
参 考 文 献
1 H annon GJ. Nature, 2002, 418: 244~ 251.
2 Donald K. Science, 2002, 298: 2283.
3 Gilt in L, Karelsk y S, Andin o R, et al. Natu re 2002, 418: 430~ 434.
4 E lbashir SM , H arb orth J , Lendeckel W , et al. Natu re, 2001, 411: 494~ 498.
5 唐霓,黄爱龙,张秉强,等.中华医学杂志, 2003, 83( 15) : 1309~ 1312.
6 闫歌,黄爱龙,蒲丹,等. 生物化学与生物物理进展, 2004, 31( 9) : 829~ 833.
7 Jam es CC, Victor A. Science, 2003, 301: 336~ 338.
8 M at thew NP, L ena E, Jan K, et al. Nature, 2004, 432: 226~ 230.
9 Vicki V, H erve V. S cien ce, 2001, 292( 22) : 2277~ 2280.
10 H ongw ei L, Wanxiang L, S houw ei D. Science, 2002, 296: 1319~ 1321.
11 Wanxian g L, H on gw ei L, Rui L, et al. Pr oc Nat l Acad Sci U SA , 2004, 101( 5) : 1350~ 1355.
12 Allison CM, Brenda JR, David B, et al . Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99( 23) : 15225~ 15233.
13 Dan iel S, At t ila M , Alessandra L, et al . T he EM BO Journal, 2002, 21( 12) : 3070~ 3080.
14 Sui G, Soohoo C, Af far EIB, et al. Proc Nat i Acad Sci, 2002, 99: 5515~ 5520.
872005年第 6期 闻伟刚等:大豆油中转基因成分的 Nested PCR和 Sem-i nested PCR检测方法研究