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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年增刊
植物类萜生物合成途径及关键酶的研究进展
马靓 丁鹏 杨广笑 何光源*
(华中科技大学 中英 HUST-RRes基因工程和基因组学联合实验室,武汉 430074 )
摘 要: 萜类化合物是植物中广泛存在的一类代谢产物,在植物的生长、发育过程中起着重要的作用。植物
中的萜类化合物有两条合成途径 :甲羟戊酸途径和 5-磷酸脱氧木酮糖 /2C-甲基 4-磷酸-4D-赤藓糖醇途径。这两条
途径中都存在一系列调控萜类化合物生成、结构和功能各异的酶, 其中关键酶的作用决定了下游萜类化合物的产
量。植物类萜生物合成途径的调控以及该途径中关键酶的研究已成为目前国内外生物学领域的一大热点。综述
了植物类萜生物合成途径和参与该途径的关键酶及其基因工程的研究进展, 并展望了其应用前景。
关键词: 萜类化合物 类萜生物合成途径 关键酶
Advances on the Plant Terpenoid Isoprenoid
B iosynthetic Pathway and Its Key Enzymes
M a L iang D ing Peng Yang Guangx iao H e Guangyuan*
(China-UK H UST-RRes Genetic E ngineer ing and Genom ics J oint Labora tory,
H uazhong Un ivers ity of Science and Technology , Wuhan 430074)
Abstrac:t Terpeno id a re a huge group of m etabolic products w ide ly ex isting in plan ts. They have play ed im po rtant
ro les dur ing the g row th o f plan ts. The biosyn thesis pathw ay s of terpeno id inc lude meva lonate pa thway and 1-deoxy-D-xy lu-
lose 5-phospha te /2C-me thy-l D-ery thr ito l 4-phosphate pa thway. Te rpeno id b iosynthetic pathw ay o f p lants are a lso contro lled
by a rang o f different enzym es, and the key enzym es determ ine the outpu ts of downstream produc ts. A t presen t, the re-
search of terpeno id biosynthetic pa thway and con tro l of key enzym es have becom e a hot po int in b io logy filed. Th is a rtic le
rev iew s terpeno id biosynthetic pa thway o f plants and key enzym es and the ir research foregroud.
Key words: Terpeno id Terpeno id biosynthetic pa thway Key enzym es
基金项目:国家 / 9730计划项目 ( 2002CB111302) ,国家自然科学基金 ( 30370807) , 湖北省自然科学基金重点项目课题 ( 2002AB088)
作者简介:马靓 ( 1982-) ,女,硕士研究生。研究方向:生化与分子生物学。Te:l 027-87792271
* 通讯作者:何光源, Te:l 027-87792271, E-m ai:l hegy@ hust. edu. cn
类萜生物合成途径 ( terpeno id b iosynthetic path-
w ay )是生物体内主要的代谢途径之一, 由该途径产
生的萜类化合物 ( terpenoid)数量庞大,目前已被鉴
别出 20 000种以上, 占天然产物总数的 1 /4 ~ 1 /
2
[ 1 ]。半数以上的萜类化合物是在植物中被发现
的,它对植物的生长、发育以及植物与生态环境之间
的联系起了极其重要的作用。此外, 萜类化合物还
广泛存在于细菌、真菌和昆虫中 [ 2]。
近年来,人们对萜类化合物及类萜生物合成途
径的研究不断深入,已从传统的化学合成转入分子
生物学领域。通过基因工程手段克隆关键酶基因并
进行序列与结构的分析, 选择性地调控类萜生物合
成途径,从总体上提高萜类合成前体和下游萜类产
物的表达量,进而从根本上改良植物自身的性状和
品质,增强植物抵抗病虫害、防御天敌的能力, 维系
植物与其他生物类群的互惠关系以及交感作用。某
些萜类化合物作为药物的合成前体或有效的药用成
分在工农业及医药生产上具有重要的经济价值。
2006年增刊 马靓等:植物类萜生物合成途径及关键酶的研究进展
1 植物中的萜类化合物
1. 1 萜类化合物的特点
萜类化合物是由异戊二烯为基本结构单元构建
的一类化合物, 也可称为类异戊二烯 ( isoprenoid) ,
包括所有的异戊二烯聚合物及其衍生物。萜类化合
物结构多样,包括直链、单环和多环等, 其中的烃类
称为萜烯,开链萜烯的分子组成符合通式 ( C5H 8 ) ( n
\ 2)。此外,它还以各种含氧衍生物 (如醇、醛、羧
酸、酮、酯类以及甙等 )的形式存在。萜类化合物的
分类主要以异戊二烯单元的数目为依据。C10家族
曾被认为是最小的萜类, 故命名为单萜 ( mono ter-
pene) , C5的异戊二烯则被称为半萜。根据此法可
命名倍半萜 ( sesquiterpene, C15 )、二萜 ( diterpene,
C20 )、三萜 ( triterpene, C30 )、四萜 ( te taterpene, C40 )及
多萜 ( po lyterpene, > C40 ) [ 3] (图 1)。
图 1 萜类化合物的结构式
1. 2 萜类化合物的功能
根据植物中萜类化合物的生理功能不同,可将
其分为初生代谢产物和次生代谢产物。
初生代谢产物的萜类化合物数量较少, 主要包
括三萜、四萜及甾醇等,如类胡萝卜素、叶绿素、生长
调节因子、多聚萜醇、醌类和蛋白质等 [ 4]。此类化
合物是植物生长、发育所不可缺少的,它能保持细胞
膜的完整性,联系特定细胞膜系统之间的相互作用。
次生代谢产物的萜类化合物数量极大, 主要为
单萜、倍半萜和二萜。它们虽然不是植物生长、发育
所必需的化合物,但在调节植物与生态环境之间的
关系上发挥着重要的作用 [ 5]。单萜多具较强的香
气和生物活性,常用作芳香剂、矫味剂和皮肤刺激剂
等;倍半萜多具有挥发性, 作为植物保护素可增强植
物自身的抗性,如青蒿素; 某些二萜具有重要的药理
活性, 如紫杉醇等。
另外,还有相当数量的萜类化合物 (如油、树
脂、腊质等 )既可作为重要的再生能源使用, 也是一
系列溶剂、调味料、芳香剂和衣料等商品合成的原
料,广泛应用于工农业生产。
2 植物的类萜生物合成途径
类萜生物合成途径也可称为类异戊二烯生物合
成途径 ( isopreno id b iosynthesis pathw ay) , 由甲羟戊
酸途径 ( meva lonate pathw ay, MVA pa thw ay)和 5-磷
酸脱氧木酮糖 /2C-甲基 4-磷酸-4D-赤藓糖醇途径
( 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate /2C-methy-l D-eryth-
rito l 4-phosphate pathw ay, DOXP /MEP pathw ay )组
成。这 2条途径的主要差别在于萜类合成的前体异
戊烯焦磷酸 ( isopenteny lallyl d iphosphate, IPP)及其
异构物二甲丙烯焦磷酸 ( d imethy lally l d iphosphate,
DMAPP)的合成机制、形成的代谢终产物以及存在
于植物细胞中的位置不同。
2. 1 MVA途径
MVA途径长期以来都被认为是萜类化合物生
物合成的惟一途径。它由 Conrad B loch和 Feodor
Lynen于 1958年首先在动物和酵母中发现, 主要存
在于细胞质中,又可称为细胞质途径 ( cy toso lic path-
w ay)
[ 6]。通过该途径形成了植物中的倍半萜、三萜
和甾醇等。
在 MVA途径 (图 2)中,先由 3分子乙酰辅酶 A
( acety-l coenzyme A, CoA )缩合成 3-羟基-3-甲基戊
二酰辅酶 A ( 3-hydroxy-3-methy lg lutary-lCoA, HMG-
CoA) ,该反应在 Fe2+和质体醌 ( qu inone)的辅助下
由乙酰辅酶 A酰基转移酶 ( acety-l CoA acety ltrans-
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ferase, AACT )和 HMG-CoA 合成酶 ( 3-hydroxy-3-
methylg lutary-l CoA synthase, HMGS )共同催化完
成 [ 7] ; 随后, HMG-CoA还原酶 ( 3-hydroxy-3-m ethy-l
glutary-lCoA reductase, HMGR )催化 HMG-CoA不可
逆地形成具有 6个碳原子的中间体甲羟戊酸 ( meva-
lonate, MVA ), NADPH为该反应的供氢体; 在 ATP
和二价金属离子的参与下, 甲羟戊酸激酶 ( meva-l
onate k inase, MK )和磷酸甲羟戊酸激酶 ( phosphom-
eva lonate kinase, M PK)将 MVA磷酸化, 形成 MVAP
和 MVAPP;最后, MVAPP在焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶
( py rophosphomeva lona te decarboxy lase, MDC)的作用
下脱羧形成 IPP[ 8]。
图 2 植物类萜生物合成途径及相关酶 [ 10~ 12]
2. 2 DOXP/MEP途径
1993年, Rohmer等首次在真核细菌中发现了
一条新的、不依赖甲羟戊酸的 IPP合成途径。由于
5-磷酸脱氧木酮糖 ( 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate,
DOXP)和 2C-甲基 4-磷酸-4D-赤藓糖醇 ( 2C-methy-l
D-erythrito l 4-phosphate, MEP)是该途径的主要合成
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2006年增刊 马靓等:植物类萜生物合成途径及关键酶的研究进展
前体。因此,称为 DOXP /MEP途径 [ 9 ~ 10 ] (图 2)。它
存在于植物、大多数真核细菌和一些寄生虫中 [ 11 ] ,
且在质体中进行, 又可称为质体途径 ( plastid path-
w ay )
[ 9]。经该途径可形成植物中的单萜、二萜和四
萜。
DOXP /MEP途径的第一步反应为 3-磷酸甘油
醛 ( D-g lyceraldehyde 3-phosphate, GA-3P)和丙酮酸
( pyruvate)在 5-磷酸脱氧木酮糖合成酶 ( 1-deoxy-D-
xy lu lose 5-phosphate synthase, DXS)的催化下缩合形
成 DOXP。5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶 ( 1-deoxy-
D-xy lu lose-5-phosphate-reducto isomerase, DXR )催化
DOXP发生分子内重排和还原反应生成 MEP。随
后, M EP 在 CMS ( 4-d iphosphocy tidy-l 2C-m ethy-lD-e-
rythritol 4-phosphate synthase, 4-磷酸-2C-甲基赤藓
糖醇 4-胞苷焦磷酸合成酶 )、CMK ( 4-diphosphocyt-i
dy-l 2C-methy-lD-erythrito l kinase, 2C-甲基赤藓糖醇
4-胞苷焦磷酸激酶 )、MCS( 2C-M ethy-lD-erythrito l 2,
4-d iphosphate synthase, 2C-甲基赤藓糖醇-2, 4-焦磷
酸 合 成 酶、HDS ( 1-Hydroxy-2-methy-l bu teny l 4-
diphosphate synthase, 1-羟基-2-甲基-2-丁烯-4-焦磷
酸合成酶 ) 及 IDS ( IPP /DMAPP synthase, IPP /
DMAPP合成酶 )等一系列酶的催化下经磷酸化、环
化等作用最终形成 IPP和 DMAPP[ 11, 12]。
在以上两种途径中, IPP是合成萜类化合物的
前体。它自身不能离子化, 需要 IPP异构酶 ( IPP
isom erase, IPI)和二价金属离子将其转化为具有活
性的异构体 DMAPP[ 13]。DMAPP可直接去磷酸化
形成最简单的异戊二烯。在异戊烯转移酶 ( preny-l
transferase, PTS )的催化下, IPP和 DMAPP以 /头-
尾 0或 /头-头 0相接的方式缩合成香叶基焦磷酸
( gerany l pyrophosphate, GPP), GPP再与第二个、第
三个 IPP缩合成法呢基焦磷酸 ( farnesy l pyrophos-
phate, FPP)和香叶基香叶基焦磷酸 ( gerany lgeranyl
pyrophosphate, GGPP)。 GPP、FPP和 GGPP这 3种
中间体分别由相应的萜类合成酶 ( terpene synthase,
TPS)催化形成高级的萜类化合物 [ 14]。
MVA途径和 DOXP /MEP途径虽然存在于植物
细胞内的不同位置,但其分隔并不是绝对独立的,其
中共有的少量代谢物可以在质体膜上相互交换 [ 15 ]。
因此, 质体中由 DOXP /MEP途径形成的 1-脱氧木酮
糖可以进入细胞质,形成部分甾醇分子;而少量来自
细胞质中 MVA途径的产物也可以进入质体, 形成
部分单萜和二萜 [ 16]。
3 植物类萜生物合成途径中的关键酶及基
因工程
萜类化合物的合成过程可分为 3个阶段, 即中
间体的生成、萜类化合物的合成和最后的修饰 [ 17]。
参与植物类萜生物合成途径的酶种类多样, 可分为
以下 3类: ①Ⅰ类酶是催化 IPP和 DMAPP生成的
酶,如 HMGR、DXS和 DXR等;②Ⅱ类酶是催化 IPP
和 DMAPP形成各种分子量不同、形式各异的中间
体或萜类终产物的酶, 如异戊烯转移酶和萜类合成
酶等;③Ⅲ类酶则是通过对萜类终产物进行复杂的
结构修饰 (如羟基化、甲基化、异构化、脱甲基化、加
成和还原反应 ) , 使其最终成为数目众多的天然产
物,如细胞色素 P450羟化酶和八氢番茄红素脱氢酶
等。
类萜生物合成途径中的关键酶决定了下游萜类
产物合成与积累的量, 这些酶一般位于途径的分支
点或产物合成的下游, 催化萜类合成前体和各种中
间体的形成。通过调控这些关键酶的表达活性, 可
以提高植物中相关萜类化合物的产量。目前, 相关
的研究主要集中在 I类酶和 II类酶上。
3. 1 Ⅰ类酶
3. 1. 1 HMGR 在 MVA途径中, HMGR是第一个
重要的限速酶, 也是 MVA途径的重要调控点。它
催化 HMG-CoA不可逆地生成 MVA。近年来, 很多
植物中编码 HMGR的基因家族不断被发现,如拟南
芥、番茄和马铃薯 [ 18]等。
拟南芥基因组中存在两个编码 HMGR的基因
hmg 1和 hmg 2。hmg1在拟南芥的所有组织中表达,
而 hmg 2只特异性地在花和分生组织中表达。 Suzu-
kiM等 [ 19]在研究 hmg基因的两种突变体时发现,
hmg 2突变体与非突变体在正常的生长条件下无明
显区别。而 hmg 1突变体中很多基因的表达受到了
抑制,出现矮化、过早衰老和雄性不育等异常症状,
与衰老相关的标记基因 SAG 12也较早地表达。将
野生型植株用外源的甾醇合成抑制剂处理后, 出现
了与 hmg1突变体相似的异常特性, 加入鲨烯后又
恢复正常。这些现象表明, hmg 1在甾醇和 /或三萜
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的合成中起重要的作用,参与植物细胞的延长、衰老
和增加。
一些特殊的抑制剂可以用来分析 HMGR的生
理功能。N arita 和 G ruissem [ 20] 发现番茄果实经
M ev inolin处理后, 发育受到明显地抑制, 加入外源
MVA后又恢复正常;果实中类胡萝卜素的积累并不
受 Mev ino lin的抑制。可以推测类胡萝卜素与甾醇
合成的调节是相互独立的过程, 且 HMGR的活性只
在甾醇的合成中受到抑制。
3. 1. 2 DXS DXS是 DOXP /MEP途径中重要的限
速酶之一,它催化丙酮酸和 3-磷酸甘油醛缩合生成
DOXP,进而形成类胡萝卜素、质体醌及叶绿醇
等 [ 21]。
DXS的催化活性高达 300 ~ 500Lmo l mg- 1
m in
- 1 [ 11]
,其催化反应的机制类似于 /乒乓球模型0,
被称为 /乒乓球机制 0 ( a ping-pong m echan ism )。在
此反应中, DXS先与丙酮酸结合, 释放出 CO2;随后
3-磷酸甘油醛与 DXS结合, 释放出 5-磷酸脱氧木酮
糖 [ 22]。该过程需要 Mg2+和硫胺二磷酸的参与。另
外,其他糖类的磷酸盐、短链醛类及羟基丙酮酸等也
可以作为 DXS的反应底物 [ 23 ]。DXS存在于多种植
物和微生物的叶绿体中 [ 24] ,其氨基末端带有质体导
向序列,另外还具有一些高保守性的重要功能区。
番茄果实的发育是研究 MEP途径调控机制的
模式系统。Lo is LM等 [ 24 ]克隆了番茄 DXS的 cDNA
, 发现 DXS在 mRNA水平上受不同发育信号及器官
特异性的调控,与番茄果实中类胡萝卜素的积累具
有强相关性。E stevez等 [ 25]通过在拟南芥中超表达
或低表达编码 DXS的单拷贝基因 CLA 1, 发现转基
因植株中的叶绿素、生育酚、类胡萝卜素、脱落酸及
赤霉素的含量都发生了改变。Matthhew s E等 [ 26]将
编码 DXS和类胡萝卜素合成酶的基因共同转入大
肠杆菌中超表达, 导致 DXS大量合成和类胡萝卜
素、番茄红素或玉米黄质等下游产物增加,其中类胡
萝卜素的含量提高了 10. 8倍。
3. 1. 3 DXR DXR催化 DOXP的直链碳骨架发生
分子内重排, 转化为 MEP。DXR活性较低, 为 12
Lmo lmg
- 1
m in
- 1 [ 11 ]
,酶促反应需要 Mg2+和 Mn2+的
参与; 其催化的反应可逆, 是 DOXP/MEP途径中 /碳
流 0 ( carbon flow )的分支点,也是调控萜类化合物合
成的有效靶点。自 DXR首次从大肠杆菌中分离 [ 28]
以后,一些细菌、原生动物和植物的 DXR也相继被
发现。
Carretero-Pau let L等 [ 28]分离了拟南芥 DXR的
全长 cDNA,该基因为单拷贝, 分子量约 52; gus基
因的瞬时表达证实 DXR在拟南芥的发育过程中具
有重要的调节作用,局部免疫分析显示 DXR也存在
于叶绿体中。DXR氨基末端的质体导向序列是富
含 Pro的高保守区域 (包含 57~ 80个残基 ), 对保持
DXR活性或稳定性起重要作用。Mahmoud和 Cro-
teau
[ 29]将编码 DXR的基因导入胡椒薄荷 (M entha
p ip erita )基因组,发现 DXR的活性提高了 24倍, 叶
片中精油的含量提高了 50%, 其中单萜的相对含量
和植株表型与正常植株并无区别,说明单萜的合成
前体 IPP并非全部来自 DOXP /MEP途径; 一些转基
因植株中检测不到 DXR的转录本和酶活性, 显示外
源和内源的 DXR基因产生了共抑制。另外, 为了去
除精油中的薄荷呋喃 ( menthofuran) ,将编码薄荷呋
喃合成酶 (M FS)的反义基因转入胡椒薄荷, 发现转
基因沉默植株中薄荷呋喃的含量比野生型植株低
35% ~ 55% ,而薄荷醇的含量则较高。
3. 2 Ⅱ类酶
3. 2. 1 异戊烯转移酶 异戊烯转移酶催化 IPP、
DMAPP、GPP或 FPP头尾相接,使得 C5碳链不断加
长而形成具有 C5倍数的中间体, 进而生成各种萜类
产物。根据中间体的不同, 又可分为 GPP合成酶
( GPP syn thase, GPPS )、FPP合成酶 ( FPP synthase,
FPPS)和 GGPP合成酶 ( GGPP synthase, GGPPS)。
研究证明,动物、植物、真菌和细菌中的异戊烯转移
酶都具有 5个高保守性的区域, 原核和真核生物的
异戊烯转移酶可能起源于共同的祖先 [ 26]。
3121111 GPPS GPPS催化 1分子的 IPP 与
DMAPP形成 GPP。它仅存在于少数合成单萜的植
物组织中,难以分离纯化 [ 30]。以 GPP为 C10骨架合
成的单萜在植物的自身防御和交感作用中起重要作
用。
绝大多数 GPPS都是同型二聚体 ( homod imer-
ic)。 Bouv ier等 [ 31]从拟南芥中克隆了 GPPS的 cD-
NA, 免疫反应 ( immunohistolog ical)分析证明其不仅
存在于叶绿体内,还存在于不含叶绿素的分泌腺细
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2006年增刊 马靓等:植物类萜生物合成途径及关键酶的研究进展
胞中; 底物结合位点包含 / DDXXD0和 / FQXXD-
DXD0 2个区域。 Burke等 [ 32]第一次从胡椒薄荷
(M entha p iperita)中分离出异型二聚体 ( heterodim er-
ic )的 GPPS,该蛋白与同型二聚体相比具有不同的
特征。它由 2个亚基组成, 其中大亚基 ( GPPS.
LSU )的同源性较高, 包含 2个高保守性的、富含 Asp
的基元作为底物的结合位点, 而小亚基 ( GPPS.
SSU )却无此结构; 2个亚基在彼此独立的情况下会
导致接触失活,共表达时却可显示催化活性。Doro-
thea等 [ 30 ]将 Antirrh inum majus和 C larkia brew eri中
GPPS的 cDNA在大肠杆菌中表达后均未检测到酶
活性, 当它们分别与胡椒薄荷 GPPS的大亚基共表
达时却显示出了酶活性; 研究还发现 A. majus中
GPPS的小亚基在调控 GPP和单萜的形成中发挥了
关键的作用,大亚基却无此功能。
L i等 [ 33]发现 GPPS可能具有质体和细胞质的
双重靶向性, 可以推断质体和细胞质中的 IPP或
GPP发生了交换。这一发现与以前的报道中认为
GPPS只专一性地存在于质体或细胞质中的观点是
相悖的,为重新定位单萜的合成位置提供了新思路。
3121112 FPPS FPPS 催化 2分子的 IPP 与
DMAPP缩合生成 FPP。 FPP不仅为多种初生代谢
产物 (如甾醇、多萜醇和泛醌等 )提供 C15骨架, 还能
在倍半萜合成酶的作用下生成倍半萜衍生物 (如植
保素等 ) [ 6]。
植物的 FPPS存在于细胞溶质、线粒体、过氧化
物酶体和叶绿体中 [ 34]。自 Lynen等在 1959年首次
发现 FPPS后, 多种编码该酶的基因被相继克隆,如
拟南芥、胡椒薄荷、玉米、青蒿、棉花和水稻等。这些
FPPS都为同型二聚体,具有 7个保守性的结构域Ⅰ
~Ⅶ; 酶与底物的结合位点都由 2个富含 A sp的基
元 / FARM ( f irst A sp-rich motif) 0和 / SARM ( second
A sp-rich motif) 0组成。 / FARM 0位于Ⅱ区, 具有高
保守性的 / DDXX ( XX ) D0序列, 是链长决定 ( chain
leng th de term inat ion , CLD)区; / SARM 0位于Ⅵ区,包
含序列 / DDXXD0。这两个基元中的 A sp和 A rg残
基对 FPPS的活性起着至关重要的作用 [ 35~ 36 ] ,位于
/ FARM 0之前的第四、第五个氨基酸残基则决定了
FPPS的作用类型和产物的特异性。在白羽扇豆、拟
南芥、银胶菊、水稻和艾草中至少发现了 2种 FPPS
的同工酶,它们在植物应对各种环境变化和抵御动
物、病原体的袭击上起重要作用。
陈大华等 [ 37]将棉花 FPPS的 cDNA转入青蒿
中,发现转基因发根系植株 F-26和 F-61中倍半萜
内酯青蒿素的含量约为对照的 5倍和 2~ 3倍,证实
FPPS对青蒿中倍半萜的合成有明显的调控作用。
刘长军等 [ 38] 分离了亚洲棉 ( Gossyp ium arboretum
L. ) FPPS的 cDNA, 该基因全长 1 280bp, 编码 342
个氨基酸, 与拟南芥和青蒿的 FPPS相比各具有
7819%和 80. 7%的同源性。通过分析该基因在 /苏
棉 6号0 (G. hirsu tum L. cv. / Sum ian-60 )发育过程
中的表达特征, 发现随着 FPPS的转录水平迅速增
高,棉酚等倍半萜物质在种子内大量积累,可以推测
FPPS参与棉酚等倍半萜物质合成的调控。 Sanm iya
等 [ 39]从分离了水稻秧苗中 FPPS的全长 cDNA,
Southern b lo t显示该基因可能为单拷贝, RNA blot证
实在蓝光照射下该基因的表达水平有所提高。
3121113 GGPPS GGPPS 催化 3分子 IPP 与
DMAPP形成 GGPP,为二萜、类胡萝卜素、类维生素
A及叶绿素侧链等的形成提供 C20骨架。植物的
GGPPS存在于质体、线粒体和细胞溶质中 [ 40]。
Kuntz等 [ 41~ 42]、Scoln ik 和 Bartley[ 43] 最早从辣椒
( Cap sicum annuum )和拟南芥 (Arab idopsis thaliana )
中克隆出编码 GGPPS的基因。
S itth ithawo rn等 [ 44] 从 Scoparia dulcis和 Croton
sublyratus中克隆了 GGPPS的 cDNA,它们与真核来
源的基因相比具有 60% ~ 70%的同源性; 都含有 5
个高保守性的区域Ⅰ ~ Ⅴ, / FARM 0和 / SARM 0分
别位于Ⅱ和Ⅴ中;氨基末端包含 10个氨基酸的叶绿
体导向序列。 Zhu等 [ 45]从拟南芥 (A rabidop sis Thali-
ana )的基因组 DNA中分离了 GGPPS基因家族中的
新成员 ggpp s6,它专一性地存在于线粒体中,与同家
族的其他基因相比具有 34. 0% ~ 57. 7%的同源性。
Surang等 [ 46]克隆了 Coleus forskohlii B riq中 GGPPS
的全长 cDNA, 其氨基末端带有叶绿体导向序列, 主
要在叶片中表达, 茎和根中的酶活性较弱。遗传互
补分析显示该基因具有与大肠杆菌类胡萝卜素合成
基因 crtE类似的功能。
3. 2. 2 萜类合成酶 萜类合成酶是合成萜类化合
物的关键酶, 以固定的比率生成复杂的萜类产
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物 [ 47]。它主要包括单萜合成酶 ( monoterpene syn-
thase)、倍半萜合成酶 ( sesqu iterpene syn thase )和二
萜合成酶 ( d iterpene synthase)。除直链的多聚萜类
(如橡胶 )外, 大多数萜类化合物都具有环状结构,
因此这类酶又称为萜类环化酶 ( terpene cyclase)。
3121211 植物萜类合成酶的分子克隆 20世纪 70
年代初,一些植物和微生物的萜类合成酶已被部分
或全部分离纯化; 1992年, 植物萜类合成酶基因的
克隆始有报道。至今已从近 10种植物中克隆了 30
多种萜类合成酶的 cDNA [ 12, 48] , 其中大多数参与植
物的次生代谢。
通过靶向克隆技术已发现烟草 (N icotiana taba-
cum L )、鼠尾草 ( Salvia off icinalis )、冷杉 ( conifer
Abies grand is)等多种植物中都存在复杂的萜类合成
酶基因家族。Aubourg等 [ 14]从拟南芥中发现了 1个
至今为止数目最大、种类最多的萜类合成酶基因家
族,可分为 5个亚科, 包含 40个萜类合成酶 ( A -t
TPS)基因。这些基因分布在拟南芥的 5条染色体
上,其中 30个基因编码与次生代谢相关的萜类合成
酶,它们的结构、序列和系统发生的位置 ( phy loge-
netic p lacem ent)都很接近;另外,该家族中还发现了
2个与初生代谢相关的基因和 8个无活性的假基因
( pseudogenes)。一些编码 A tTPS和 A tGGPPS的基
因相邻成簇排列,催化类萜生物合成途径中连续的
相关反应。
植物萜类合成酶基因的表达和调控具有种属、
组织、细胞和时间的特异性,受限于某一特定的发育
阶段, 或仅发生在瞬时性的防御反应中。大多数萜
类合成酶基因的克隆均采用富集某种萜类产物的材
料来分离 mRNA,如烟草 [ 49]、棉花 [ 50]、莨菪 [ 51 ]等植
物的倍半萜合成酶基因和大冷杉 (G rand f ir ) [ 47]的
单萜合成酶基因家族等。另外, 当杂交探针不易获
得的情况下,从高富集的组织特异性 cDNA文库中
随机克隆萜类合成酶基因也是一种有用的方法 [ 52]。
目前,植物萜类合成酶基因的克隆策略主要有
以下 3种:①基于酶纯化的反向基因克隆方法:通过
分离纯化蛋白质,测定氨基酸序列信息,再合成与其
相对应的核苷酸序列以制备核苷酸探针, 筛选 cD-
NA文库,分离克隆酶基因。如烟草表-马兜铃烯合
成酶 ( ep-i aristolochene synthase) [ 49]基因等。②基于
序列相似性的 PCR方法: 根据萜类合成酶的高保守
性序列设计简并引物,经 PCR扩增得到相关酶的特
异性探针,筛选 cDNA文库,分离克隆酶基因。该方
法被广泛应用于各种植物萜类合成酶基因的克隆,
如普通鼠尾草 ( common sage )的单萜合成酶 [ 53 ]的基
因。③诱变技术:适用于初生代谢途径中单拷贝基
因的克隆,如拟南芥 [ 54 ]和玉米 [ 55]的 ( - )-CPP合成
酶基因。
3121212 植物萜类合成酶的特征 低分子量的萜
类 (如异戊二烯、单萜、倍半萜和二萜 )合成酶具有
高度同源性,可能起源于同一个单基因祖先 [ 6]。萜
类合成酶家族成员众多, 可分为 TPS-a~ TPS-f 6个
亚科;同一亚科的萜类合成酶在氨基酸序列和功能
上至少具有 40%的同源性, 但合成的萜类产物差异
极大。次生代谢相关的萜类合成酶结构相似, 功能
却复杂多样;大多数由多拷贝基因编码,耐受功能性
突变,从而保证了萜类产物的多样性,也有益于对植
物与环境的交感作用。初生代谢相关的萜类合成酶
则由单拷贝基因编码,几乎不能耐受功能性突变,因
此生成的产物很不稳定。具有不同催化活性的萜类
合成酶拥有彼此独立的进化过程 [ 14]。
在倍半萜合成酶和二萜合成酶的基因中, 内含
子和外显子的位置相当保守。植物萜类合成酶特定
的外显子功能域均有 1个富含 A sp残基的高保守性
基元 / DDXXD0, 被认为是酶与底物的结合位点, 也
是酶活性中心的组成部分。在极少数萜类合成酶
中,该基元被另一个富含 Asp残基但功能迥异的基
元 / DXDD0取代,或 2种基元同时存在。萜类合成
酶的活性位点都具有相同的三级结构,即由短的 A-
螺旋连接转角 ( turns)和环 ( loops)等形成 1个 2层
A-桶 ( tw o- layer A-barrel)的结构。它的定向突变可
成为研究保守氨基酸功能的有效方法。酶的活性中
心是羧基末端结构域中的疏水性口袋, 由 A-螺旋组
成;其富含芳香基团且呈疏水性,有利于底物烃基部
分的进入和结合。该结构包括 2个 Mg2+结合位点
和 1个焦磷酸基团结合位点 [ 48]。活性中心的化学
修饰研究表明, A sp、H is和 Cys残基的存在对保持
酶的催化活性十分必要。除 ( - )-CPP ( copaly l
d iphosphate)合成酶外,大多数萜类合成酶在催化反
应中都需要二价金属离子 ( M g2+ 或 Mn2+ )的辅
28
2006年增刊 马靓等:植物类萜生物合成途径及关键酶的研究进展
助 [ 8]。
单萜合成酶和二萜合成酶对底物要求严格。单
萜合成酶对 FPP 或 GGPP的分子结构存在排阻效
应 ( size exclusion), 只能接受 GPP为底物;二萜合成
酶的活性位点结构精准, 除 GGPP外不能接受 GPP
或 FPP为底物。一些倍半萜合成酶并没有严格的
底物特异性,如形成石蜡柠檬油精 ( ole fin limonene)
时可接受 GPP为底物,但表达效率很低。这可能是
由于 GPP主要存在于质体中,细胞质中的倍半萜合
成酶不能直接与其接触, 因而缺乏正确识别这种外
来底物的进化压力 [ 48]。
序列分析表明,萜类合成酶通常由 550~ 850个
氨基酸组成,分子量为 50~ 100; 单萜合成酶一般包
括 600~ 650个氨基酸, 比倍半萜合成酶多 50~ 70
个,可能与这 2种酶在细胞内存在的位置不同有关;
而大多数二萜合成酶由于内部多了 1个插入片断,
比单萜合成酶多约 210个氨基酸。在所有的二萜合
成酶和部分倍半萜合成酶、单萜合成酶中,该插入片
断均位于氨基末端的活性结构域, 序列和位置相当
保守; 不直接起催化作用, 可能与酶的环化机理和稳
定性、靶向性及调控有关 [ 56]。另外, 单萜合成酶和
二萜合成酶氨基末端的序列与倍半萜合成酶均存在
较大差异,该序列可能是蛋白质合成后向质体内运
输的信号 [ 12]。
3121213 异戊烯转移酶与萜类合成酶的异同 异
戊烯转移酶与萜类合成酶在三级结构和催化反应机
制上存在相似之处。它们都是可溶的酸性蛋白,分
子量约为 70 ~ 80; 酶与底物的结合位点都有富含
A sp残基的 / DDXXD0基元, 能有效识别底物分子;
催化反应都需要二价金属离子 (M g2+或 Mn2+ )的参
与;催化过程中碳-碳键的形成是通过亲电子的加成
反应完成的,这种生化上罕见的反应机制存在于萜
类化合物合成的数种反应中。由于都保持了这种碳
正离子中间体的形成机制,因此认为它们在进化上
具有共同的起源 [ 8]。
萜类合成酶因其功能上的复杂性和多样性,最
终与保守的异戊烯转移酶分离。异戊烯转移酶催化
2个底物分子之间碳链的连接,而萜类合成酶催化 1
个底物分子内部的环化反应。不同的异戊烯转移酶
催化底物的区别在于异戊二烯基的基团长度,对底
物的立体结构无要求, 催化过程中酶的立体化学结
构或产生的萜类多聚体的长度都很少变化; 萜类合
成酶则对底物的立体结构具有专一性,要求催化反
应的中间产物具有特异性 [ 6]。
4 小结与展望
目前,植物类萜生物合成途径的基本框架已逐
步明确,利用基因工程手段对该途径的调控也取得
了预期的效果,但同时还存在一些问题,如关键酶基
因的鉴定和克隆涉及的物种范围较窄,多见于模式
植物的研究,分离的基因数目较少;某些关键酶的作
用还存在争议,萜类产物合成的限速步骤需进一步
明确;萜类合成的前体 IPP具有其独立的限速与调
控步骤,要精确调控各下游产物形成的分支途径还
很困难;类萜生物合成途径中的相关酶含量少、活性
低,给萜类化合物的化学检测、相关酶的提纯及活性
测定的工作带来很大困难。
因此,需要开发更为先进的痕量分析手段 (如
相关酶的含量、活性和结构的分析 ) , 重视生物测
试,鉴定出更多对人类有益的萜类化合物,并为其功
能提供更直接的依据。另外, DOXP /MEP途径不存
在于人体中,因此可利用该途径建立新药筛选模型;
通过设计和筛选底物竞争性类似物和酶的抑制剂,
可寻找对人体代谢无影响的特异性抑菌药物, 为新
药及相关产品的研究开辟新道路。
未来的研究方向应该是进一步补充和完善植物
类萜生物合成途径及其网络, 深入研究 MVA、
DOXP /MEP途径的关联和交叉点; 开展关键酶及其
基因的分离、克隆和表达特征的分析;明确相关酶基
因表达的组织和发育的调控机制及对基因起时空调
控作用的各种顺式和反式作用因子,以实现对代谢
途径中调控因子的合理应用和基因的协同转化; 分
离具有时空特异性表达功能的启动子,实现目的成
分在特定组织和细胞中的定向和高效表达; 通过基
因工程技术实现目的化合物的工业化高效生产, 为
萜类化合物的开发和利用提供更为诱人的前景。
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