全 文 ：一种简单实用的猪颗粒冻精制作技术
索永善 李跃民
(重庆市牧草与草食家畜重点实验室,重庆 400716)
摘 要: 本实验以年龄在 2. 5 岁左右的长白种公猪的精液为材料,在比较了常用的 Ñ号、Ò号、Ó号猪精液
冷冻稀释液和Ñ号、Ò号解冻液及冷冻 ) ) ) 解冻程序对猪精液的冷冻效果后,依据解冻后精子的活力、质膜完整性
等指标,发现: 1、Ò号冷冻稀释液的稀释效果(精子活力 42. 5? 5. 2 精子弯尾率 44. 7 ? 3. 5)和Ò号解冻液的解冻效
果(精子活力 43. 8? 2. 6 精子弯尾率 36. 2 ? 4. 3)明显较好; 2、根据制作经验总结,发现了一种与以往资料上介绍的
完全不同的猪精液冷冻颗粒制作方法,从而筛选出了一种简单实用的猪颗粒冻精制作技术。
关键词: 猪 颗粒冻精 制作技术
A simple and Practicable Technique of Manufacturing
Swine Granule Frozen Semen
Suo Yongshan Li Yuemin
( Chon gqing K ey L aborator y of Forag e & H erbiv ore , Ch ong qing 400716)
Abstract: The sperms o f 2. 5 year s. old Landrace boar a re used as mater ial in this experiment. A fter com pa-
r ing the affects of Ñ , Ò , Ó boar sperm freezing diluting so lution, and Ñ , Ò thaw ing so lution , fr eezing- thawing
process on swine semen, according t o the sperm mo tility and plasma membrane integr alit y after thawing , the r esult :
1. dilution effect of Ò boar freezing diluting solution ( sperm vig or 42. 5? 5. 2, cur ving offa l ratio o f sperm 44. 7 ? 3.
5) and thaw ing effect of Ò thaw ing solution( sperm v ig or 43. 8 ? 2. 6, cur ving offa l ratio o f sperm 36. 2? 4. 3) ar e ob-
v iously bett er , 2. We find a new method of manufacturing sw ine g ranule fro zen semen according summarization o f
manufactur ing exper ience, consequently screen out a simple and practicable method of manufact ur ing sw ine g ranule
frozen semen.
Key words: Swine Granule fro zen semen Manufactur ing technique
随着养猪业规模的不断发展, 为了能够最大可能的节约人力物力,降低生产成本, 以及实现优良品种的
远距离交流等目的, 猪的人工授精技术是至关重要的, 但这一技术的普遍推广依赖于猪精液的长期保存。与
其他动物相比, 猪精液冷冻技术虽然取得了一些进展, 但仍然存在着冷冻技术程序复杂、冷冻后效果不稳定
等问题。本实验筛选出了一种简单实用的猪颗粒冻精冷冻稀释、冷冻制作程序,可以大大降低猪颗粒冻精制
作的时间和要求。
1 材料与方法
1. 1 精液采集
实验用精液来自西南农业大学附近一配种站年龄在 2. 5岁左右的长白种公猪。用手握法采精, 采精时
用两层无菌纱布盖住烧杯口, 边采集边过滤除去副性腺分泌的胶体状物质,收集精液精子丰富的部分。采精
完成后在约 25 e 下于 1h 内运抵实验室,立即检查精液的量、精子密度和精子活力, 取精子活力在 80%以上
的精液进行冷冻操作。
收稿日期: 2005-03-03
作者简介:索永善( 1978- ) ,男,西南农业大学在读硕士研究生,研究方向:细胞生物学专业
生物技术通报
# 研究报告# BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 6期
1. 2 制作猪颗粒冻精涉及的液体
1. 2. 1 冷冻稀释液 Ñ号冷冻稀释液 基础液为:葡萄糖: 8. 0g 三蒸水: 100ml
A液为:基础液: 39. 8m l 卵黄 10. 2ml 青霉素 600 单位 链霉素 0. 06g; B液为: 基础液: 38. 5ml 卵黄:
10m l甘油: 1. 5ml, 青霉素 600单位,链霉素 0. 06g。
Ò号冷冻稀释液:葡萄糖: 3. 5g,蔗糖: 1. 05g, BSA: 3. 0g, Tris: 0. 12g,卵黄: 10ml, 甘油: 1. 5ml,青霉素:
600单位,链霉素: 0. 06g,三蒸水: 50ml。
Ó号冷冻稀释液:蔗糖: 6. 00g,柠檬酸三钠: 0. 550g , 乙二胺四乙酸: 0. 230g ,甘油: 5. 00ml,卵黄: 20. 00
ml,青霉素 1200单位,链霉素: 0. 12g,三蒸水: 100ml。
1. 2. 2 解冻液 Ñ号解冻液为[ 1] :葡萄糖: 1. 75g ,柠檬酸三钠: 0. 30g,碳酸氢钠 62. 5mg , ,氯化钾: 37. 5mg,
三蒸水: 50ml。
Ò号解冻液为: 葡萄糖 1. 5g,柠檬酸三钠 0. 75g , BSA3. 0g, 咖啡因 46. 25mg ,三蒸水加至 50m l。
1. 2. 3 洗精液为:氯化钠: 1607. 0 mg ,氯化钾: 8. 8 mg ,丙酮酸钠: 13. 8 mg ,葡萄糖: 45. 0 mg, 二水氯化钙:
275. 4 mg, T ris: 605. 5 mg, BSA: 500. 0 mg, 三蒸水加至 50m l。
1. 3 精液的稀释
1. 3. 1 Ñ号冷冻稀释液的稀释程序[ 2] 精液在室温( 25 e 左右)下静置 1. 5h 后,分装到离心管中, 每管 10
ml左右,以 500转/分钟的速度离心 15分钟,去除上清液, 用 3 倍量的 A 液稀释,将稀释后的精液放在 5 e
冰箱内平衡2h,使温度降至 2~ 4 e ; 然后用与 A 液等量的预先降温至 5 e 的 B液进行第二次稀释,稀释后在
5 e 冰箱内再平衡 2h。稀释结束后进行活力检查,取活力在 60%以上的精液进行冷冻操作。
1. 3. 2 Ò号冷冻稀释液的稀释程序 合格精液不做任何处理, 直接加入与精液等量的Ò号冷冻稀释液进行
稀释,将稀释后的精液放在 5 e 冰箱内平衡 2h。稀释结束后进行活力检查,取活力在 60%以上的精液进行
冷冻操作。
1. 3. 3 Ó号冷冻稀释液的稀释程序 合格精液在室温( 25 e 左右)下静置 1. 5h 后, 分装到离心管中,每管
10 ml左右,以 500转/分钟的速度离心 15分钟,去除上清液,用等量的Ó号冷冻稀释液稀释, 将稀释后的精
液放在 5 e 冰箱内平衡 2h。稀释结束后进行活力检查,取活力在 60%以上的精液进行冷冻操作。
1. 4 猪颗粒冻精的冷冻
向广口不锈钢保温瓶中倒入 2/ 3左右的液氮,在距液氮面上方约 2cm 处悬放一薄而光滑的金属板(最
好用广口不锈钢保温瓶配套的不锈钢内盖) , 将保温瓶盖盖住,冷平衡 2分钟左右,将稀释好的精液迅速而均
匀地滴注在金属板上,每滴 0. 2 m l~ 0. 5 m l,一般一次不超过 20滴。滴好后盖上盖子,平衡 2分钟, 平衡结
束后将颗粒从金属板上铲下, 暂时投在不锈钢保温瓶的液氮内,在液氮内停留 2分钟后, 随机取出两颗进行
解冻检查,若活力在 50%左右方可继续冷冻。一般同一批同一头猪的精液只这样抽查一次就可以了。
一次滴冻操作完成后,盖上盖子,将金属板冷却平衡 2分钟方可进行下次滴冻操作。待同一批精液全部
滴冻完成后,将保温瓶中的液氮小心地倒回液氮罐内, 同时迅速地用无菌汤匙将保温瓶中的冻精颗粒分装到
小纱布包中,在将小纱布包做好标记放到液氮罐中长期保存。
1. 5 猪颗粒冻精的解冻
1. 5. 1猪颗粒冻精的湿解冻 用试管盛 1ml~ 2m l解冻液, 40 e 水浴加热后,从液氮罐中取出 2枚冻精颗粒,
在空气中停留 15秒钟左右后投入解冻液中, 立即快速震荡试管使颗粒融化。
1. 5. 2 猪颗粒冻精的半干解冻 预先将一洁净的空的无菌小烧杯和解冻液 50 e 水浴加热 10后,从液氮罐
中取出2枚冻精颗粒,在空气中停留 15秒钟左右后投入小烧杯中, 加入 1m l预热好的解冻液(注意不可加在
冻精颗粒上) ,立即在 50 e 环境下摇动小烧杯,边摇动边观察颗粒的融化情况, 接近完全融化时迅速脱离
50 e 环境。
78 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 6期
1. 6 颗粒冻精解冻后的洗涤
将解冻后的精液放入离心管中, 加入 3倍量的洗精液,以 1 000转/分钟的速度离心 10分钟, 除去上清
液;同样的洗涤重复 3次。将洗涤好的精液用洗精液精子密度在 106个/ ml左右,在 37 e 平衡 30 分钟后进
行精液品质的检查。
1. 7 颗粒冻精解冻后的精液品质检查
1. 7. 1 精子活力的检查 取平衡好的精液 50Ll滴在保温 37 e 的血细胞计数板上,盖上盖玻片,在 40 倍相
差显微镜下观察并计算精子的活力。
1. 7. 2 精子质膜完整性的检查 采用低渗法,取平衡好的精液 50Ll放入 1m l低渗液中,混匀,在 37 e 平衡
30分钟后,取 50Ll滴在保温 37 e 的血细胞计数板上,盖上盖玻片, 在 40倍相差显微镜下观察并计算弯尾的
精子百分率。
2 结果分析
试验数据用 t检验。
2. 1 不同稀释液效果比较
从试验数据上我们可以看出, Ò号冷冻稀释液处理组冷冻-解冻后精子的活力和质膜完整性都明显地高
于其他两种稀释液( P< 0. 05) ; Ñ号冷冻稀释液和 Ó号冷冻稀释液处理组之间没有明显差异( P> 0. 05)。具
体数据见表 1。
表 1 不同稀释液效果比较
稀释液种类 精子活力 精子弯尾率
Ñ号冷冻稀释液 30. 2 ? 4. 6a 26. 3? 5. 0a
Ò号冷冻稀释液 42. 5 ? 5. 2b 44. 7? 3. 5b
Ó号冷冻稀释液 32. 6 ? 4. 3a 25. 6? 5. 1a
注: ¹ 在数据上方标注的字母不同表示差异显著( P< 0. 05) ;标注的字母相同表示差异不显著( P> 0. 05)。 º 实验重复 5次, 在以下的实
验中猪精液的冷冻稀释均采用效果较的Ò号冷冻稀释液
2. 2 不同解冻液效果比较
实验结果表明, Ò号解冻液的解冻效果显著高于Ñ号解冻液( P< 0. 05)。具体数据见表 2。
表 2 不同解冻液效果比较
解冻液种类 精子活力 精子弯尾率
Ñ号解冻液 34. 1 ? 3. 4a 29. 7? 3. 2a
Ò号解冻液 43. 8 ? 2. 6b 36. 2? 4. 3b
注: ¹ 在数据上方标注的字母不同表示差异显著( P< 0. 05) ; º 实验重复 5次,在以下的实验中猪颗粒冻精的解冻均采用效果较的Ò号解
冻液
2. 3 不同解冻程序效果的比较
实验结果表明, 半干解冻法的解冻效果显著高于湿解冻法( P< 0. 05)。具体数据见表 3。
表 3 不同解冻程序效果的比较
解冻方法 精子活力 精子弯尾率
湿解冻法 29. 3 ? 5. 4a 32. 1? 1. 4a
半干解冻法 48. 1 ? 1. 7b 44. 8? 3. 3b
注:在数据上方标注的字母不同表示差异显著( P< 0. 05)
3 讨论
一般地,对猪冷冻精液品质的检查只看解冻后精子的活力,然而, 精子质膜的完整性也是影响精液品质
792005年第 6期 索永善等:一种简单实用的猪颗粒冻精制作技术
的一个重要因素 [ 3] ;目前大多通过精子低渗处理后弯尾率来检测精子质膜的完整性,质膜完整的精子在低渗
溶液中尾部发生弯曲 [ 4]。从本实验的结果来看,质膜完整性与精子活力呈一定的相关性,精子活力高的精液
精子质膜的完整率也高, 或者是说,精子质膜的完整率高的精液,其精子活力也高。
通常,猪精液冷冻稀释液中都加有卵黄, 但卵黄中有大量的不溶性颗粒, 这些颗粒在精液解冻后会将精
子粘住,使其无法作直线运动,是否影响人工授精尚不清楚,但无法作直线运动的精子将大大降低体外受精
的效果。除去这些不溶性颗粒的方法之一, 是冷冻稀释液配好后, 在无菌环境下将稀释液以 3 600~ 4 000
转/分钟的速度离心 20分钟, 这样这些不溶性颗粒大部分会沉淀下去。
对于猪颗粒冻精的冷冻操作,不少文献都报道在铜网筛上做颗粒 [ 5]。实际上,在铜网筛上不仅不容易做
颗粒, 而且颗粒冷冻后不容易取下。我们在实验中发现,在金属板上做颗粒比在铜网筛上做颗粒至少节省 3
倍的时间,而且制成的颗粒形状美观。
从试验结果来看, Ò号冷冻稀释液的冷冻效果较好,解冻后精子的活力和质膜完整率都较高。与其他两
种冷冻稀释液相比, Ò号冷冻稀释液中含有 BSA 和 T ris。BSA 作为一种大分子蛋白物质,除了可以给精子
提供能量外,还可以增加稀释液的粘稠度, 使降温过程有所缓和, 这符合精液稀释后冷平衡的要求; T ris作
为一种良好的缓冲物质, 可以使稀释液有一个稳定的 pH 值,这可能是在精液稀释后冷平衡过程中保持精子
活力和质膜完整的一个重要因素[ 5]。
在冷冻之前缓慢降温有利于提高精子对超低温环境的耐受能力 [ 6] ,但冷平衡预降温的具体时间尚每见
报道。从我们的试验来看,冷平衡预降温的时间在 1~ 3h效果较好, 过长或过短对精子的活力和质膜完整性
都不利。在稀释后冷平衡 2h制作的颗粒冻精, 其精子活力和质膜完整性都高于冷平衡 1h 以下或 3h以上。
这一结果与一些文献报道的降温 4h 效果较好有些差异[ 5] 。
在我们的实验中, Ò号解冻液的解冻效果较好, Ò号解冻液中含有咖啡因和 BSA, 咖啡因对精子的刺激
作用和 BSA 对温度变化的缓冲作用可能是其原因之一。
对于猪颗粒冻精的解冻程序, 我们的实验结果表明,半干解冻法比湿解冻法效果好, 这一结果与一些文
献的报道相反[ 5, 7] 。
4 结论
在猪的颗粒冻精制作过程中, Ò号冷冻稀释液的稀释程序不仅简单而且效果较好,这一简单而实用的猪
颗粒冻精制作技术, 为人工授精技术在养猪业中的普遍推广打下了基础。
参 考 文 献
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3 Lars son K. Proceedin gs of firs t internat ional confern ae on deep freez ing of b uar semen[ C] , 1985, 177~ 187.
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7 Polge C. July 12-16 proceeding volume I comm unicat ion Ab st ract, 1976< En> , 204.
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