全 文 ：CMO , BADH 双基因植物表达载体的构建
何宇锋1 刘君1 韩烈保1 陈其军2
( 1北京林业大学草坪研究所 北京林业大学省部共建森林培育与保护教育部
重点实验室,北京 100083 ; 2中国农业大学,北京 100094)
摘 要: 以 pC1303 质粒和 pC1391 质粒为基础,利用载体 pBIUC 和 pBIB 构建了分别有 Ubi启动子、35S 启
动子调控的带有控制甜菜碱合成的 CMO 和 BADH 的植物表达载体 pC1303-Ub-i CMO-35S- B ADH , 为进一步开
展提高植物抗逆性基因工程提供了基础。
关键词: 双基因表达载体 甜菜碱 CMO BA DH
Construction of CMO-BADH Double Gene Expression Vector
He Yufeng
1 Liu Jun1 Han Liebao1 Chen Qijun2
( 1 Tu rf gr ass Inst itut e of B ei j ing Fore st ry Univ ersi ty , T he K ey L aborator y f or S i lv i cul tu re and Conservat ion of M ini str y
of Educat ion, Be ij ing Fore st ry Univ ersi ty 100083; 2 ChinaA g ri cul ture Univ er sit y , Be ij ing 100094)
Abstract: Based on plasmid of pC1303 and pC1391, double gene vector pC1303-Ub-i CMO-35S-B ADH conta-i
ning CMO and BA DH , which were r eleased from pBIUC, pBIB and contro lled by Ubi and 35S promo ter respect ive-
ly, was constructed. With CMO and BA DH contr olling the synthesis o f lycine, the obtained plant t ransfo rmation
vector can be applied on plants genetic engineer ing for stress- tolerance improvement.
Key words: Double gene expression vector Lycine CMO BA DH
甜菜碱是一类广泛存在于植物体内的渗透保护剂,是重要的渗透调节物质,甜菜碱在植物中的积累,可
提高植物对干旱、盐胁迫的适应性。高等植物中甜菜碱由胆碱经由两步氧化反应合成:胆碱→甜菜碱醛→甜
菜碱,其中由胆碱单氧化物酶( CMO)催化的第一步氧化反应,甜菜碱醛脱氢酶( B ADH )催化第二步氧化反
应,使用 CMO和BA DH 单基因表达载体的转基因植株都提高了一定的抗旱耐盐碱性 [ 1~ 6] , 而将 CMO和
BA DH 构建到同一表达载体以及遗传转化的研究未见报道。
在草坪草的遗传转化方面,主要集中在抗虫[ 7] 、抗除草剂[ 8, 9]、抗干旱以及滞绿等性状的研究, 而在耐盐
碱遗传转化方面的研究未见报道[ 10] 。为了更进一步提高草坪草的抗旱耐盐能力,我们将CMO和BA DH 两
个基因整合在同一个表达载体中, 草坪草遗传转化正在进行中。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌种和质粒 载体 pBIUC、pBIB、pCU 1303质粒和 pC35S1391质粒由本实验室保存。大肠杆菌菌
株 DH10B,根癌农杆菌菌株 LBA 4404。
1. 1. 2 酶和化学试剂 所有酶与试剂盒均为 Promega、Biolab公司和华美生物工程公司产品。其它试剂均
为分析纯。
1. 2 实验方法
收稿日期: 2005-04-13
基金项目:国家转基因植物研究与产业化专项项目"抗干旱、耐盐碱基因工程黑麦草、草熟禾新品种选育"资助 ( J2002- B-006) 国家 863 项
目( 2001AA244082)资助
作者简介:何宇锋( 1978- ) ,男,硕士研究生, E- mail : heyu fenggnefuyeh@ 163. com
通讯作者:韩烈保,男,教授,博导,电话: 010-62337982, E-mail: hanlb@ 163. net
生物技术通报
研究报告 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 5期
1. 2. 1 基本方法 菌体培养,质粒提取,限制性内切酶酶切,大肠杆菌感受态细胞的制备和大肠杆菌转化等
常规分子生物学操作均参照《分子克隆实验指南》一书 [ 11]。
1. 2. 2 琼脂糖凝胶中 DNA 酶切片段的回收 采用离心柱琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒回收酶切片段,步
骤参见试剂盒的说明书。
1. 2. 3 BADH 的克隆 设计带有特殊酶切位点的引物, 用 pfu高保真酶对 BA DH 进行 PCR 扩增, 用
PMD-18T 进行体载体连接。
1. 2. 4 连接反应 将载体 DNA 和外源 DNA片段加入一灭菌的 EP 管中, 摩尔比为 3 5,总体积为 8l。
放在冰上加入 T 4DNA 连接酶缓冲液 1l,加入 T4DNA连接酶 1l, 4 反应过夜。
2 结果与分析
2. 1 CMO-BADH 双基因植物表达载体的构建
2. 1. 1 植物表达中间载体 pCU C1303的构建 用 SmaⅠ和 SacⅠ双酶切质粒 pBIC,回收 1. 3kb CMO基因
片段,与经 SmaⅠ和 SacⅠ双酶切,回收的 pCU 1303质粒大片段连接,获得重组质粒 pCUC1303(图 1~ 2)。
图 1 重组质粒 pCUC1303 的构建
图 2 重组质粒导入大肠杆菌的 PCR检测
( M 为 DL2000; 1~ 3为 PCR引物为 CMO引物)
2. 1. 2 植物表达中间载体 pC35SB1391的构建 设
计带有 BamHⅠ酶切位点序列的PCR引物[ 12] ,用 pfu聚合酶对pBIB进行 BDAH 高保真 PCR扩增,回收扩
增产物,与 PMD-18T 体载体进行了连接,送交公司进行测序, 然后用 BamHⅠ和 BstEⅡ双酶切 PMD-18T-
BA DH ,回收 BA DH 基因片段,将此基因片段与经 BamHⅠ和 BstEⅡ双酶切,回收的 pC35S1391大片段连
接,获得重组质粒 pC35SB1391(图 3~ 4)。
图 3 重组质粒 pC35SB1391的构建
图 4 重组质粒导入大肠杆菌的 PCR检测
( M 为 DL2000; 1, 2为 PCR 引物为 BADH 引物)
64 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 5期
2. 1. 3 双基因植物表达载体 pCU C35SB的构建 用 BstEⅡ和 HindⅢ双酶切中间载体 pC35SB1391, 回收
2. 4kb的带 35S 启动子和 BA DH 基因片段, 与经 BstEⅡ和 HindⅢ双酶切,回收的中间载体 pCU C1303大
片段连接,获得植物双基因表达载体 pCU C35SB(图 5~ 7)。
图 5 重组质粒 pCUC35SB的构建
图 6 重组质粒导入大肠杆菌的 PCR检测
( M 为 DL2000; 1~ 5用的 PCR引物为 BADH 引物,
6~ 10用的 PCR引物为 CMO 引物)
图 7 重组质粒 pCUC35SB的酶切鉴定
( M 为 DL2000; 1~ 5为用 BamHⅠ做酶切鉴定)
图 8 重组质粒导入农杆菌的 PCR检测
( M 为 DL2000; 1~ 2用的 PCR 引物为 BADH 引物,
3~ 4用的 PCR引物为 CMO 引物)
2. 2 重组质粒导入农杆菌 LB4404
提取转化后的根癌农杆菌的质粒, 经 PCR扩增都可获得 1 300bp和 1 500bp的目的带,证明重组质粒确
已转入根癌农杆菌(图 8)。
3 讨论
3. 1 启动子的选择
本研究构建了适于单子叶植物表达的 CMO和BADH 双基因植物表达载体。由于 U bi双启动子头对
头的连接,形成回文结构,所以连接十分困难,因此在构建单子叶植物双基因表达载体时,用了两种不同的启
动子( Ubi启动子和 35S 启动子)来驱动 CMO和BA DH 基因。Ubi启动子头对头的连接十分困难, 因而需
进一步研究其改进方法。
3. 2 引入载体新的酶切位点
本研究在构建 BA DH 单基因表达载体时,由于 BA DH 基因一端没有合适的酶切位点, 影响下一步的
实验,因此在通过 PCR获得 BA DH 基因时, 设计了带有 BamHⅠ酶切位点序列的 BA DH 引物序列[ 12] ,并
在回收 PCR产物后, 送交测序公司测序, 证实了带 BamHⅠ酶切位点的 BA DH 基因片段的获得, 保证了实
验的进行。
3. 3 选择标记的选择
在许多植物中, 新霉素磷酸转移酶基因( N PTⅡ)已被成功的用于选择标记,但是多数单子叶植物本身
652005年第 5期 何宇锋等: CMO, BA DH 双基因植物表达载体的构建
具有卡那霉素抗性, 故而在单子叶植物的遗传转化中多采用潮霉素磷酸转移酶基因( H PT )和除草剂抗性基
因( bar )作为选择标记[ 13] , 因此, 我们在构建这一表达载体时选用潮霉素磷酸转移酶基因(H PT)作为筛选标
记,但其在成本上费用较高。
参 考 文 献
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国外动态
日利用玫瑰长春花细胞悬浮培养生产姜黄素糖苷
Agricell Report 2004年 42卷 4期 29页报道:已知家姜黄(丝姜黄) ( Curcuma longa, = C. domest ica)根
茎中的黄色素即姜黄素有多种用途,例如除了用作食品色素外, 还可用作药物。但由于这种黄色素在水中的
溶解度很低,因而限制了其在药物和其他方面的应用。
最近,日本名古屋城市大学药学院和日本国立卫生科学研究所的科学家神永和水上及其同事发现, 玫瑰
长春花( Cathar anthus roseus )的细胞悬浮培养可以将外源供应的姜黄素,转化为一系列的自然界中未见的
葡糖苷。还指出,葡糖基化的效率取决于细胞的培养期。此外,在加入姜黄素之前,将培养基中的蔗糖浓度
提高到 8%, 以及在培养中加入茉莉酮酸甲酯或水杨酸,也可以提高葡糖基化的效率。
神永等还发现, 在最适培养条件下, 玫瑰长春花细胞悬液可产生 2. 5mol的葡糖苷/克细胞鲜重。利用
上述方法获得的姜黄素葡糖苷,即姜黄素-4, 4-O--D-缩二龙胆酸二糖苷,是姜黄素产量的 20百万倍。
神永等说: 经试验, 只有利用玫瑰长春花的细胞悬浮培养系统, 才能产生这些姜黄素糖苷。其他种类植
物的细胞悬浮培养, 都没有类似的活性。又说: 我们目前除正在对与姜黄素葡糖基化有关的葡糖基转移酶
进行提纯和 cDNA 克隆外, 还准备在实验动物中检测这些姜黄素糖苷的吸收、代谢和药理活性,从而评价利
用这些葡糖苷作为前药或药物前体的可能性。 汪开治
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