全 文 ：第27卷 第11期
2015年11月
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
Vol. 27, No. 11
Nov., 2015
文章编号：1004-0374(2015)11-1328-08
DOI: 10.13376/j.cbls/2015185
收稿日期：2015-01-30
基金项目：国家自然科学基金项目(31271281)
*通信作者：E-mail: guocunhuang@gmail.com
生物钟在粗糙脉孢菌中的运行机制
张云峰，黄国存*
(苏州大学医学部生物钟研究中心，苏州 215123)
摘　要：尽管真菌和哺乳动物进化上相差很远，但在分子水平上，它们的生物钟作用机理却保守相似，由
正调控元件和负调控元件组成的负反馈环路驱动着节律基因的表达。粗糙脉孢菌生物钟的正调控元件
WC-1和WC-2激活中心振荡器 frq基因的表达，而负调控元件 FRQ和 FRH抑制正调控元件的转录活性。
负反馈环路涉及转录、转录后、翻译和翻译后等不同水平的调节，多种蛋白激酶和磷酸酶参与这一过程，
蛋白泛素化和蛋白酶体也是不可缺少的环节。
关键词：生物钟；粗糙脉孢菌；负反馈环路；FRQ
中图分类号：Q945.43；Q949.327.8 文献标志码：A
The circadian clock mechanism of Neurospora crassa
ZHANG Yun-Feng, HUANG Guo-Cun*
(The Center for Circadian Clocks, College of Medical School, Soochow University, Suzhou 215123, China)
Abstract: Despite the evolutionary distances between fungi and mammals, their circadian clock mechanisms share
remarkable similarity. At the molecular level, the negative feedback loops consist of positive and negative elements,
driving the rhythmic expression of core clock and clock-controlled genes. In Neurospora, the positive element,
WC-1 and WC-2 complex (WCC) activates frq expression, while the negative element, FRQ-FRH complex (FFC)
inhibits WCC transcription activity. The feedback loops compose of different regulations of transcription, post-
transcription, translation and post-translation. Several kinases and phosphotases are responsible for clock protein
phosphorylation or dephosphorylation. FRQ ubiquitination and degradation by the proteasome are essential to keep
the clock running.
Key words: circadian clock; Neurospora crassa; negative feedback loop; FRQ
黄国存，苏州大学生物钟研究中心教授。河北师范大学本科，西北农林科
技大学硕士，中国科学院植物研究所博士。曾在美国密西根州立大学和美国德
州大学西南医学中心做博士后研究。先后在美国 Yi Liu和 Takahashi实验室从
事生物钟研究。主要研究方向：以真菌和小鼠为材料，利用生物化学、分子生
物学和遗传学等研究手段，寻找真核生物钟新的调控元件。发现了蛋白激酶
PKA直接参与了生物钟蛋白的磷酸化；通过蛋白纯化结合质谱分析，定位了
PKA的靶位点。相关研究发表在 JBC、EMBO J、PNAS和 Genes Dev等杂志上。
目前主持国家自然科学基金项目 2项。
张云峰，等：生物钟在粗糙脉孢菌中的运行机制第11期 1329
生物钟是生物体内在的计时装置，存在于从低
等原核生物到高等真核生物几乎所有活体细胞中。
一般认为，生物钟是由于地球的自转和昼夜交替，
使地球上的生物为了适应这种变化进化而来，所以，
生物钟的周期长短近似 24 h，也称为近日节律或昼
夜节律。生物钟调控系统包括信号输入 (input)、中
心振荡器 (central oscillator)和信号输出 (output)三
部分。中心振荡器接受来自外界光照、温度或营养
化学信号等，从而做出内部调整，并与输入信号同
步化，通过控制一系列下游基因表达完成信号输出。
因此，生物钟是生物体适应外界环境变化不可缺少
的时间记录装置。
研究生物钟的常用模式生物包括蓝藻细长聚球
藻 (Synechococcus elongates)、粗糙脉孢菌 (Neurospora
crassa)、拟南芥 (Arabidopsis thaliana)、果蝇 (Drosophila
melanogaster)和小鼠。由于粗糙脉孢菌在进化上与
植物和动物密切相关，而且生长周期短，在昼夜节
律分子机制研究方面对整个生物钟研究领域起到了
重要的推动作用。粗糙脉孢菌属于子囊菌门，球壳
目，脉孢菌属。由于在黑暗和室温条件下，大约每
24 h产生一次肉眼可见的无性孢子斑，从而成为研
究生物钟机制的模式生物。早在 1941年，比德尔
(George Wells Beadle)和塔特姆 (Edward Lawrie Tatum)
用 X射线处理粗糙脉孢菌，通过后代突变体筛选从
而提出“一个基因，一个酶”的学说。据此，1958
年他们分享了诺贝尔生理学或医学奖 (同年另一半
诺奖授予 Joshua Lederberg)。所以，粗糙脉孢菌作
为遗传学研究的材料由来已久。
自 1984年第一个生物钟基因果蝇 period (per)
被克隆之后，来自粗糙脉孢菌的第二个生物钟基因
frequency (frq)在1989年也相继得到克隆 [1]。1999年，
Dunlap[2]第一次在真菌中提出的生物钟负反馈环路
机制，现在已证实在其他物种中也保守存在。2003
年，粗糙脉孢菌的基因组测序完成 [3]，大约 1万个
基因分布在含有 43 Mb的 7条染色体上。目前，美
国达特茅斯学院的一个研究项目试图得到所有基因
敲除的突变体，研究者可以咨询或订购感兴趣的菌
株用于不同目的的实验。本文只对以粗糙脉孢菌为
材料在生物钟研究方面的工作进行总结。
1　中心振荡器和负反馈环路
粗糙脉孢菌生物钟的中心振荡器由正调控元件
和负调控元件构成的负反馈环路组成。正调控元件
包括WHITE COLLAR-1 (WC-1)和WHITE COLLAR-2
(WC-2)蛋白，负调控元件由 FREQUENCY (FRQ)
和 FRQ-interacting RNA helicase (FRH)两种蛋白组
成。在深夜 (subjective night)，当 FRQ含量最低时，
WC-1和WC-2形成异源二聚体 (WCC)，WCC结
合到 frq基因的启动子特殊区域 (the Clock Box)，诱
导该基因的转录表达。frq mRNA逐渐积累，到第
二天上午达到高峰。FRQ合成后形成同型二聚体，
与 FRH形成复合物 FFC (FRQ-FRH complex, FFC)，
然后，再和酪蛋白激酶 CK1a (以下简称 CK-1)结
合在一起，这个蛋白复合物就转运到细胞核中抑制
WCC的转录活性，使 frq mRNA的含量降低。新合
成的 FRQ蛋白逐渐被蛋白激酶磷酸化，当磷酸化
达到一定程度时，被泛素连接酶复合物 SCF中的
F-Box蛋白 FWD-1识别，接着被蛋白酶体分解。
当细胞质中的 FRQ含量降低到一定域值，就不能
和其他蛋白形成复合物转运到细胞核中抑制WCC
的转录活性，这样WCC又开始了新的一轮转录激
活 frq的循环，这个周期近似 24 h (图 1 )。WCC除
了能够结合到 frq基因的启动子区域外，也控制着
大约 10 %的基因表达，这些基因叫做 ccgs (clock-
controlled genes)[4-5]。
1.1　负调控元件FRQ和FRH
FRQ是一个磷酸化蛋白，CK-1是 FRQ重要的
磷酸化激酶，与 FRQ紧密结合。最近，两个研究
组发现体内 FRQ多达 113个丝氨酸 /苏氨酸磷酸化
位点 [6-7]，有些位点通过体外实验已得到证实 [7]。
在一个生物钟周期中，磷酸化的发生具有时空性。
新合成的 FRQ没有任何修饰，磷酸化事件很快发
生在位于 PEST-1和 FFD (FRQ-FRH interacting domain,
FFD)之间的部位，接着蛋白 C末端开始磷酸化，
随后 PEST-1区域磷酸化，蛋白 N端在一个周期的
最后磷酸化。尽管磷酸化饱和后的 FRQ发生降解，
但 C端的磷酸化显然对 FRQ蛋白起着稳定作用。
有意思的是，在一个蛋白激酶 A (protein kinase A,
PKA)表达较高的突变体中，FRQ的稳定性也增强，
体外实验证实 PKA能磷酸化 FRQ [8]，但 PKA在体
内是否能磷酸化 FRQ蛋白 C端，还不得而知。尽
管单一磷酸化位点可以影响蛋白质的稳定性，由于
FRQ具有如此多的磷酸化位点，据此推测单一磷酸
化位点不可能具有独特的生理功能。对 FRQ蛋白
全序列氨基酸分析表明，N末端含有较多的碱性氨
基酸，带正电荷，而中部和 C末端酸性氨基酸较多，
带负电荷。没有磷酸化的 FRQ由于蛋白两端所带
电荷相反，相互结合在一起，导致在空间上相隔
生命科学：生物钟专刊 第27卷1330
162 个氨基酸之远的两亲性 α 螺旋 (FRQ-CK1
interacting domain, FCD)相遇在一起。这一特殊的
卷曲螺旋结构是 CK-1和 FRQ相互作用的基础。
FRQ的 N末端逐渐被 CK-1磷酸化，等电点降低。
随着磷酸基团的增加，FRQ蛋白N端逐渐带负电荷，
而相同电荷互相排斥，FRQ蛋白的 N端和 C端开
始分离，慢慢打开。由于结构改变，原来被埋藏在
内部的 PEST-1区域被 CK-1磷酸化，从而导致
FRQ的最终降解 [9]。虽然已清楚磷酸化的 FRQ被
泛素连接酶复合物 SCF中的 F-Box蛋白 FWD-1识
别 [10]，然后通过蛋白酶体途径降解，但至今不清楚
FWD-1对 FRQ蛋白的识别位点。COP9信号复合
体通过 SCFFWD-1的稳定性调节间接参与了生物钟正
常运转 [11]。另外，FRQ也可能存在其他降解途径 [12]。
FRH，一种 RNA解旋酶，是 Liu实验室纯化
FRQ时发现的和 FRQ紧密结合的新蛋白质 [13]。frh
属于粗糙脉孢菌重要基因，基因敲除后代不能存活。
在 FRH基因抑制的突变体中，FRQ蛋白降低，frq
mRNA含量上升，转录和翻译水平都失去了节律，
说明 FRH是脉孢菌生物钟中心振荡器重要的组成
部分 [13]。酵母中 FRH的同源基因 Dob1p/Mtr4p是
外切酶体的辅助因子，与 RNA代谢有关。在脉孢
菌中 FFC能和外切酶体的催化亚基 RRP44和 RRP6
结合，促进 frq mRNA的降解 [14]。2012年，在小鼠
肝脏 PER蛋白的纯化过程中，也发现两种 RNA
解旋酶 DDX5 和 DDX9 与 FER 结合在一起 [15]。
这种新的生物钟转录后调控方式可能在真核生物
中保守相似。
在主观的深夜，WCC开始结合到frq的启动子LRE区域，激活该基因的转录，frq mRNA上午达到峰值，这时WCC转录活性最
高，蛋白质活性最低(Morning)。FRQ蛋白自身以二聚体形式存在，再与FRH和CK-1形成一大的蛋白质复合体，然后这个蛋
白质复合体进入细胞核内抑制WCC的转录活性，frq mRNA水平降低(Afternoon)。在细胞质中，FRQ逐渐被磷酸化，两种磷
酸酶PP1和PP4会拮抗这一过程；磷酸化的WCC从细胞核进入细胞质，frq转录在晚上达到低谷(Evening)。高度磷酸化的FRQ
能够被SCFFWD-1识别，最后通过蛋白酶体降解；WCC被PP4或PP2A去磷酸化，然后返回细胞核，开始下一个循环(Night)。
CT， Circadian Time，生物钟时间。
图1 粗糙脉孢菌生物钟中心振荡器的负反馈环路
张云峰，等：生物钟在粗糙脉孢菌中的运行机制第11期 1331
1.2　正调控元件WC-1和WC-2
WC-1和WC-2能够形成WCC复合物，结合
到 frq和许多 ccgs基因的启动子区域，调控生物钟
基因的节律表达。WCC是第一个被发现的在生物
钟负反馈环路中通过 PAS-PAS结合的异源二聚体
转录因子 [16]。由于在 frq基因敲除的突变体中WCC
的磷酸化变得很低，据此推断 FRQ可能是某些蛋
白激酶的载体 [17]。CK-1和 CK-2蛋白激酶除了磷
酸化 FRQ外，也调节WCC的磷酸化，并且这个过
程依赖于 FRQ [18]，但是，PKA调节的WC-1磷酸
化可能不依赖于 FRQ [8]。磷酸化后的WCC转录活
性降低，蛋白稳定性增加；相反，低磷酸化的
WCC转录活性增强，蛋白稳定性减弱。所以，
FRQ抑制WCC转录活性，减少 frq mRNA的合成，
同时 FRQ促进高磷酸化WCC的积累，负反馈环路
和正反馈环路同时存在 [19]。除了 FRQ调节WCC
蛋白稳定性外，FRH也对WCC具有相似的生理功
能 [20]。一般认为WC-1蛋白存在幅度较低的周期
变化，WC-2蛋白含量基本不变。WC-1至少含有
10个磷酸化位点 [6,21-22]，而且在 C末端接近 DNA
结合区域 [21]，6个相近的位点磷酸化发生过程有先
后顺序，由不同蛋白激酶控制 [8]。双向电泳表明，
WC-2至少含有 8个磷酸化位点，并且磷酸化水平
呈现生物钟节律 [17]。WC-1蛋白持续结合在基因
的启动子区域，而WC-2蛋白的结合具有周期性
变化 [23]。作为转录复合体的WCC，在 DNA结合
方面为什么WC-1和WC-2又表现出如此的不同，
还需进一步研究证实。
2　参与生物钟调节的酶
2.1　蛋白激酶
由于 FRQ是含有上百个磷酸化位点的生物钟
蛋白，WC-1 和 WC-2 也是磷酸化蛋白，已证实
多种蛋白激酶参与了脉孢菌生物钟的调控，如
CK-1 [24]、CK-2 [25-26]、CAMK-1 [27]、PRD-4 [28]、
PKC [29]、PKA [8]、GSK-3 [30]。CK-1参与 FRQ和WCC
的磷酸化调节，也是和FRQ结合最紧密的蛋白激酶，
在果蝇中的相似激酶是 DBT，哺乳动物中是 CK-
1ε。CK-1在整个生物钟周期中都与 FRQ结合 [6]，
除了行使它的激酶功能，是否也有其他功能还不十
分清楚：因为在果蝇中 DBT的激酶催化活性并不
重要，在 DBT-PER复合物中，DBT可能只是起到
桥梁作用来接受其他蛋白激酶的加入 [31]，在哺乳动
物细胞中也有类似报道 [32]。尽管 CK-1和 CK-2的
磷酸化识别位点不同，但体外激酶磷酸化实验表明，
对于某些位点，两种激酶都能识别 [7]。和CK-1不同，
CK-2可能与温度补偿性有关 [33]。
2.2　磷酸酶
和蛋白激酶功能相反，磷酸酶是把磷酸基团
从蛋白质上去除。在 PP1催化亚基突变体中，FRQ
稳定性下降，生物钟节律变短；在 PP2A调节亚基
的突变体中，FRQ稳定性没有改变，但蛋白质含量
和 frq mRNA水平下降 [34]；同时，WC-2高度磷酸
化并且失去了节律 [17]。因此，PP1和 PP2A两种磷
酸酶参与脉孢菌生物钟的调控，但作用不同。WCC
能够在细胞核和细胞质中快速穿梭，存在于细胞
质中的 PP2A能够使高磷酸化的WC-2去磷酸化，
然后进入核内 [19]；但是，另一研究组认为是 PP4，
而不是 PP2A，调节WCC进入核内 [35]。要搞清楚
PP4和 PP2A对WCC进入核内的调控作用，一个
重要问题是要弄清磷酸酶的细胞定位，包括催化
亚基和调节亚基。由于在细胞核质提取分离过程中，
小的蛋白质容易从核中渗漏到细胞质，从而造成
某些蛋白质的定位错误。VVD曾被定位在细胞质
中 [36]，很难解释它的光抑制作用，直到利用 GFP-
VVD融合蛋白技术发现VVD其实存在于细胞核内，
通过和WCC结合抑制其转录活性，从而解释了光
适应的机制 [37]。
2.3　与染色质重塑有关的酶
CLOCKSWITCH是依赖 ATP 的染色质重塑
酶，它能节律性地结合到 frq的启动子区域，通过
改变染色质的结构调控WC-2与WC-1的结合 [23]。
CHD1也是一种染色质重塑酶，该基因敲除的突变
体 frq基因转录和翻译水平都失去节律，同时 frq的
启动子区域甲基化程度延伸扩大，相关的甲基化
酶 DIM-2与生物钟周期节律无关，但影响生物钟的
时相 [38]。
3　信号输入
3.1　光
WC-1也是蓝光受体，黄素腺嘌呤二核苷酸
(FAD) 能够共价结合到保守的感光 LOV 结构
域 [39-40]。把黑暗培养的脉孢菌转到光下，WCC能
迅速结合到光诱导基因的启动子 LRE区域，激活
相关基因的表达 (例如 frq、al-3和 vvd等 )[41]，几
个小时后，这些光诱导基因表达水平又恢复到正常
水平，这种现象叫做光适应。WC-1能发生光诱导
磷酸化，而高磷酸化WCC的转录活性降低 [42]。与
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光适应有关的重要蛋白质是 VVD，它含有一个
PAS/LOV结构域，也能与 FAD结合，是光受体蛋白，
其功能是在光下拮抗WCC的功能 [43]。VVD能被
光激活表达，在持续黑暗条件下受生物钟调控 [43]。
从蛋白质结构上分析，光能引起 N末端帽子结构离
开 PAS/LOV功能域，这样两个 VVD可以形成同源
二聚体 [44]。2010年，3个实验室各自独立工作证实，
光诱导合成的 VVD快速进入细胞核内，与WCC
结合，减弱WCC结合 DNA的能力，这样光诱导
表达的基因转录水平被降低，从而解释了光适应的
机制 [37,45-46]。VVD结合WCC也增加了WCC的蛋
白稳定性 [46]。
3.2　温度
除了光以外，温度也是生物钟重要的环境输入
信号，它主要影响 FRQ蛋白的变化，从而对生物
钟节律重新设置。生长在 21 ℃和 28 ℃不同温度下
的脉孢菌，尽管 frq转录水平没有太大区别，但在
高温条件下峰值 FRQ蛋白含量是低温条件相对应
峰值的 3倍，说明 frq转录后调控决定不同温度条
件下的 FRQ含量 [47]。当把生物钟自由运转的培养
物从 21 ℃改为 28 ℃，新的 FRQ时相总是从最低
点开始；相反，当把生物钟自由运转的培养物从
28 ℃改为 21 ℃，新的 FRQ时相从最高点开始 [47]。
根据生物钟的自由运转规律，在FRQ某一特定时相，
温度改变有可能抑制生物钟的运行，在新的生长条
件下脉孢菌失去了节律，这一现象叫做生物钟的奇
异性 (singularity) [48]。frq可以翻译出相差 100个氨
基酸的两种 FRQ蛋白，sFRQ (short FRQ)和 lFRQ
(long FRQ)。低温时两种 FRQ含量没有区别，高温
时 lFRQ比例增加 [49]。无论低温还是高温，只要生
物体在生理耐受的适应温度范围内，其自由运转的
生物钟周期长短不会随温度的变化而改变，即生物
钟温度补偿性，这是生物钟的重要特性之一。
除了光和温度两种主要的生物钟输入信号外，
外部营养或化学信号也可能影响生物钟的运转。由
生物钟控制的输出信号也可以作为输入信号来维持
生物钟的时间准确性。
4　信号输出
中心振荡器接受外部信号，再经过基因表达调
控，最后做出适应外部环境的变化，这就是生物钟
的信号输出，在基因表达水平上表现为WCC调控
ccgs的节律表达。脉孢菌在黑暗条件下产生的无性
孢子斑节律就是一种生物钟控制的信号输出，常用
来检测突变体生物钟是否发生改变的表型。一般来
讲，如果无性孢子斑的节律变长、变短或失去了节
律，在分子水平上 FRQ含量和磷酸化也有同样的
周期长短变化。
关于信号输出，一个突出的例子是发现与渗透
胁迫有关的MAPK通路和生物钟共同调控脉孢菌
的 ccg-1的表达 [50]。MAPK磷酸化具有明显的昼夜
节律，并且受生物钟调控。如果MAPK通路上游
的基因 rrg-1基因敲除，突变体不能表达 ccg-1，从
而失去了抗渗透胁迫的能力。在野生型脉孢菌中，
ccg-1在黎明之前达到峰值，为即将来临的白天日
光照射和高温带来的渗透胁迫做好准备，随后表达
水平降低。这种生物钟调控的信号输出对生物体有
效利用自身能量提供了保证。
在众多 ccgs中，有些时相与 frq相同，在早晨
达到峰值，有些在晚上达到峰值，但机制并不清楚，
直到 csp1的发现才揭开谜底 [51]。csp1编码一种转
录抑制因子，是WCC的直接调控基因。CSP1和
FRQ相似，磷酸化后结合泛素连接酶复合物被降解。
由 CSP1调控抑制的基因表达晚上达到峰值，和
WCC激活的基因表达时相正好相反。在几百个
CSP1调控的基因中，58个基因参于细胞膜脂类代
谢。由于这些基因晚上表达最高，暗示细胞膜合
成流动性也有昼夜节律。在 csp1突变体中，生物
钟周期随着培养基中葡萄糖浓度的升高而变短，
过量表达 CSP1引起生物钟周期变长，最后失去节
律。葡萄糖增加WC-1的翻译，同时，葡萄糖通过
CSP1抑制 wc-1的转录，所以在野生型脉孢菌中，
生物钟周期长短不会随着培养基中葡萄糖浓度的改
变而改变。因此，CSP1通过对WC-1负反馈抑制
作用把能量代谢和生物钟紧密联系起来 [52]。
5　不依赖负反馈环路调控的代谢生物钟
从真菌到哺乳动物，生物钟中心振荡器都是由
基于转录和翻译的负反馈环路组成，但是不同物种
间的生物钟基因不同，说明生物钟在这些物种中独
立进化而来。是否生物钟在不同物种中有一共同祖
先，这一直是生物钟研究领域感兴趣的问题。人
类血液中的成熟红细胞没有细胞核和线粒体，不
存在基因的转录和翻译；但在这些细胞中发现
Peroxiredoxin (PRX)蛋白存在一个 24 h的氧化还原
周期，而且节律符合生物钟的标准，如能自由运转
和温度补偿等 [53]。同时，在真核生物一种绿藻中也
存在相似的代谢生物钟，并且和负反馈环路调控的
张云峰，等：生物钟在粗糙脉孢菌中的运行机制第11期 1333
生物钟相互作用 [54]。2012年，基于 PRX的代谢生
物钟在蓝藻、脉孢菌、果蝇和小鼠中都被证实存
在 [55]。PRX的重要功能是清除细胞体内的活性氧
(ROS)。有意思的是，脉孢菌活性氧的产生存在昼
夜节律 [56]。代谢生物钟和基于转录和翻译的遗传生
物钟怎样共同保持生物体与外部环境时间的一致
性，还需进一步研究证实。
6　结语与展望
尽管粗糙脉孢菌属于低等真核生物，但其基因
组较小，遗传生化操作简单易行，是一种研究生物
钟的理想模式生物。以小鼠为材料，染色质免疫沉
淀结合高通量测序结果表明，只有 22%的节律表
达的 mRNA直接依赖于转录调控，即这些基因新
转录的包括内含子在内的 pre-mRNA也具有与稳态
mRNA相似的节律和时相，这说明其他大多数具有
节律表达的 mRNA属于转录后调控 [57]。在脉孢菌
中已报道 FRH结合外切酶体参与 frq的转录后调
控 [14]，在植物中发现剪接体直接结合生物钟基因
pre-mRNA[58]，即使稳态 mRNA恒定不变，polyA
信号长短也可能受生物钟调控 [59]。最近，本实验室
和美国德州大学西南医学中心 Liu实验室合作，利
用蛋白质免疫沉淀技术结合质谱分析，发现酵母同
源蛋白 Not1和WCC结合在一起，而 Not1和去腺
苷化酶 Ccr4存在于一个复合体中 [60]。Ccr4-Not是
一个含有至少 9个蛋白质的复合物 [61]，与 mRNA
代谢有关 [62]，它是怎样参与生物钟转录后调控的，
我们正试图在哺乳动物中找到答案。
[参　考　文　献]
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