全 文 ：利用泌乳乳腺鉴定真核基因表达的研究*
周雪艳2 张守峰1 姚伟1 任文陟1 范志强1 扈荣良1**
( 1军事医学科学院军事兽医研究所,长春 130062; 2吉林大学中日联谊医院心内科,长春 130031)
摘 要: 为了找到一种新的可用于基因及其表达调控元件鉴定的方法, 本试验以蚓激酶( LK )作为目的标志
基因,分别构建了在巨细胞病毒( CMV)立即早期启动子、逆转录病毒长末端重复序列( LT R)和 beta-酪蛋白启动
子调控下的三种真核表达载体 pICLK、pLLKSN 和 pIbLK 。制备各重组质粒后,以泌乳期羊乳腺作为支持系统,
在处于稳定泌乳阶段分别注射 400~ 800Lg 重组质粒于山羊乳腺组织中。在注射后不同时间采集奶汁, 检测纤溶
活性。结果显示,蚓激酶的不同重组质粒在注射到乳腺组织之后迅速得到表达, 注射后 6~ 9h 蚓激酶表达量达到
高峰,并可持续至 72h 以上; 不同表达载体间表达量略有变化, 但无显著差异。这些结果表明,利用泌乳乳腺组织
表达真核蛋白是鉴定真核基因表达快速有效的手段之一。
关键词: 泌乳乳腺 蚓激酶 真核基因 表达载体 表达
Utilization of Lactating Mammary Glands to Identify
Eukaryotic Gene Expression Vectors
Zhou Xueyan
2 Zhang Shoufeng1 Yao Wei1 Ren Wenzhi1 Fan Zhiqiang1 Hu Rong liang1
( 1 Veterinary I nsti tute , A cademy of M i li tary Med ical S ci ence , Changch un 130062;
2China-Jap an Union H osp ital of J il in Univ ersi ty , Ch angch un 130031)
Abstract: Three eukar yo tic vecto rs, pICLK , pLLKSN and pIbLK , w ere constructed, by using CMV immed-i
ate ear ly pr omot er, SV40 early promo ter and beta- casein pr omoter as r egulato ry element, r espectiv ely , and utilizing
the lumbrokinase cDNA as gene of interest. The recombinant expression plasmids w ere larg e- scale made and 400Lg
of each w ere injected into lactat ing goat mammary g lands. M ilk were collected at different periods and assayed fo r f-i
br ino ly tic activ ity. Results show ed that the lumbrokinase was immediately expressed f rom the thr ee different recom-
binant plasmids. T he expression r eaches summit at 6~ 9h after inject ion and per sist s fo r up to 72h. A lthough var ia-
tion in expression level ex ists bet ween different vecto rs, the difference is no t significant. It w as demonstr ated that
expression o f eukary otic pr otein in lactating mammary g lands w ould be a r apid and effective approach to identify eu-
karyot ic gene and its expr ession vect or.
Key words: Lactat ing mammary g land Eukaryot ic g ene Expression vector I dentification Lumbrokinase
Co rr esponding author
在基因的表达与调控研究中, 用于真核基因及其表达载体鉴定的主要方法一般是将带有目的基因的真
核表达载体转化 COS-7或其它传代细胞, 12~ 96h内收集培养细胞上清,用于表达产物的检测[ 1]。这种暂时
表达方法除了需要严格的无菌操作和较长的时间以外,宿主细胞和启动子的选择对目的蛋白的表达和表达
量也有明显的影响, 因此在使用上具有一定的局限性。我们在蚓激酶的表达研究中发现,蚓激酶基因可以在
乳腺组织特异性启动子指导下表达并分泌到奶中[ 2] ;没有明显组织特异性的巨细胞病毒( CMV)立即早期
收稿日期: 2005-04-01
* 国家高技术研究发展( / 8630 )计划生物反应重大专项资助课题( No. 2002AA206653)
作者简介:周雪艳( 1961- ) ,女(汉族) ,放射医学专业在读博士
** 通讯作者: T el / Fax: 0431- 7961260; E-mail: h urongliang@ hotmail. com
生物技术通报
#研究报告# BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 4期
( IE)启动子、逆转录病毒长末端重复序列( LT R)等是否也可以指导目的基因在乳腺组织中表达和分泌目前
尚不清楚。乳腺组织是机体中代谢最旺盛的组织之一,以其作为目的蛋白表达的支持系统,目的基因产物不
仅产量高,而且容易收集分析,因此,阐明普通的泛嗜型性启动子在乳腺组织中的启动活性,可以为真核基因
的表达和调控序列的鉴定提供一种简便而有效的方法。
1 材料和方法
1. 1 基因、质粒和表达载体的构建
目的基因蚓激酶 ( LK ) cDNA ( GenBank A ccession number: A Y327442) 由本实验室克隆和保存;
pIRES1neo、pLXSN 均购自 CLONT ECH 公司; pIbCP-neo 为本实验室构建的乳腺组织特异性表达载体,系
以 pIRES1neo 为基础, 以山羊酪蛋白 5c端调控序列 ( GenBank A ccession number: AY311384 ) 取代
pIRES1neo中的 CMV IE启动子序列获得的表达载体。将蚓激酶 cDNA 片段分别以粘端互补或平端方式
分别克隆连接到以上三种载体中, 酶切、补平和连接方法参照文献[ 3]介绍的进行。
1. 2 质粒的制备
构建过程中重组质粒的小量制备和乳腺转化所需的质粒大量制备方法均参照文献[ 3] 介绍的方法进行。
1. 3 泌乳山羊、质粒在乳腺中的转化及羊奶采集
1岁龄以上泌乳期奶山羊 9只,租自长春亦东花卉养殖有限公司。注射前采左、右侧乳腺奶汁留作空白
对照, 然后分别以上述三种蚓激酶表达质粒 400Lg 和 800Lg (溶于生理盐水)注射左、右侧乳房,每种表达质
粒注射 2只,其余 3只分别注射空载体质粒 pIRES1neo、pLXSN 和 pIbCP-neo 作为阴性对照。质粒注射后
照常哺乳,并于 1. 5~ 96h内每隔 1. 5~ 5h采集左、右侧乳房羊奶, 10 000rpm离心后, 取中间层液体, 用于纤
溶活性的检测。
1. 4 目的产物蚓激酶活性的检测
取 20Ll经离心后的待测乳样,于纤维蛋白-琼脂糖平板上测定( FAPA)奶中蚓激酶的纤溶活性。纤维蛋
白-琼脂糖平板的制备、测定和活性的判定参照文献[ 4] 介绍的方法进行。
1. 5 奶样的 SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳( SDS-PAGE)
取 30Ll离心待检奶样,加等体积 2 @ SDS 上样液( 0. 1M T ris-HCl, pH6. 8, 4%( W/ V) SDS, 20% ( V/
V) g lycer ol, 0. 005% (W/ V) ) , 煮沸 10min, 冰上冷却,短时离心后, 按文献 [ 5]介绍的方法,在 4%浓缩胶和
15%的分离胶上进行 SDS-PA GE 变性电泳 8~ 16h,染色、脱色, 观察结果。
2 结果
2. 1 不同的蚓激酶真核表达载体
利用三种不同的启动子即巨细胞病毒立即早期启动子( pCMV)、山羊 beta-酪蛋白启动子( bCP)和小鼠
M-mLV 长末端重复序列( 5c-LT R)分别构建了蚓激酶的表达载体 pICLK、pIbLK 和 pLLKSN (如图 1A/ B、
C)。pICLK 和 pIbLK的主要区别在于二者启动子序列和长度不同,其他元件均相似或相同。pLLKSN 可
以用于重组逆转录病毒的包装,其质粒形式在大肠杆菌中的拷贝数较低。
2. 2 质粒的制备
分别制备了约 2mg 上述三种重组质粒,纯度均大于 98. 3%;质粒 95%左右为超螺旋形式, 5%左右为开
环或线性化形式。DNA按 400Lg / ml溶于注射用灭菌生理盐水中,于 4 e 或-15 e 保存, DNA 溶液室温时用
于泌乳乳腺组织的注射。
2. 3 蚓激酶的表达
三种表达载体在注射乳腺组织后, 目的基因均分别获得了表达, 表达规律、表达水平和表达持续的时间
均相似:注射三种质粒后, 1. 5h即可检出纤溶活性, 6~ 9h即达到高峰, 并在 72h内保持可检出水平; 表达量
在 105 000~ 350 000 tPA 活性单位/ L 之间。阴性对照质粒注射前后均未检出纤溶活性。蚓激酶表达质粒
40 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 4期
注射前后奶中蚓激酶的活性测定结果如图 2 A、B、C。
图 1 由不同启动子指导调控的蚓激酶 cDNA表达载体
A/ B: 目的基因上游的调控序列分别为巨细胞病毒立即早期启动子和山羊 beta-酪蛋白启动子, 其他元件均来自于 pIRES1neo
C:载体为 pLXSN,目的基因蚓激酶 cDNA 克隆在 5c端 LT R下游的多克隆位点处
图 2 三种蚓激酶不同的表达载体注射乳腺组织前后不同时间表达产物的活性
测定结果
A: pICLK在乳腺中的表达结果 B: pIbLK 在乳腺中的表达结果
C: pLLKSN 在乳腺中的表达结果 1: tPA 标准品( 2U) 2:注射前奶样
3~ 9:注射后 3h , 6h, 9h, 24h, 36h, 48h , 60h奶样
2. 4 SDS- PAGE结果
从图 3 电泳结果可以看出, 在
42. 3kDa 处, 注射蚓激酶表达载体
后的奶样出现一条外源性蛋白(蚓
激酶)带,注射前正常奶样则没有蛋
白带出现。说明蛋白在通过泌乳乳
腺获得表达以后, 可以采用 SDS-
PAGE 检出, 并能 通过 Western
blot做进一步鉴定。
3 讨论
鉴定真核基因及真核基因调控
序列对表达影响的方法有多种, 但
主要是通过在培养细胞上进行暂时
或稳定表达来实现。本实验室在构
建哺乳动物乳腺生物反应器的研究
中发现,某种目的蛋白(如组织型纤
溶酶原激活剂( tPA) )基因的乳腺组
织特异性表达载体在被注入到乳腺组织以后,这种基因可在乳汁中获得表达,这种表达当时被认为是乳腺组
织特异性表达调控元件特异性指导的结果。非组织特异性即泛嗜性启动子在乳腺组织中指导基因表达调控
的特点并不明确。本试验结果表明,无论是乳腺组织特异性启动子, 还是泛嗜性启动子(即本试验中的巨细
胞病毒立即早期启动子和逆转录病毒的长末端重复序列) ,均可指导目的基因在乳汁中表达,三种不同的启
412005年第 4期 周雪艳等:利用泌乳乳腺鉴定真核基因表达的研究
动子指导的蛋白表达水平基本相当。说明在代谢旺盛的乳腺组织中,乳腺组织特异性启动子与非乳腺组织
特异性启动子相比, 前者的组织特异性表现并不明显; 或者说,巨细胞病毒立即早期启动子和逆转录病毒的
长末端重复序列没有明显的组织特异性。因此,可在任何组织中指导基因表达,其指导的目的基因的表达水
平完全受被转染组织代谢水平高低的影响。
图 3 注射前后奶样的 SDS-PAGE
1、6: 注射前奶样 2、3、4: 注射 pICL K、
pIbLK 和 pLLKSN 后 24h奶样
5: 蛋白分子量标准
上述试验同时说明, 乳腺作为机体内最活跃的代谢组织, 具有
旺盛的物质摄取和合成能力。三种表达载体在转化乳腺组织后,
质粒 DNA可以迅速地被乳腺组织细胞摄入, 并被立即转录和表
达。从本试验的结果来看, 泌乳乳腺细胞的摄入能力, 表达速度和
表达水平在机体内其他组织细胞是少见的; 同时, 由于乳腺细胞的
表达产物 ) ) ) 乳汁具有可以随时采集并进行检测的特点。因此,
泌乳乳腺是一种进行基因表达及调控序列鉴定的重要靶组织。
在本试验中,质粒 DNA 是以溶于生理盐水中的形式注入乳腺
组织中的,其它溶液形式如水溶液、司本-甘油以及包裹脂质体的质
粒 DNA 在注入乳腺组织后均可获得表达。但综合质粒溶液对乳
腺组织的影响、溶液对乳汁质量的影响和质粒溶液制备的难易等
多种因素,所以说生理盐水溶液是最好的质粒 DNA 溶液形式。
目前,尚无蚓激酶特异性抗体,表达产物的抗体反应特异性鉴定还
无法进行,而且乳腺中的产物表达水平较高,采用注射前后乳汁作生物
学活性测定或是通过PAGE直接比较注射前后产物条带的有无,依据
推导的多肽分子量,可以基本确定产物 ) ) ) 蚓激酶的特异性。
以上试验结果说明,泌乳乳腺具有旺盛的代谢尤其是物质合成功
能,可以作为真核基因表达载体鉴定的靶组织,这种鉴定不是主要依赖于表达载体中调控元件的组织特异性,而是
主要依赖于泌乳乳腺组织的代谢水平。
参 考 文 献
1 Aruffo A & B Seed. Proc Nat l Acad Sci USA, 1987, 84( 23) : 8573~ 8577.
2 H u R, S Zhan g, et al. Biotechnol Appl Biochem, 2004, 39(3) : 307~ 312.
3 Sambrook J, EF Frit s ch, T Maniat is. Molecular cloning: A laboratory m anu al ( second edit ion) . New York: C old Spring Harbor Laborato-
ry Press, 1989, 1. 21~ 1. 105.
4 张守峰,扈荣良,等.中国兽医学报, 2002, 22( 5) : 436~ 437.
5 卢圣栋主编.现代分子生物学实验技术(第二版) . 北京:中国协和医科大学出版社, 1999, 382~ 385.
石岐杂鸡 r-干扰素基因的克隆与序列分析研究 # 国内信息#
华南农业大学动物科学学院吕英姿、毕英佐和曹永长三位先生对广东石歧杂鸡 r-干扰素基因的克隆与
序列作了分析, 他们根据现有鸡 r-干扰素基因序列设计引物,应用反转录-聚合酶链反应( RT-PCR)技术,从
ConA 诱导培养的鸡脾淋巴细胞中扩增得到石歧杂鸡 r-干扰素( SqzChIFN-r )基因, 将其克隆到 PGEM-T 载
体中,进行序列测定,结果表明,经克隆得到的那种 ChIFN-r 基因的开放阅读框由 492个核苷酸组成,它与
其他 ChIFN-r基因的同源性达到 99% ,与火鸡 r-干扰素基因的同源性为 96%, 与鸭 r-干扰素基因的同源性
为 81%。由此,他们推导石歧杂鸡 IFN-氨基酸序列与其他已知的 ChIFN-r 氨基酸序列完全相近或一致,同
时与火鸡和鸭 IFN-r 氨基酸同源性分别为 97%和 67%。此说明石岐杂鸡 r-干扰素基因的同源性与鸡类的
较近,与其他不同种类的则较远。 秦春圃
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