全 文 ：量反应平行线法在溶栓胶囊蚓激酶效价
测定方法学研究中的应用
董培智! 朴晋华!! 党爱华*! 王婷婷! 张蕻! 张志伟)
,山西省药品检验所! 山西 太原 $)$ $$% *,山西中远威药业有限公司! 山西 太谷 $)$($$ % ),山西大学 化学化工学院! 山西 太原 $)$ $$## $摘要%!目的&建立蚓激酶的效价测定方法$并引入生物检定统计法控制实验误差) 方法&用标准曲线法和生物检定的 量反应平行线法统计计算效价$从方法耐用性&专属性&线性范围&供试品处理方法&精密度&重复性&溶液稳定性&回收率&统计 计算方法等方面对溶栓胶囊中蚓激酶效价测定的琼脂糖纤维蛋白平板法进行了方法学研究) 结果&不同琼脂糖&不同纤维蛋 白原对本法测定影响较小$阴性对照无干扰*本法线性范围为 *g k&$$ ]$精密度 >8I)g*j$重复性 >8I(g)j$回收率 7%g$j$>8I#g#j*供试品溶液在 & h下 %* ?内稳定*用本法可以将测定误差由 #$j k%$j降低到 *j左右) 结论&琼脂糖 纤维蛋白平板法可以快速&简便&准确地测定蚓激酶的活性$用生物检定的量反应平行线法可以控制测定的误差)
$关键词%!蚓激酶*效价*琼脂糖纤维蛋白平板法*生物检定*量反应平行线法$稿件编号%!* $$$*$)$$
$基金项目%!国家药典委员会 *$$版中国药典(一部科研立项课 题!_X$&
$通信作者%!!朴晋华$主任药师$硕士生导师$山西省药品检验所
副所长$主要从事药理及毒理研究$RMS#!$)*$*(%%$U4/BNS#/B4 C5ANB.2*#g-./$作者简介%!董培智$硕士$副主任药师$主要从事药检药理及药品 的生物检定工作$RMS#!$)*$*7*$U4/BNS#AMNW?NQ2*#g-./ !!溶栓胶囊为鲜地龙经适宜加工方法制成的 肠溶胶囊$其主要功能为清热定惊$活血通络$用
于中风半身不遂&肢体麻木$高血压症) 原药品 标准收载于新药转正标准第 7 册 +,$其效价用
纤维蛋白平板测定$结果以溶圈直径表示) 缺点 是纤维蛋白平板呈半固体状态$测量溶圈直径较
困难*溶圈易受试剂批次和不同实验条件的影
响*而且用直径表示效价无法与其他含蚓激酶产
品的效价比较)
蚓激酶是从新鲜地龙中提取的水解蛋白酶$具 有直接和间接溶解纤维蛋白的作用) 目前$其效价
或活性测定有多种方法#对甲苯磺酰4D4精氨酸甲酯
!R39U法+*4&,虽条件易控制$操作简便迅速$但需
要特殊昂贵的底物和试剂$不易推广*光散射法+, 虽然快速准确$但需要特殊的荧光仪测定$而且易受 供试品辅料等实验条件的影响$也不易推广*琼脂糖
!琼脂4纤维蛋白平板法+#,不用特殊试剂和仪器$操作简便$容易推广$文献+#,用组织纤维蛋白溶酶 原激活剂!RE3作为对照品$无法统一和比较不同
蚓激酶制品的效价) 本研究对琼脂糖4纤维蛋白平
板法做了改进$并引入对照品和量反应平行线法计 算效价$对影响因素进行控制$按照 中国药典( *$$年版+%,有关方法学验证要求$对效价测定方法
进行方法学验证$根据验证结果修订了溶栓胶囊的 效价测定方法) !材料 溶栓胶囊 !山西中远威药业有限公司$共 )
批$批号分别为 *$$*$)$)$ * $$#$$ $*$$#*$$*$$#$) $$*$$ %$($$*$$%$7$*$ * $$%$#$*$ *$$ % $$$ *$$ % $$*$ *$$ ( $$$ *$$ ( $$*$ *$$ ($*$*$*$$($* $$牛凝血酶!批号 *$$ &*&&牛
纤维蛋白原!批号 * $$%)#$*$$ *)*和蚓激酶对照品
!中国药品生物制品检定所$批号 *$ $$*) 进口牛 纤维蛋白原!北京江晨生物公司分装$批号 H(#)$$
琼脂糖粉 !上海楷洋生物技术有限公司$批号 (&(#%&$(&(#%()
恒温培养箱!上海恒科科研仪器有限公司*游
标卡尺!桂林广陆数字测控股份有限公司)
!方法
U!对照品溶液的制备
取蚓激酶对照品$用$g7j氯化钠溶液制成含
不同蚓激酶单位的溶液)
.$&. 第 ) 卷第 期 *$$年 # 月 !!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! ! [.Sg)$ :OOTM!
VT1M$*$$U!供试品溶液的制备 取溶栓胶囊内容物$研细$精密称定适量$加
$g7j氯化钠溶液超声 )$ /N1$定容) 摇匀$取适量
& $$$ C./N1 e离心 ) /N1 后$精密量取$并照对照 品溶液的浓度配成不同浓度的稀释液) U&!琼脂糖4纤维蛋白原平板制备 取琼脂糖 g D$加工作溶液+AY%g( 磷酸盐缓 冲液与 $g7j氯化钠溶液!i%混合,$$ /` 加热溶
解) 取g D.`e纤维蛋白原溶液*$/`$置烧杯中$边搅拌边加入 h琼脂糖溶液 *$ /` $GE./` e 凝血酶溶液$g# /` $立即混匀$快速倒入 * 个直径
%g -/培养皿中$室温水平放置 )$ /N1$打孔) U_!培养测定 精密量取不同浓度的蚓激酶对照品溶液及供试 品溶液各$

$`分别点在同一平皿中$加盖$置 )% h恒温箱中 ( ?) 取出后用卡尺测量溶圈垂直直 径$计算溶圈面积的对数和蚓激酶单位数的对数)
U$!数据处理分析 量反应平行线测定法照中国药典(*$$年版 二部附录K:[中生物检定统计法的量反应平行线 测定法计算效价及实验误差) 标准曲线法是以对照 品点样量!]对数为横坐标$溶圈面积对数为纵坐
标求回归方程) 在标准曲线上计算不同稀释度下供
试品的效价单位)
&!结果
&,!耐用性试验
&,,!不同琼脂糖对试验结果的影响!按照效价
测定方法测定 * $$($$ $*$$#$)$批溶栓胶囊效 价$分别用 * 个批号的琼脂糖铺板$结果批号为 (&(#%& 以及批号为 (&(#%( 的琼脂糖测定 * 批样品 效价分别为 ##$%$*$#%#$#(& ]./De$所测 * 批
制剂效价差异较小$说明不同批号的琼脂糖对本法 测定干扰较小) &,,!不同纤维蛋白原对实验结果的影响!分别 用 * 个批号的纤维蛋白原$按照本文检测的方法检
测 * $$%$7$* 批溶栓胶囊效价$用 * 种方法统计计算 供试品效价$即原标准的直接测定溶圈直径法和标 准曲线法$结果见表 ) 表 !不同纤维蛋白原对溶栓胶囊效价的测定 ;.g 直接测定法 标准曲线法 平均值 8I=// * >8I=j 平均值 8I=]./D e >8I=j *$$ *)* *)% *7, *,&$#(& #*,7 7,*$
* $$%)# 7( % (,#$ %#& ) ,%$ 合计 *( )$,# &, %*& 7,% (,) !!从效价数据来看$按照原标准中方法测定的溶 圈直径的变异较大$* 批纤维蛋白原测定效价结果 的>8I分别为 *,&j$(,#j$而用标准曲线法计算 效价结果的>8I分别为 7g*j$g%j) 不考虑纤维 蛋白原批次$前者 >8I&j$后者 >8I(,)j) 从 变异系数的角度考虑$标准曲线法计算效价较直接 测定法好) * 批纤维蛋白原测定结果比较$*$$ *)* 批纤维
蛋白原用 * 种方法测定结果 >8I分别为 *j$7g*j**$$%)# 批纤维蛋白原 * 种方法测定结果 >8I分别为 (g#j$g%j) 批号 * $$%)# 的纤维蛋 白原测定结果变异较小) &U!专属性 取去除处方中原料地龙冻干粉外的组方$按正 文中制法制成阴性对照样品$按供试液制备方法制 备成阴性对照溶液$同法将与样品含量一致的对照 品添加至阴性对照溶液$制备空白回收样品) 按正 文效价测定方法测定$结果在阴性对照样品处未出 现溶圈$而空白回收样品处溶圈与样品一致) 证明 在本法条件下$阴性对照无干扰) &U&!线性范围 取蚓激酶对照品加生理盐水$制成每 含`蚓 激酶为$$ *g $$g#* ]的对照品溶液) 分别精密 吸取上述 $ ]. ` e对照品溶液 &$$ * $$$ `和 上述 *g$$ g#* ].

`
e对照品溶液 * $$*$ `点 样$测定溶圈面积) 以点样量!]为横坐标$溶圈面 积为纵坐标求得回归方程) 点样量在 *g k&$$
]$回归方程 9f$)g$l$g7&J$G* f$g7#7) 点样
量在 $k&$$]$回归方程 9f*(g% l$g()J$G* f
$g77$) 以点样量!]的对数为横坐标$溶圈面积的 对数为纵坐标求得回归方程 9fg)#( l$g&7J$G * f$g7()从线性范围和线性两方面考虑$本方法 .&. 第 ) 卷第 期 *$$年 # 月 !!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! ! [.Sg)$ :OOTM!
VT1M$*$$点样量在$ k& $$]$适合用单对数模型计算$点样 量在 $ k&$$ ]线性关系较好$G* f$g77$) &U_!供试品处理方法研究 &U_U!不同溶剂提取考察!原标准用生理盐水加 明胶溶液提取蚓激酶$笔者将 $g7j氯化钠溶液和 生理盐水加明胶溶液提取供试品的实验结果进行比 较$时间固定为 ?$按照测定方法$结果生理盐水加
明胶溶液提取液测定效价为 %($]./De$$g7j氯 化钠溶液提取液测定效价为 %%) ]./De) 生理盐水加明胶溶液和$g7j氯化钠溶液提取
蚓激酶测定差别较小$从节约试剂和方法简便的角 度考虑$选择 $g7j氯化钠溶液为溶剂来提取供试 品中的蚓激酶) &U_U!提取时间考察!原标准对提取时间没有规 定$试验采用不同超声提取时间来对蚓激酶的提取
效果进行考察) 方法同测定方法$结果$g ? 提取
液测定效价为 %)$]./De$ ?提取液测定效价为
(#7 ]./D
e
)
超声提取 ? 测定的蚓激酶效价较提取 $g ? 高) 建议本法采用超声提取 ? 的条件来提取供试 品中的蚓激酶) &U$!精密度试验
取供试品溶液!批号 * $$%$#$*$连续点样 板$测定溶圈面积$结果精密度试验>8I)g*j) &U)!重复性试验 取本品!批号 *$$ %$7$* # 份$按效价测定方 法$测定样品中蚓激酶的效价$结果重复性试验 >8I(g)j) &U%!溶液稳定性试验 取储存于 & h下同一供试品溶液$分别在制备
后 $$*&$&($%* ?点样$测定其效价$供试品溶液在 & h下 %* ?内稳定) &U`!回收率试验 取已知含量样品!批号 *$$ %$#$*$效价 #)* ]. /D e$研细$称取 # 份$!每份约 g* D$分别精密 称定$再精密量取蚓激酶原料!批号 * $$($$ *$效价 % ]./D e约$g( D./` e /` $分别加入样 品中$按供试品溶液制备方法制备$并按本文中效价 测定方法检测并计算回收率$结果见表 ))
&U#!$批样品效价测定结果及限值确定 表 )!蚓激酶加样回收率 样品取样量 =D 样品效价 =] 加入量 =D 测得量 =] 回收率 =j 平均值 =j >8I =j g*$& %#$7*($g($( #*$) (7g7) 7%g$#g# g*$( %#) &# %* (%$(g) g*(7 (& #&( 7&$$(*g)# g*$ * %7 ( $g($ % (#* &$) #g7( g*$ ( %7 )( (%$77$ %g(
g*$%7$7 #$&*# (7g)* &U#U!不同统计方法计算$ 批样品效价测定!
取 $批样品$按修订后的标准草案进行效价测定$用标准曲线法和量反应平行线法计算效价) 量反应平行线法是以对照品和供试品点样量 !]的对数为横坐标$溶圈面积的对数为纵坐标分
别求得回归方程) 对 * 条平行线做统计学上的可靠
性检验$见表 &$根据标准品和供试品的等反应剂量
比和误差$计算供试品效价$见表 )
表 &!量反应平行线法可靠性检验
变异来源 ,A 差方和 方差 / >
试品间!!! $g$$&&* %$g $$&&* % &g&7* # 回归!!!! $g)*# $& $g)*# $& *#7g* o$g$ 偏离平行!! $g$$ $*$ )) $g$ $$*$ )) o 二次曲线!! $g$$ $) %($g $$$ ) %( o 反向二次曲线 $g$$ *$($g $$*$ ( o 剂间!!!! $g))) )* $g$## ##& g$*# o$g$ 误差!!!! * $g$& )( $g$$ *
.*&.
第 ) 卷第 期
* $$年 # 月 !!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! ! [.Sg)$ :OOTM! VT1M$ *$$
表 !$批样品的效价测定 批号 标准曲线法 =]./D e 量反应平行线法 =]./D e 可信限下限 可信限上限 可信限率 =j *$$%$#$* %%% p* #)*$ %(& **
* $$#*$ %)) p7$ #%* *7 ((7 * *$$ ($*$* (7) p*% #)) )( %)(
* $$%$7$* %*& p#$ %7 %% (%* $ *$$ % $$()) p)& #* &7 %%* % *$$ % $$* $* p*$ %)* # (*$ *$$ ( $$##* p #$$ &7 #) 7
* $$#$)$ %** p ($% #*& $&& *# *$$ ($*$ %)$p( #7 7 ($)
* $$#$$ (*( p#$( %# 7*7 ) 平均值 %7 %$* 7 (*% #g
!!$批样品的含量测定结果显示$用标准曲线法
和量反应平行线法计算的效价的变异系数相近)
>8I分别为 )j$j) *种方法计算的效价平均值 分别为 %7单位和 %$*单位$相差 7)个蚓激酶单位) 由于量反应平行线法考虑到实验的误差$对实
验可作可靠性检验$同时可以计算效价的可信限率& 可信限范围$对误差可以控制$故建议对供试品效价 测定的统计计算方法用量反应平行线法的 &U& 法$
根据 $批样品的效价测定可信限率实验结果$对误
差的控制要求为/本法的可信限率 H` !j不得大
于 *$j)0 &U#U!样品效价限值确定!根据以上$ 批样品效
价测定结果$平均值为 %$* 蚓激酶单位=/D$可信限 下限为 7 单位$上限为 (*% 单位$同时考虑到原料 来源等因素$按平均值下浮 j作为限度$每 /D 供试品效价应不得少于 #$$蚓激酶单位) &U(!方法重复性与 * 种方法测定结果的对比 此品种在国家中药标准提高行动以及 *$$年 版药典任务时均为山西省药品检验所的起草任务$*
种测定方法均经陕西所复核并出具报告) ) 批制剂
经两所测定的结果可知$用原直接测定溶圈的方法 两所测定差异约为 #$j k%$j$用生物检定量反应
平行线法测定$两所测定误差仅为 *j) _!讨论 本研究建立了溶栓胶囊效价测定的琼脂糖4纤 维蛋白平板法$并进行了方法学验证$结果表明本法 能够快速&简便&准确地测定蚓激酶的效价$不需要
特殊的试剂和仪器$易于推广和应用) 原标准中未 用对照品$以溶圈直径表示效价$本法引入对照品$
以蚓激酶单位表示效价$同时测定了$ 批产品的效
价建立了效价限值$便于比较同类产品的活性$并且
不易受试剂和实验条件的影响) 原标准中只用纤维
蛋白原铺板测定溶圈直径$纤维蛋白用量大$溶圈不
清晰$测量困难$溶圈易受不同批次纤维蛋白原的影
响) 改用琼脂糖4纤维蛋白法后$纤维蛋白用量少$
节约成本$溶圈较清晰$测量方便准确$溶圈面积不 易受不同批次纤维蛋白原的影响) 原标准中用明胶和生理盐水提取蚓激酶$本法
经过验证后$省去明胶提取$直接用生理盐水提取$节省了试剂和成本) 本研究引入生物检定统计法的量反应平行线法 来计算效价在国内外同类检定方法中尚属首例$对
于需要采用生物活性测定来解决现在质量标准的不
足并推进中药质量标准的现代化$以及对于 *$$年 版药典中药注射剂生物活性的研究提供了一个 思路)$参考文献%
+,!国家药典委员会,溶栓胶囊,新药转正标准g第 7 册+8,,
77(#)&$, +*,!郝苏丽$张可林$徐康森,以 R39U为底物测定蚓激酶效价 +V,,药物分析杂志$77$!)#)7, +),!李剑梅$苗玉琨$李鑫,R39U法对康脂口服液中蚓激酶单位 效价的测定+V,,微生物学杂杂志$* $$&$*!)##, +&,!焦连庆$于敏$黄青,R39U法测定金龙消栓合剂中蚓激酶单 位效价+V,,中草药$*$$ $$)!&#*#%, +,!周靓$姜葵$赫荣乔,光散射法测凝血酶&水蛭素及蚓激酶活性 +V,,生物物理学报$77%$)!&#), +#,!郝苏丽$沈佳,蚓激酶生物活性检测方法的研究+V,,中国药 事$77#g$!##&$), +%,!中国药典,一部+8,,*$$ #&g
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第 ) 卷第 期
* $$年 # 月 !!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! ! [.Sg)$ :OOTM! VT1M$ *$$
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O@B@NO@N-BS/M@?.Q ,R?M/M@?.Q .PABCBSMSSN1MBOOB5\BOMQ .1 bTB1@N@B@NdMCMOA.1OMON1 O@B@NO@N-BS/M@?.QOP.C\N.S.DN-BSBOOB5O+BO
TOMQ N1 @?MO@B@NO@N-O.PA.@M1-5BOOB5,8?IG/B# R?MQTCB\NSN@5B1Q OAM-NPN-N@5.PBOOB5B--.CQ +N@? @?MCMbTNCM/M1@* R?MSN1MBCN@5CB1DM
+BO*g k& $$]$ @?M>8I.PB--TCB-5@MO@O+BO)g*j$ @?M>8I.PCMAM@N@NdM1MOO@MO@O+BO(g)j$ @?MO.ST@N.1 NOO@B\SMT1QMC& h P.C%* ?.TCO$@?MCM-.dMC5CB@M+BO7%g$j B1Q @?M>8I.PCM-.dMC5BOOB5O+BO#gj,0@AR/GI.@A#R?MBDBC4PN\CN1 ASB@MBOOB5NOCBA4 NQS5$ PMBON\SM$ON/ASM$-.1dM1NM1@B1Q B--TCB@M+B5P.CQM@MC/N1N1D@?M` T/\CTZN1BOMA.@M1-5,R?M/M@?.Q .PABCBSMSSN1MBOOB5\BOMQ .1 bTB1@N@B@NdMCMOA.1OMON1 O@B@NO@N-BS/M@?.QOP.C\N.S.DN-BSBOOB5O-B1 -.1@C.S@?MMC.C.PQM@MC/N1B@N.1, + ?^D Z@EFI,!ST/\CTZN1BOM* A.@M1-5*BDBC4PN\CN1 ASB@MBOOB5*O@B@NO@N-BS/M@?.QOP.C\N.S.DN-BSBOOB5O* ABCBSMSSN1MBOOB5\BOMQ .1 bTB1@N@B@NdMCMOA.1OMO F@.# (a_)`OR[R,,((( $责任编辑!周驰% .&&. 第 ) 卷第 期 *$$ 年 # 月
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