全 文 ：第27卷 第11期
2015年11月
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
Vol. 27, No. 11
Nov., 2015
文章编号：1004-0374(2015)11-1392-11
DOI: 10.13376/j.cbls/2015193
收稿日期：2015-02-04
基金项目：国家重点基础研究发展计划(“973”项目)(2012CB947603)；国家自然科学基金重点项目(31330004)
*通信作者：E-mail: qunhe@cau.edu.cn
生物钟蛋白质翻译后修饰的生物学功能
刘青青，王　颖，何　群*
(中国农业大学生物学院农业生物技术国家重点实验室，北京 100193)
摘　要：生物钟作为内源的分子机器调控生物体的生化反应、生理及行为各层面的活动。真核生物生物钟
运行的分子机制非常保守，都是由正调因子和负调因子构成的基于转录 /翻译的负反馈调控环来控制。泛素—
蛋白酶体途径引发的生物钟蛋白降解是生物钟调控的重要步骤。从真菌、动物到植物，基于磷酸化的生物
钟蛋白的泛素化及降解是决定生物钟周期长短的主要调控方式。尽管各物种进化出的生物钟蛋白差异较大，
它们都有效地利用了细胞中进化上非常保守的组分，如蛋白激酶、磷酸酶、泛素连接酶、去泛素酶以及蛋
白酶体等来调控生物钟的运行。
关键词：生物钟；磷酸化；泛素化；泛素连接酶；蛋白酶体；反馈调控
中图分类号：Q41　　文献标志码：A
The roles of the modifications of clock protein in the control of circadian clocks
LIU Qing-Qing, WANG Ying, HE Qun*
(State Key Laboratory of Agrobiotechnology, College of Biological Sciences,
China Agricultural University, Beijing 100193, China)
Abstract: Circadian clocks are endogenous molecular machineries that control a large number of biochemical,
physiological and behavioral activities in most eukaryotic organisms. The eukaryotic clocks are regulated by
transcription-translation negative feedback loops containing positive and negative elements. The ubiquitin-
proteasome pathway is an essential component of eukaryotic clocks by controlling the degradation rates of clock
proteins. From fungi, animals to plants, phosphorylation-dependent ubiquitination and degradation of clock proteins
play a major role in period determination in eukaryotes. Although eukaryotic organisms evolved different clock
proteins, they adapted the conserved components, such as kinases, phosphatases, ubiquitin ligases, deubiquitinases
and proteasome, to regulate the oscillation of circadian clocks.
Key words: circadian rhythm; phosphorylation; ubiquitination; ubiquitin ligase; proteasome; feedback loop
何群，中国农业大学生物学院微生物学及免疫学系教授。主要研究方向包括：
粗糙脉孢菌生物钟调控的分子遗传机制；粗糙脉孢菌表观遗传修饰影响基因表
达的机制；COP9信号体 (COP9 signalosome)调控粗糙脉孢菌生长发育的分子机
制。课题主要获得国家基金委、科技部及教育部等的资助。主讲本科生的《分
子生物学》并参与多项本科生科研训练项目。
刘青青，等：生物钟蛋白翻译后修饰的生物学功能第11期 1393
地球自转形成的昼夜交替深刻地影响了生活在
地球上的生物。如果生物能够预知时间并协调各项
生命活动，对生物个体的生存及整个物种的繁盛会
十分有利。在长期的进化中，从原核生物到真核生
物都形成了能够测量时间的分子机器——生物钟
(circadian clock)，该钟的输出就是生物的昼夜节律
(circadian rhythm)，周期约为 24 h[1-3]。
生物钟系统由输入途径、核心振荡器和输出途
径组成 (图 1)[1]。输入途径主要用来感受环境中的
光照、温度和营养等信号，并将其传送到核心振荡
器。核心振荡器接收传入的环境时间信号，在细胞
中产生内源性的昼夜节律，将时间信息传达给输出
途径，从而控制众多生命活动的周期性过程。
通过对粗糙脉孢菌、果蝇、小鼠、人和拟南芥
等生物的研究，人们对生物钟运行的分子机制有了
深入的认识 [1-2, 4-9]。它们虽然在进化上的距离较远，
但其生物钟运行的分子机制却非常保守，都是由基
于转录 /翻译的负反馈调控环构成的 [1-2, 6-8, 10]。核心
振荡器的正调控因子通常都是含有 PAS结构域的转
录因子，它们能结合到负调控因子编码基因的启动
子区域激活其表达；当负调控因子产生之后，它们
能够抑制正调控因子的转录活性，从而负反馈抑制
自身的转录 [11-15]。
生物钟蛋白的磷酸化是生物钟系统最重要的
调控方式。磷酸化是引发生物钟蛋白通过泛素 —
蛋白酶体途径降解的重要修饰。因此，生物钟蛋白
翻译后修饰及降解是决定生物钟周期长短的关键
步骤 [16-24]。
在真核细胞内，大约 80%的蛋白质是通过泛
素—蛋白酶体途径被降解的。泛素分子通过泛素
活化酶 E1、泛素偶联酶 E2和泛素连接酶 E3三个
连续的酶促反应被加到底物蛋白上 [25-29]。底物被加
上一个泛素分子后，更多的泛素分子与前一个泛素
第 48位的赖氨酸残基 (K48)形成异肽键，逐渐形
成多聚泛素链。当多聚泛素链超过四个泛素分子，
底物蛋白就被 26S蛋白酶体识别并降解 [30]。泛素连
接酶 E3决定了待降解蛋白的特异性。
尽管各物种进化出的生物钟蛋白差异较大，但
它们有效地利用了细胞中非常保守的组分，如蛋白
激酶、磷酸酶、泛素连接酶、去泛素酶以及蛋白酶
体等来调控生物钟的运行 (图 2)。
1　蛋白质翻译后修饰在粗糙脉孢菌生物钟调
控中的作用
粗糙脉孢菌由于其分生孢子产生具有显著的
节律性成为研究生物钟的最佳模式生物之一。其
核心振荡器由WHITE COLLAR-1 (WC-1)、WHITE
COLLAR-2 (WC-2)、 FREQUENCY (FRQ) 和 FRQ
interacting RNA helicase (FRH)组成，其中WC-1和
WC-2是正调控因子 [12, 31]，FRQ和 FRH是负调控
生物钟系统由三个相对独立的部分组成：输入途径(响应外界环境信号，如光、温度和营养等)、核心振荡器(接收信号，产生
内源性昼夜节律)、输出途径。
图1 生物钟系统模式简图
生命科学：生物钟专刊 第27卷1394
因子 [16, 18, 32]。WC-1和WC-2是两个含有 PAS结构
域的 GATA型转录因子，它们通过各自的 PAS结
构域互作形成 WC复合体 (WC complex, WCC)。在
黑暗条件下，WC复合体周期性地结合到 frq基因
启动子的C-box (clock-box)上，激活 frq基因的转录。
在细胞质中，新生成的 FRQ蛋白互作形成同源二
聚体，并与 FRH形成 FFC复合体。当积累到一定
量之后，FFC复合体进入细胞核中，并迅速抑制
WC复合体的转录活性，从而关闭 frq基因的转录。
FFC复合体通过与WC复合体直接互作、介导激酶
对其磷酸化以及促进WC复合体从 frq DNA上解离
并向细胞质转移等方式抑制WC复合体的活性 [31-34]。
随着时间的推移，当 FRQ蛋白降低到不足以抑制
WC复合体的水平，其对WC复合体的抑制解除，
frq基因的转录重新被激活，从而开始新一轮的循环，
由此产生了粗糙脉孢菌的昼夜节律 [35]。因此，FRQ
蛋白的产生、积累和降解对于粗糙脉孢菌转录 /翻
译的负反馈调控环路非常重要。
粗糙脉孢菌、果蝇和小鼠的核心振荡器都是基于自我调控的负反馈调控环。这些负反馈调控环都是由正调控因子和负调控因
子组成，所有的正调控因子都是含有PAS结构域的转录因子。正调控因子都能直接结合到负调控因子基因启动子区域激活其
转录。负调控因子通过与正调控因子相互作用或者促进其磷酸化的方式抑制它们的转录活性。在抑制阶段的末期，负调控因
子的磷酸化促进其进入泛素-蛋白酶体降解途径，从而解除对正调控因子转录的抑制，开启新一轮循环。
图2 真核生物核心振荡器的保守性
刘青青，等：生物钟蛋白翻译后修饰的生物学功能第11期 1395
1.1　磷酸化修饰在粗糙脉孢菌生物钟调控中的作用
在持续黑暗条件下，FRQ蛋白的总量和磷酸
化水平呈现明显的昼夜节律。FRQ蛋白的状态和量
决定了粗糙脉孢菌生物钟周期的长短。FRQ蛋白含
有众多结构域：CC结构域 (coiled-coiled domain)介
导FRQ蛋白形成同源二聚体，FCD结构域 (FRQ-CKI
interacting domain)介导 FRQ与激酶 CKI之间的互
作，FFD结构域 (FRQ-FRH interacting domain)介导
FRQ与 FRH的互作，PEST-1/2结构域与 FRQ稳定
性有关 [36]。FRQ蛋白合成后立即被磷酸化，磷酸
化水平随时间逐渐升高。FRQ的磷酸化水平也呈现
周期性的变化，这说明其磷酸化受到精确调控，并
具有生理功能。FRQ蛋白至少有 75个位点能够发
生磷酸化，这些位点分散在 FRQ的每一个区域。
磷酸化是决定FRQ蛋白降解速率的主要因素 [37]，
也是决定周期长短的重要因素，如 PEST-1结构域
缺失或者其中一些磷酸化位点的突变导致 FRQ蛋
白磷酸化水平降低、降解速率减慢、分生孢子形成
节律丧失 [19]。大多数位点的磷酸化促进 FRQ的降
解，一些发生在 FRQ C端的磷酸化则会抑制其降
解 [37-38]。磷酸化还能影响 FRQ蛋白的功能和细胞
定位。新生成的 FRQ磷酸化水平低，主要定位于
细胞核，其作用是抑制WCC的活性；高磷酸化的
FRQ主要定位于细胞质，能促进WCC组装从而维
持WC-1的水平 [39-41]。
FRQ的磷酸化调控具有明显的时序性。位于
PEST-1和 FFD结构域之间的部分首先被磷酸化，
此区域的磷酸化位点突变不影响分生孢子的昼夜节
律。随后是 C端，该区域的磷酸化抑制 FRQ的降解。
在昼夜节律的中期，PEST-1被迅速磷酸化，从而
促进 FRQ的降解。最后被磷酸化的是 large FRQ特
有的 N端序列，也促进 FRQ降解 [36, 42]。
FRQ的磷酸化受到众多蛋白激酶和磷酸酶的
精确调控。casein kinase-1a (CK-1a)[43]、casein kinase-2
(CKII)[16]、calmodulin kinase (CAMK-1)[31]、cyclic
AMP-dependent protein kinase A (PKA)[38] 和 check
point kinase 2 (PRD-4/chk2)[44]都参与FRQ的磷酸化。
CK-1a和 CKII对 FRQ的磷酸化促进其降解，相反，
PKA介导的磷酸化抑制 FRQ降解。PRD-4/chk2负
责 DNA损伤之后的 FRQ的磷酸化 [44]，而 CAMK-1
介导光诱导过程 FRQ的磷酸化。
已知有3个磷酸酶PP1 ( protein phosphatase 1)[45]、
PP4(protein phosphatase 4)[46]、PP2A (protein phos-
phatase 2A)[45]参与 FRQ蛋白磷酸化的负调控。在
ppp-1 (PP1的催化亚基 )、rgb-1 (编码 PP2A催化亚基 )
或者 pp4 (PP4的催化亚基 )突变体中，FRQ磷酸化
水平增高，分生孢子形成节律周期变短，相位前移 [45]。
WC-1蛋白上至少有 10个磷酸化修饰位点 [42, 47-48]，
5个紧邻 DNA结合结构域位点 (Ser988~Ser995)的
磷酸化抑制WC-1的转录活性。光处理 15 h之后，
WC-1处于高磷酸化状态，导致WCC转录活性降
低和WC-1的降解 [48]。双向电泳显示WC-2蛋白至
少存在 8个磷酸化位点 [40]， WC-2 Ser433位点的磷
酸化是质谱分析确定的 [42, 47]。将WC-2 S433突变为
丙氨酸 (Ala)导致WCC转录活性升高，分生孢子形
成节律周期变短 [40]。低磷酸化时，WCC的转录活
性高；而高磷酸化时，WCC的转录活性低。在持
续黑暗条件下，WC-1和WC-2的磷酸化水平呈现
周期性的变化，对 frq转录激活和转录抑制交替进行。
WC-1和WC-2的磷酸化受到 PKA[38]、CK-1a[43, 49]、
CKII[43]、PKC[50]等蛋白激酶和 PP1、PP4、PP2A等
磷酸酶的双向调控 [45-46]。在磷酸化过程中，PKA可
能起始WC-1和WC-2的磷酸化，进而促进依赖于
FRQ的 CK-1a和 CKII催化的磷酸化 [38]。
1.2　泛素化修饰在粗糙脉孢菌生物钟调控中的作用
高磷酸化 FRQ蛋白的降解是经泛素—蛋白
酶体途径进行的。泛素连接酶 SCFFWD-1识别高磷
酸化的 FRQ并对其进行泛素化 [51-52]。泛素连接酶
SCFFWD-1由支架蛋白 Cullin1、RING结构域蛋白 Rbx1、
接头蛋白 Skp-1和底物募集蛋白 FWD-1组成。FWD-1
是一个含有 F-box和WD40结构域的蛋白，它利用
F-box结构域与接头蛋白 Skp-1结合，通过WD40
结构域募集底物蛋白 FRQ。在 fwd-1突变体中，
FRQ磷酸化程度极高但不能降解，而且分生孢子形
成昼夜节律完全丧失，说明 SCFFWD-1介导的泛素化
对于 FRQ降解以及生物钟运行是必需的。FRQ蛋白
能与缺少 F-box结构域的 FWD-1结合说明 SCFFWD-1
介导的 FRQ泛素化过程是非常迅速的。SCFFWD-1泛
素连接酶调控的 FRQ 降解又受到 COP9 信号复
合体 (CSN)的精确调控 [52-53]。
目前，调控WC蛋白泛素化的 E3仍然不清楚。
2　蛋白质翻译后修饰在果蝇生物钟调控中的
作用
果蝇生物钟核心振荡器也是由转录 /翻译的负
反馈调控环构成。含有 PAS结构域的转录因子
CLOCK和 CYCLE是果蝇核心振荡器的正调控因
子，PERRIOD (PER)和 TIMELESS (TIM)是负调控
生命科学：生物钟专刊 第27卷1396
因子。CLOCK/CYCLE (CLK/CYC)异源二聚体周
期性地结合到 per和 tim的启动子上，激活它们的
转录。新生成的PER和TIM互作形成蛋白质复合体，
反过来抑制 CLK/CYC的转录活性，从而关闭自身
的转录。除了激活 per和 tim外，CLK/CYC还能激
活 VRI和 PDP1的表达。VRI和 PDP1是另外两个
转录因子，VRI抑制 clock基因的表达，而 PDP1
则促进其表达。PER和 TIM降解之后，对 CLK/
CYC的抑制解除，重新开始新一轮的转录 [54-56]。
2.1　磷酸化修饰在果蝇生物钟调控中的作用
与粗糙脉孢菌极为相似，磷酸化是决定 PER
和 TIM蛋白降解速率的主要因素，也是决定果蝇
生物钟周期长短的重要因素。PER蛋白合成之后会
立即被磷酸化，随着时间推移，磷酸化水平逐渐升
高。PER的磷酸化水平也呈现周期性的变化，这说
明 PER的磷酸化受到精确调控，并具有重要生理
功能。PER 和 TIM蛋白在 DOUBLE TIME (DBT)
CK1ε[20]、CK2[57]、NEMO[58]和 GSK3[23]的作用下被
逐渐磷酸化 [56]。同时，PER和 TIM的磷酸化状态
又受到磷酸酶 PP2A和 PP1的调控 [59]。PER和 TIM
蛋白的磷酸化能加速它们的降解。细胞核内磷酸化
的 PER能够诱导 CLOCK的磷酸化，进而从染色质
上解离；随着 PER蛋白在清晨降解，CLK/CYC依
赖的转录重新开始。
2.2　泛素化修饰在果蝇生物钟调控中的作用
2.2.1　SCFSlimb在黑暗条件下调控PER和TIM蛋白的
泛素化和降解
Slimb蛋白能够募集磷酸化的底物蛋白通过蛋
白酶体途径降解 [60-61]。slimb基因编码一个含有F-box
和WD40结构域的蛋白。在 Hedgehog和Wingless
信号转导途径中，Slimb蛋白负责调控转录因子蛋
白的水平。slimb突变体果蝇的昼夜节律完全丧失，
异位表达野生型的 Slimb能够完全补救节律缺陷表
型 [60]；同样，过表达 dominant-negative的 Slimb也
造成节律丧失表型 [60-61]。这些遗传学结果证明，
Slimb蛋白是果蝇生物钟的必需组分。生化实验显
示，当 Slimb下调表达后，在黑暗条件下，高磷酸
化的 PER和 TIM不能被降解 [60-61]。Slimb与 PER
的互作证明其作为 SCFSlimb复合体的底物募集亚基
调控 PER和 TIM进行泛素化并通过蛋白酶体降解。
2.2.2　SCFJET调控光诱导的TIM和CRY蛋白的泛素
化和降解
两个研究小组获得的果蝇突变体 jetlag[62]和
Veela[63]在持续光照条件下展现出很强的节律性。
野生型果蝇在持续光照条件下 1~2 d后就会丧失节
律性，而这些突变体经历 1周的持续光照仍能维持
节律 [63-64]。在完全黑暗条件下，突变体与野生型表
型却一致。突变体展示出的表型与之前获得的果蝇
光受体突变体 cry的表型极其相似，说明突变的基
因参与果蝇光诱导途径的调控。在光照条件下，
CRY与 TIM互作并引起后者的降解。jetlag基因编
码一个含有 F-box和 leucine-rich repeats结构域的蛋
白，可能也是 SCF型泛素连接酶底物识别亚基。在
短时光照引起的相位迁移反应测试中，突变体相位
迁移与野生型相比明显降低 [62-63]，说明 JETLAG蛋
白参与调控 TIM的降解。尽管在黑暗条件下 JETLAG
对 TIM蛋白水平影响很小，但暴露在光下时，
JETLAG会迅速降低 TIM蛋白水平。JETLAG能够
与 TIM互作，并在 CRY蛋白存在时促进 TIM蛋白
的泛素化 [62]。与 SCFSlimb不同，SCFJET泛素连接酶
特异性调控光依赖的TIM的泛素化和降解 [64]。因此，
JETLAG E3连接酶介导 TIM和 CRY的泛素化，响
应光诱导的降解，以预见并重新设定时相。
2.2.3　Cullin-3参与调控TIM的振荡
由于 Slimb不能单独调控 PER和 TIM稳定性
的全部过程，其他类型的泛素连接酶复合体也可能
参与它们稳定性的调控。降低表达 Cullin-3蛋白引
起 rest-activity节律的缺陷，说明 TIM振荡丧失。
生化实验证实，Cullin-3能够与低磷酸化的 TIM形
成复合体，尤其在 PER缺失情况下，暗示 Cullin-3
参与 TIM蛋白在夜晚积累的调控 [65]。
由此可见，果蝇至少具有 3种机制来调控 TIM
蛋白水平。其中两种调控机制利用不同的 F-box蛋
白作为 SCF型复合体的底物识别亚基。Slimb在生
物钟控制中使用，而 JETLAG是在光诱导过程中使
用。Slimb和 JETLAG都属于 SCF型泛素连接酶的
底物募集亚基 [66]。非常有趣的是，JETLAG依赖的
蛋白质降解又受到 COP9复合体的调控，而 Slimb
依赖的蛋白质降解并不受该复合体调控 [67]。
3　蛋白质翻译后修饰在哺乳动物生物钟调控
中的作用
哺乳动物主生物钟位于下丘脑视交叉上核
(suprachiasmatic nucleus, SCN)，与外周器官 (如肝
脏和肾脏 )的副钟协同调节各种生理节律，包括睡
眠 /觉醒、激素分泌、体温维持以及摄食等。小鼠
生物钟是正负反馈环路相互作用的结果，此环路推
动生物钟基因 mRNA和蛋白质周期性表达。正调
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控因子 CLOCK和 BMAL1形成异二聚体结合到生
物钟基因的 E-box上，驱动三种 Per基因 (Per1、
Per2和Per3)和两种Cry基因 (Cry1和Cry2)的转录。
生成的 PER和 CRY蛋白在细胞质中积累，并形成
PER/CRY复合物，进而被 CKIε、GSK3β等蛋白激
酶磷酸化，磷酸化的 PER和 CRY蛋白可以转运回
细胞核内。在核内，PER和 CRY作为负调控因子
直接与 CLOCK/BMAL1互作，并抑制 Per和 Cry
基因的转录，关闭负反馈环路。在抑制阶段的末期，
PER和 CRY的降解解除对 CLOCK/BMAL1转录激
活的抑制作用，重新开始新一轮的转录 [55]。除负反
馈调控环路外，小鼠还有与之嵌套的调控环路：在
CLOCK/BMAL1异二聚体激活 Per和 Cry转录的同
时也激活核内受体 Rev-Erbα基因的转录，生成的
REV-ERBα蛋白反过来可以抑制 Bmal1的转录，结
果导致 Bmal1 mRNA水平下降，PER和 CRY水平
升高 [68]。当 CRY蛋白进入核内抑制 Per和 Cry的
转录时也抑制Rev-Erbα。当Rev-Erbα表达受抑制时，
ROR可提供 Bmal1转录的正反馈驱动 [69]。
3.1　磷酸化修饰在哺乳动物生物钟调控中的作用
在哺乳动物中，CKI、CK2、GSK3和 AMPK
(adenosine monophosphate-activated protein kinase)等
蛋白激酶也参与生物钟的调控 [70]。PER蛋白的周期
性磷酸化是哺乳动物生物钟的重要特征，也是正常
生物钟周期维持的保障。CKI是负责 PER蛋白磷酸
化的重要激酶，CKI突变后导致生物钟周期变短 [71]。
CK2在哺乳动物中的底物是 PER2和 BMAL1，CK2
对 PER2 蛋白 Ser10、Thr12、Ser13 和 Thr15 位点
的磷酸化对 PER2起稳定作用 [72]，对 Ser53的磷酸
化则使 PER2的稳定性下降 [73]。CK2通过对 BMAL1
Ser90的磷酸化促进其入核。GSK3β能够磷酸化
CLOCK、BMAL1、CRY2 和 PER2 等。CLOCK、
BMAL1和CRY2被GSK3β磷酸化后会加速降解 [74-76]。
AMPK是最近发现的磷酸化 CRY蛋白的激酶 [77]。
在小鼠肝脏细胞中，AMPK的活性和核定位呈现出
周期性变化：在日间，AMPK在细胞核中积累并被
liver kinase B1 (LKB1)激活，从而磷酸化 CRY的
Ser71和 Ser280残基，促进 CRY蛋白的降解；在
夜间，AMPK在细胞核内的积累量减少，活性降低，
导致 CRY蛋白在核内累积 [77]。
3.2　泛素化修饰在哺乳动物生物钟调控中的作用
3.2.1　磷酸化的PER蛋白通过泛素—蛋白酶体途径
降解
与粗糙脉孢菌和果蝇的调控方式相似，哺乳动
物中磷酸化的 PER蛋白能够被泛素连接酶 SCFβ-TrCP
识别并多聚泛素化，随后通过蛋白酶体途径降解。
β-TrCP是 FWD-1和 Slimb在哺乳动物中的同源蛋
白。CKIε可与 PER1和 PER2形成稳定复合体调控
其磷酸化，是促进 PER通过泛素—蛋白酶体途径
降解的重要激酶 [78]。β-TrCP1和 β-TrCP2是磷酸化
依赖型的 SCF泛素连接酶底物识别亚基，它们能特
异性地与高磷酸化的 PER互作 [79-81]。如果在细胞
中表达 dominant-negative的 Cullin1或 β-TrCP，CKIε
介导的 PER1和 PER2的降解将会受阻，说明 PER
蛋白通过泛素—蛋白酶体途径降解。在细胞系中用
RNAi方法敲减 β-TrCP1和 β-TrCP2蛋白后，磷酸
化 PER1的降解也会受阻。因此，SCFβ-TrCP通过调
控磷酸化的 PER1和 PER2的泛素化和降解来维持
哺乳动物生物钟的正常运转。
3.2.2　CRY蛋白通过泛素—蛋白酶体途径降解
虽然 PER和 CRY都是哺乳动物负反馈调控环
路的必需组分，但是 CRY是核心振荡器的限速抑
制因子。因此，CRY的周期性表达和降解需要更为
精细的调控 [82]。通过生化和遗传学方法，研究者找
到了第一个 CRY蛋白泛素连接酶底物识别亚基——
FBXL3[83-85]。 它 是 一 个 含 有 F-box 和 leucine-rich
repeats结构域的蛋白。在亲和纯化过程中 FBXL3与
CRY1和 CRY2存在于一个复合体中，敲减 FBXL3
的细胞中 CRY蛋白的稳定性增强，并扰乱 Cry和
Per基因的周期性表达，这暗示 CRY蛋白可能是
FBXL3泛素化的底物 [83]。
正向遗传筛选也得到了 FBXL3突变的小鼠。其
中一个研究小组获得的突变小鼠 Afterhours的生物钟
周期大约为 26.5 h，长于野生型小鼠的 23.6 h[84]。基
因定位以及测序结果表明， Afterhours小鼠的 Fbxl3
基因发生 Cys358Ser点突变，导致 CRY蛋白的降
解速率减缓，Per2基因的表达受到影响，生物钟周
期变长。另一小组获得的突变小鼠 Overtime (Ovtm)
也是 Fbxl3基因第 364位的 Ile突变为 Thr[85]。OVTM
和 FBXL3都可以与 CRY蛋白互作介导 CRY蛋白的
降解，表明 FBXL3具有特异识别并泛素化 CRY的
作用 [86-87]。
泛素连接酶复合体 SCFFBXL21是第二个通过泛
素化 CRY蛋白来调控生物钟的 E3[88-89]。Past-time
(Psttm)是通过 ENU诱变筛选到的突变小鼠，其生物
钟周期 (22.91 h)短于野生型小鼠 (23.67 h)。这一表
型是由于另一个含有 F-box结构域的蛋白 FBXL21
上第 149位的 Gly突变为 Glu引起的。FBXL21的敲
生命科学：生物钟专刊 第27卷1398
减对核内外 CRY蛋白的稳定性产生了不同的影响：
细胞核内 CRY蛋白的降解速率加快，而细胞质中
CRY蛋白的降解则减缓。与 FBXL3只存在于细胞
核内不同，FBXL21在核内外均有分布，虽然 FBXL21
结合 CRY的能力比 FBXL3强，但降解 CRY的能
力却比 FBXL3弱 [88]。这表明 SCFFBXL21泛素连接酶
具有双重功能：在核内，FBXL21与 FBXL3竞争
结合 CRY，从而减弱了 FBXL3对 CRY的泛素化和
降解作用；在核外，FBXL21起缓慢泛素化和降解
CRY蛋白的作用。因此，两种泛素连接酶之间的这
种拮抗关系和作用方式对于维持 CRY蛋白稳定与
降解的平衡具有重要意义。
4　蛋白质翻译后修饰在高等植物生物钟调控
中的作用
一个调节精准的生物钟对于植物的光合作用、
生长发育和产量来说是必需的 [90]。高等植物生物钟
核心振荡器主要由 CCA1 (circadian clock associated 1)、
LHY (late elongated hypocotyl) 和 TOC1 (timing of
cab expression 1) 三种蛋白构成，其中，CCA1和
LHY是含有Myb结构域的转录因子。这三个蛋白之
间形成一个负反馈环路：TOC1激活 CCA1和 LHY
基因的表达，而CCA1和LHY反馈抑制TOC1的表达。
PHYB和 PIF3 (phytochrome interacting factor 3)复合
体结合到 CCA1和 LHY启动子的 G区上，激活
CCA1和 LHY转录。CCA1和 LHY结合到 TOC1启动
子的“夜间元件”(AAAATATCT)上，负调节 TOC1
基因的转录。当 TOC1的含量增加时促进 CCA1和
LHY的转录，当CCA1和LHY的含量相应地增加时，
又会反过来抑制 TOC1的转录，由此形成的转录负
反馈环路使时间节奏不断地被重新设置 [91]。
除了上述转录反馈调控环路以外，植物生物钟
及其相关信号转导通路的蛋白也能够被磷酸化和泛
素化修饰，这些蛋白质翻译后修饰在高等植物生物
钟调控机制中具有重要作用。
4.1　磷酸化修饰在高等植物生物钟调控机制中的作用
在真菌、果蝇以及哺乳动物中，激酶和磷酸酶
信号级联通路已经成为调控生物钟蛋白活性与稳定
性的重要机制 [55]。蛋白激酶 CK2也参与拟南芥生
物钟的调控过程 [92]。CK2是一种非常保守的 Ser/
Thr蛋白激酶，由两个调节亚基 α和两个催化亚基
β组成，形成 α2β2异四聚体。CK2可以磷酸化包括
转录因子在内的许多底物 [93]。CK2对 CCA1的磷
酸化是其行使正常功能所必需的。在 ckα1α2α3三
突变体中，由于缺失了 3个 CK2α核定位亚基，导
致 CCA1蛋白累积、磷酸化水平降低 [94]。CK2的 β
亚基对生物钟的调控也十分重要。CKB3是 CK2的
一个调节亚基，可与 CCA1互作使其磷酸化。过表
达 CKB3能导致生物钟周期变短，并且 CKB3有
利于 CCA1结合到 CHLOROPHYLLA/B BINDING
PROTEIN 1 (CAB1)的启动子区域。CK2的另一调
节亚基 CKB4的磷酸化呈周期性变化，磷酸化的
CKB4将导致自身的降解，从而降低 CK2的活性。
与过表达 CKB3相似，过表达 CKB4同样会使生物
钟周期变短。过表达 CKB4的植株中，生物钟输出
信号和核心钟蛋白表达水平的改变说明 CKB4与核
心振荡器密切相关 [95]。
4.2　泛素化修饰在高等植物生物钟调控机制中的作用
在拟南芥中，已发现多个 ZEITLUPE (ZTL)家
族蛋白与生物钟系统有关。它们的特点是都含有一
个 F-box结构域，暗示它们可能通过 SCF型泛素连
接酶复合体的形式行使功能 [96]。在 ztl-1突变体中，
TOC1与 ZTL的相互作用消失，导致 TOC1蛋白持
续表达。ZTL能够与 TOC1和 PRR5蛋白相互作用，
介导它们通过蛋白酶体途径降解。因此，ZTL介导
的 TOC1蛋白的降解对生物钟周期的精确调控具有
重要意义。
维持 TOC1蛋白的稳定和降解平衡的机制非常
复杂 [97-99]。TOC1 (PRR1)是伪反应调控因子 (pseu-
doresponse regulator, PRR)家族成员之一，与其他 4
个 PRR共同参与植物生物钟调控 [100-101]。PRR9、
PRR7、PRR5、PRR3和 TOC1每隔 2~3 h相继表达，
PRR9在黎明时开始表达，直到夜间 TOC1才表达。
而且，这 5个 PRR都可以被磷酸化并对生物钟产
生不同的影响。PRR3和 TOC1的磷酸化会促进两
者的互作，从而保护 TOC1不被 ZTL识别和降解，
然而，PRR3稳定 TOC1的机制尚不清楚 [98]。PRR5
与 TOC1结合也起到稳定 TOC1的作用，但 PRR5/
TOC1的互作不依赖于两者的磷酸化状态。它们的
互作还可以促进 TOC1在核内的积累，能使两者与
胞质中的 ZTL形成空间上的隔离，暗示 PRR5可能
会影响 ZTL对 TOC1的降解，这一情况与 PER/
TIM、CLK/CYC以及 PER2/CRY的互作非常相似 [102]。
与 PRR5 的结合能促进 TOC1 的磷酸化，增强
TOC1与 ZTL的相互作用。PRR5的磷酸化也促进
其与 ZTL的相互作用并被泛素化，导致最终被降解。
遗传学数据已证实 ZTL是负责降解 TOC1和
PRR5的主要 F-box蛋白。在植物中，ZTL还有两
刘青青，等：生物钟蛋白翻译后修饰的生物学功能第11期 1399
个类似物：LKP2 (LOV和 KELCH PROTEIN 2)[103]
和 FKF1 (FLAVIN、KELCH、F-BOX 1)[104]。 它 们
都含有 1个 PAS结构域、1个 F-box和 6个重复的
kelch结构域，因此，也可能组成 SCF型泛素连接酶。
fkf1或者 lkp2的单基因缺失突变对生物钟的影响并
不大，但是 ztl fkf1双突变体和 ztl fkf1 lkp2三基因
突变体则显著影响了植物生物钟的功能，表明
LKP2和 FKF1能够靶向作用于 TOC1和 PRR5，并
介导它们的泛素化和降解 [105]。
PRR7和 PRR9蛋白作为 CCA1和 LHY的负调
控因子在“morning loop”中起作用。在日间，随
着时间的推移，PRR7和 PRR9逐渐被磷酸化，这
一进程与 PRR5和 TOC1的磷酸化一致 [98]，暗示
PRR7和 PRR9的磷酸化也会导致它们的泛素化和
降解。然而，至今尚未找到负责 PRR7和 PRR9泛
素化的 F-box蛋白或其他类型的泛素连接酶。
[参　考　文　献]
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