全 文 ：阿维菌素 B1a组分高产菌株的诱变育种
任超1* 马 玻2
( 1天津现代职业技术学院,天津 300222; 2河北职工医学院,保定 071000)
摘 要: 目的 了解阿维菌素产生菌 S. av ermitilis 的生长特性, 提高产生菌 B1a组份的产量。方法 采用紫外
线( UV )、诱变剂氯化锂( L iCl) , 亚硝基胍( NTG )并结合甲硫氨酸 ( Met)诱导等手段对出发菌株 S. avermitil is
H0065 进行诱变处理, 初筛、复筛。结果 筛选获得总效价达到 4524. 3Lg / ml的高产阿维菌突变株 N-3-133, 其中 B
组分含量显著提高且高达 85. 3% , B1a也显著提高达到 2533. 6Lg/ ml。结论 采用紫外线及亚硝基胍诱变方法,结合
甲硫氨酸诱导筛选,与出发菌株相比可以获得阿维菌素总效价及 B1a组分显著提高的菌株。
关键词: 阿维菌素 B1a 诱变 效价 高产菌株
Mutagenesis and Screening of high Avermectin B1a Producing
Strains from Strep tomyces Avermitilis
Ren Chao
1* Ma Xiangbo2
( 1 T ianj in Mod er n Vocational Te chnology Col l ege , T ianj in 300222;
2H ebei Med ical Col leg e f or Continuing ed ucat ion , Baoding 071000 )
Abstract: Objectiv e : Study t he chatacter istics o f av ermectin pr oducing str ains and improve avermectin B1ay ield
of Str ep tomyces avermitilis . Method: U V , L iCl and NTG were used as mutagen in t reating or ig ina l str ain H0065,
including inducing by methionine. Results: The high-yield avermect in strain N-3-133 w ith avermectin to tal titer up to
4524. 3 ug/ ml was obtained, among them st rain N-3-133 also w as confirmed being a stable high-y ield avermectin B
producer which produced 85. 3% avermectin B, also was avermectin B1a titer w ith up to 2533. 6Lg/ ml. Conclusion: I t
is a effective w ay to obt ain high-y ield avermect in and B1a producer compared w ith the or ig ina l str ains by using UV
and NTG as mutagen, Met as inducer .
Key words: Avermectin B1a Mutagenesis T iter H igh avermectin producing str ain
阿维菌素的产生菌是阿维链霉菌( St reptomyces averm it ilis) ,该菌株是 1975年日本北里研究所( Kita-
sato Inst itute)从日本静岗县地区的一个土壤样品中分离得到的。研究初期就发现该菌株的发酵液具有很
高的驱肠道寄生虫活性, 后来这菌株被送到美国默克( Merck)公司做进一步研究。1976年,美国默克公司的
科研人员分离也这组具有驱虫活性的物质,并将其命名为 Avermect ins[ 1]。经鉴定阿维链霉菌( St reptomy-
ces averm it ilis)属于十六元大环内酯类抗生素产生菌。阿维菌素是由阿维链霉菌产生的一类结构相似的混
合物,共有 8个组分,分别命名为 A1 a、A1 b、A 2a、A 2b、B1a、B1b、B2a和 B2b。其中 A 1a、A 2a、B1 a和 B2a为 4个大量组
分,含量在 80%以上; A1 b、A 2b、B1b和 B2b为 4个少量组分, 含量在 20%以下,结构见图 1。
其中 B1的的杀虫活性最高,而毒性最小。近些年众多科研工作者通过诱变等手段改造菌种的遗传特
性,提高阿维菌素有效组分 B1比例。其中大村智及 Ikeda 在这方面做出了很多杰出的贡献[ 2]。目前阿维菌
素B1a (大于 80%)和 B1b (小于 20% )混合物( Abamect in)阿巴菌素等用于畜牧抗虫和农业上的杀螨及选择性
的杀虫剂。
收稿日期: 2005-06-20
作者简介:任超( 1971- ) ,男,安徽省安庆市人,天津现代职业技术学院教师
生物技术通报
#研究报告# BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 4期
1 材料和仪器
1. 1 菌种
阿维链霉菌 S. av ermi t il is H0065, (由河北大学微生物研究所提供) ,菌株 N-3-93(由 H0065经紫外诱
变获得) , N-3-103(由 NT G诱变获得) ,菌株 N-3-133(由甲硫氨酸平板筛选获得)。
图 1 阿维菌素结构图
表 1 阿维菌素各个组份的不同基团
Avermect ins R1 C22-C23 R 2
A1a CH3 CH = CH C2H5
A 1b CH3 CH = CH CH 3
A2a CH3 CH 2-CH( OH ) C2H5
A 2b CH3 CH 2-CH( OH ) CH 3
B1a H CH= CH C2H5
B1b H CH= CH CH 3
B2a H CH 2-CH( OH ) C2H5
B2b H CH 2-CH ( OH) CH 3
1. 2 试剂
生理盐水, 亚硝基胍( NT G) , 磷酸缓冲液 ( pH 6. 0) , 甲硫氨酸 ( M et ) , 丙酮(分析纯) , 乙酸乙酯(分析
纯) , 无水甲醇(色谱纯及分析纯) , GF254硅胶粉, 三氯甲烷(分析纯) ,二氯甲烷(分析纯)。
1. 3 培养基
斜面和分离培养基( g/ L ) : 可溶性淀粉 10, ( NH 4 ) 2SO 4 2. 5, NaCl 0. 6, M gSO 4 # 7H2O 1. 2, K 2HPO 4 #
3H 2O 3. 0, CaCO 3 3. 0, 琼脂粉 20, pH 7. 2~ 7. 4, 用蒸馏水配制。
种子培养基( g / L ) :玉米淀粉25,花生饼粉10,黄豆饼粉8. 0,酵母粉 5. 0,酵母膏 5. 0,玉米浆 4. 0, CoCl2
# 6H 2O 0. 003,淀粉酶 0. 0025, pH7. 0~ 7. 2. 用自来水配制。
发酵培养基( g / L ) :玉米淀粉70,花生饼粉10,黄豆饼粉8. 0,酵母粉 5. 0,酵母膏 3. 0,玉米浆 2. 2, CoCl2
# 6H 2O 0. 003,淀粉酶 0. 0025, pH7. 0~ 7. 2. 用自来水配制。
1. 4 诱变及筛选方法
1. 4. 1 紫外线、氯化锂复合诱变 取制备好的菌悬液 5 ml移入直径为 90 mm 的无菌培养皿中, 放入无菌
磁力搅拌棒,置于磁力搅拌器上,在功率为20 W,波长为 254 nm 的紫外灯下 30 cm 处,打开皿盖边搅拌边照
射, 剂量分别为 5 s, 20 s, 35 s, 50 s, 60 s, 75 s, 90 s,可以累积照射, 也可以分别照射不同时间。取不同照射
时间段的菌悬液 1 m l, 进行 10- 1 , 10- 2 , 10- 3 , 10- 4 , 10- 5 , 10- 6 , 10- 7梯度稀释,取 10- 3 , 10- 5 , 10- 7浓度的稀
释液各 0. 1 ml, 另加无菌 0. 01mo l/ L LiCl 溶液 0. 1ml, 涂布于分离平板上, 用黑纸包严, 28 e 倒置培养
7~ 9 d。
1. 4. 2 亚硝基胍( N TG)诱变 用 0. 1 mol, pH 6. 0的磷酸缓冲液制备孢子悬液, 使其浓度约为 108个/ m l,
分别用 1 mg / ml, 2 mg/ m l, 3 mg / ml, 4 mg/ m l浓度的 NT G 处理紫外诱变后的突变株单孢子悬液, 于
28 e 震荡 30 min后, 用生理盐水离心洗涤孢子 3次,经稀释后涂布于分离平板, 28 e 倒置培养 7~ 9 d。
1. 4. 3 甲硫氨酸( M et)平板筛选 将一定量的氯化铯( CsCl)溶于蒸馏水中灭菌后加入到分离培养基中,制
备成终浓度分别为 3 mg/ m l, 6 mg / m l的分离平板。将诱变处理后的孢子涂布于含 CsCl 的分离平板上,
60 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 4期
28 e 倒置培养 7~ 9 d[ 3] 。
1. 5 摇瓶发酵
从平板上挑取灰色丰满的单菌落, 转接于斜面, 28 e 培养 7~ 9 d.待长出丰富的灰色孢子后, 转接于种
子培养液, 220 r/ m in, 28 e 摇床培养 28~ 30 h, 接种 5 %于发酵培养液( 250 ml三角瓶,装 50m l发酵液) ,
220 r/ m in, 28 e 摇床培养 7~ 9 d,放瓶测定效价。
1. 6 效价测定 层析法分离纯化, HPLC法测定效价
取发酵液 5 ml, 3 000 r/ min,离心 10 min,弃上清。加入丙酮 2 ml,在旋涡式混合器上振荡 1 m in, 静置
10 min, 重复 3次。加入乙酸乙酯 3 m l,振荡 1 m in, 3 000 r/ min, 离心 10 m in,上清液备用。
吸取 40Ll上清液点样于 GF254硅胶板上,然后层析。展层剂为:乙酸乙酯: 三氯甲烷: 二氯甲烷:无水
甲醇= 9: 9: 2: 1。层析后在紫外灯下观察,将斑点处硅胶刮入离心管中,加入 2 ml无水甲醇,在旋涡式混合
器上振荡 1 min,静置 10 min后 3 000 r/ m in,离心 10 min。
HPLC分析采用 C18反向柱,流动相为无水甲醇:水= 85: 15,流速 1 ml/ m in,检测波长 244. 6 nm。准确
吸取 5. 0 Ll样品滤液进样,根据各组分的峰面积, 对照标准曲线计算其含量,各组分之和即为总发酵单位。
2 结果
2. 1 紫外线、氯化锂复合诱变
经紫外线、LiCl复合诱变、培养后, 活菌计数,计算诱变后的正突变率及孢子致死率,结果如表 2。
实验中观察到, 该菌株对紫外线异常敏
感,紫外照射时间超过 60 s,孢子致死率几乎
达到 100%。所以紫外照射时间应严格控制
在 60 s 以内, 这有别于其它的一般链霉菌。
低浓度的 LiCl只有和 UV 复合诱变效果才
明显, L iCl浓度过高, 致死率也随之增高;
LiCl单独诱变菌株时效果不明显。随机挑
取的 108个经 UV、LiCl复合诱变的灰色菌
落,发酵培养后测定阿维菌素的产量,发现其
产抗能力较出发菌株都有明显的提高。再从
中挑选 24个产抗能力强的菌株在平板上反
复传代,进一步发酵筛选,获得一菌落特性和产量都较为稳
定的突变株N-3-93,其发酵单位达2132. 1Lg / m l,较出发菌
株产量提高了 2倍多。B1a效价达到 1002. 3Lg/ ml, 较出发
菌株有明显提高。将此突变株进行下一步的诱变处理。
表 2 阿维链霉菌 H0065 的紫外线、LiCl复合诱变效果
照射时间 ( s) 正突变率 ( % ) 致死率( % ) 不同菌落形态 ( % )
15 31. 2 93. 4 灰色( 51)
30 48 96. 2 白色 ( 32)
45 12 98. 1 光秃( 16)
60 7 100 光秃( 3)
75 - 100 -
2. 2 NT G诱变及筛选
随机挑取经 NTG诱变后的单菌落转接于斜面,进行筛选, 实验结果如表 3, 图 2。
表 3 NTG的诱变结果
NTG 浓度( mg/ ml ) 1 2 3 4
筛选获得菌株数 97 48 47 41
孢子致死率( % ) 83. 1 85. 7 93. 2 96. 8
正突变率( % ) 16. 1 11. 0 0 0
负突变率( % ) 44. 8 67 85 89
由表 3和图 2可知,在pH 6. 0条件下, NT G的作
用浓度为 1 mg/ m l时诱变效果最佳。与出发菌
株相比,正突变率达到 16. 1% , 大于其它处理条
件,负突变率最低为 44. 8%。但随着 NTG 浓度
的增大,孢子的死亡率逐渐增加,产量正突变率逐
渐降低,负突变率逐渐增加。当 NTG浓度达到 3
mg/ ml以上时,正突变率为零,负突变率达到 89%。因此用低浓度的 NT G作为诱变剂进行菌种选育。经
分离、筛选获得突变株 N-3-103。
612005年第 4期 任超等: 阿维菌素 B1a组分高产菌株的诱变育种
2. 3 Met平板筛选
已研究证实Met可促进 S-腺苷甲硫氨酸( SAM )的合成,而 SAM 在菌体内的含量与阿维菌素C5位氧甲
基化程度成正相关性,即 SAM 含量升高阿维菌素 C5-O 甲基化程度也随之增加, 这样就增加了阿维菌素 A
图 2 pH 6. 0 时 1, 2, 3, 4 mg/ ml NTG的诱变结果
组份的比例[ 4]。因此筛选降解甲硫
氨酸能力强的菌株,使甲硫氨酸尽
可能地流向能量代谢[ 5] , 以减少
SAM 合成前体的供给, 使菌体内
SAM 含量相对降低, 获得 B 组分
含量较高的菌株。向培养基中加入
低浓度的 Met , 诱导菌体降解甲硫
氨酸的能力。向培养基中加入低浓
度的甲硫氨酸, 在pH 6. 0, 1 mg / ml
NTG, 28 e 水浴处理 30 m in的诱变条件下, 诱变效果见表 4及图 3。
由表 4和图 3可知,加入 Met 后,菌株 N-3-103的
孢子死亡率显著上升,阿维菌素正突变率比单纯 NT G
诱变有所下降, 负突变率增加, 但 B1a组分比例正突变
率显著上升。加入 0. 25 mg/ m l的 Met , B1a组分比例
增加的菌株达到 14. 9%。随着 Met 浓度的升高,菌落
生长明显受到抑制, 孢子明显减少, B1a组分比例正突
变率有所下降。实验分离、筛选获得突变菌株 N-3-
133。
表 4 甲硫氨酸的诱导模型
Met 浓度( m g/ ml) 0 0. 25 0. 50 1. 0
致死率 ( % ) 85. 3 93. 1 97. 5 100
产量正突变率 ( % ) 9. 4 7. 4 9. 7 -
产量负突变率 ( % ) 51. 4 63. 2 98. 7 -
Ba产量正突变率 ( % ) 4. 8 14. 9 13. 1 -
图 3 不同浓度 Met的诱导结果
2. 4 摇瓶效价分析
由表 5 及图 4 可看出: 诱
变处理出发菌株, 获得的突变
株总效价及 B1a 效价, B1a / B1b
( %)都显著提高, 突变株 N-3-
133的总效价达到 4524. 3Lg/
ml, B1a效价提高到 2533. 6Lg/
ml,明显高于出发菌株 H0065。
2. 5 突变菌株的遗传稳定性考
将诱变等方法获得的突变
菌株 N-3-133通过斜面传代, 得到各代子斜面
后进行摇瓶发酵,测定各代菌株产量及 B1a组分
含量的稳定性, F1 ~ F5代的发酵总效价及阿维
菌素中 B组分比例及 B1a效价,见表 6。
表 5 出发菌株和突变菌株的摇瓶效价测试比较
菌株 总效价( Lg/ ml) B1a效价( Lg/ ml) B1a / B1b ( % )
H0065 835. 6 342. 5 5. 7B 1
N-3-93 2132. 1 1002. 3 6. 3B 1
N-3-103 3835. 2 1994. 3 6. 9B 1
N-3-133 4524. 3 2533. 6 7. 4B 1
由表 6可见,突变株经N-3-133多次传代后, 阿维菌素产量虽有所下降,但其 B组分比例及 B1a的效价基
本上都比较稳定。实验证明, 本实验中所用的诱变筛选方法可有效地筛选出阿维菌素 B1a高产菌株。
62 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 4期
3 讨论
( 1)阿维菌素产生菌的菌落特征很不稳定,存在严重的自然分化现象, 在不同菌落形态的分化菌株中,其
图 4 突变株 N-3-133 的阿维菌素高效液相色
谱图
说明:出峰时间 min 所代表的组分 9. 21 ) B2a, 11.
848 ) A2a, 19. 88 ) B1a, 26. 3 ) A1a.
中产灰色孢子的菌株能产生阿维菌素, 但即使经单孢子选出的灰
色菌落经传代后, 仍分化出不产阿维菌素的白色和光秃菌落,因
此诱变处理后应从分离培养基上挑取产抗能力强的灰色孢子进
行发酵培养,以平衡经常出现的发酵单位不稳定现象。
表 6 突变株 N-3-133的遗传稳定性试验
各代突变株 总效价( Lg/ ml) B组分比例( % ) B1a效价(Lg/ ml )
F1 4524. 3 85. 3 2533. 6
F2 4490. 1 81. 8 2483. 1
F3 4426. 5 82. 7 2442. 2
F4 4374. 6 83. 8 2353. 5
F5 4283. 7 84. 5 2227. 6
( 2)菌体内 S-腺苷甲硫氨酸( SAM)浓度起到调控阿维菌素的
C5位氧甲基化程度作用。当菌体内 SAM 含量升高时, 可以增加
阿维菌素 A 组分的比例,而减少菌体内 SAM 的含量可以使 B组
分的比例升高, B1a组分的比例也随之得以提高。所以, 为了增加
其有效次级代谢产物 B1a组分的比例, 在分离平板中加入低浓度
的 Met ,诱导筛选出降解甲硫氨酸能力强的菌株, 从而减少了产
物中阿维菌素 A 组分的生物合成,提高了有效组分 B1a的比例。
参 考 文 献
1 宋渊,曹贵明,李季伦.生物工程学报, 2000, 16( 1) : 31.
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3 于秀莲,何建勇,等.沈阳药科大学学报, 2004, 21( 3) : 221~ 225.
4 H aruo I, Liru W, T oshio O, et al. Gene, 1998, 206: 175~ 180.
5 来彩霞,陈伟,等.沈阳药科大学学报, 1998, 15( 1) : 47.
# 国内信息#
猴轮状病毒(SAII) RT-PCR检测方法的建立
上海市实验动物质量监督检验站王胜昌等 4位先生根据具有高度保守性编码 VP7轮状病毒糖蛋白基
因 9序列设计引物, 分别进行 RT-PCR和 NT-PCR扩增,结果表明: 引物 Beg 9 / ENd9、Beg 9-1 / End9-1及引物
RVG9/ aET3、RVG9/ aET 3-1分别能在一次 RT-PCR 扩增中出现预期的 1062bp 和 3746bp 扩增带; 引物
RVG9/ aET3、RVG9/ aET 3-1在 NT-PCR扩增中均能出现预期的 374bp扩增带;验证了猴轮状病毒 SAII属
于血清型 3; 引物 RVG9/ aET3进行敏感试验能检测到 0. 5pg 的轮状病毒( SAII) dscDNA。
在研究过程中, 每次进行 PCR扩增时,均以灭菌越纯水作空白对照,以防非特异性或假阳性的出现。当
PCR扩增后,可获得相当高的敏感性, 选用引物 RVG9/ aET 3对轮状病毒( SAII) dsc DNA 进行 10倍梯度稀
释后再以 PCR扩增, 最低能检测到 0. 5pg 的 dscDNA。改进其他的方法后, 王胜昌等采用逆转录之前以
98 e , 10m in,立即将其擦入冰中,不加 DMSO, 也同样取得很好的扩增效果。 秦春圃
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