全 文 ：第23卷 第9期
2011年9月
Vol. 23, No. 9
Sep., 2011
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
文章编号：1004-0374(2011)09-0849-04
应用基因组工程构建新型大肠杆菌细胞工厂
蔡　钒1, 2，方宏清2*，陈必链1
(1 福建师范大学生命科学学院，福州 350108；2 军事医学科学院生物工程研究所，北京 100071)
摘　要：基因组工程 (genome engineering) 是指为了实现某一目标对复制系统进行有意地、广泛地遗传修饰。
大肠杆菌作为常用细胞工厂之一，在生物制造领域应用广泛，已成为合成生物学的主要研究对象。应用基
因组工程改造大肠杆菌可以进一步拓展其应用范围。介绍了基因组工程最新技术发展，如基因组整合、染
色体进化、多元自动化基因组工程、可寻迹多元重组工程等，及其在改造大肠杆菌提高其生产能力、稳定
性及环境耐受能力等方面的研究进展。
关键词：细胞工厂；大肠杆菌；基因组工程；合成生物学
中图分类号：R378.21; Q812; O621.33 文献标志码：A
Constructing novel E. coli cell factories by genome engineering
CAI Fan1, 2, FANG Hong-Qing2*, CHEN Bi-Lian1
(1 College of Life Sciences, Fujian Normal University, Fuzhou 350108, China;
2 Beijing Institute of Biotechnology, Beijing 100071, China)
Abstract: Genome engineering is the extensive and intentional genetic modification of a replicating system for a
specific purpose. Escherichia coli, one of the most common cell factories, is widely used in the domains of
biological manufacturing and becomes a major subject in synthetic biology. Its application fields could be further
expanded by genome engineering. This paper reviews the latest technology development of genome engineering,
such as genome integration of heterogenous pathway, chromosomal evolution, multiplex automated genome
engineering and trackable multiplex recombineering, and their application in improving the productivity, the
stability and the tolerance of Escherichia coli as cell factories.
Key words: cell factories; Escherichia coli; genome engineering; synthetic biology
收稿日期：2011-05-25
基金项目：国家自然科学基金项目(30780049)；国家
重点基础研究发展计划(“973”项目)(2011CBA00801)
*通信作者：E-mail: fanghongqing@vip.sina.com
微生物细胞工厂 (microbial cell factories) 是以
可再生资源为原料，通过微生物细胞转化制备人类
所需的能源、药物、化工原料等等，或者利用微生
物治理日益恶化的环境。大肠杆菌 (Esherichia coli)
是研究得最清楚、分析得最透彻的模式微生物，在
生物制造领域应用广泛。大肠杆菌属于紫细菌，一
类生理活性最丰富的细菌，可以与多种物质代谢及
能量代谢途径兼容，因此成为合成生物学研究领域
的主力微生物。然而，自然界中野生型的微生物由
于含有的酶种类有限、代谢速率和产物积累浓度较
低，因此无法有效地满足工业生产的需要 [1]，需要
对现有微生物进行改造以适应新的应用需求。基因
组工程 (genome engineering) 就是为了实现某一目标
对复制系统进行有意地、广泛地遗传修饰 [2]。本文
就基因组工程相关技术的发展现状及在构建新型大
肠杆菌细胞工厂中的应用作一介绍。
1　异源途径的基因组整合技术
染色体是细胞内最稳定的载体，维持合成代谢
途径稳定表达的一种有效方法是将代谢途径整合到
染色体上。由于存在多复制叉的现象，整合位点相
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对于复制起始区距离的不同仍然会产生细胞与细胞
之间拷贝数的差异。此外，不同整合位点插入可能
产生不同的 DNA 构象，这些都有可能影响被整合
代谢途径的表达。因此，有时需要考察不同整合位
点对被整合途径表达效率的影响。目前，将异源代
谢途径整合到基因组上的方法主要有两种：质粒衍
生的方法和重组工程。
质粒衍生的方法是应用噬菌体整合系统的介导
方法，将合成的 DNA 片段插入到染色体上 [3-4]。这
种方法中，一个供体质粒含有一个噬菌体特异性的
附着位点 (attP)，当转化到一个表达噬菌体整合酶
的宿主细胞内后就可以整合到染色体上的 attB 附着
位点。这种方法相当高效，而且当表达适当的噬菌
体 xis 切离酶时，还可以很容易地将整合片段从染
色体上移除。此外，它对片段的大小并没有限制。
但是，这种方法需要构建一个独立的载体，而且插
入位点的选择性低，质粒骨架和抗性基因也会被同
时整合到基因组上。
重组工程是借助 λ-Red 重组酶，促进染色体与
线性 DNA 片段之间的同源重组 [5]。这种方法通过
PCR 扩增获得两侧具有 45 bp 左右同源臂的线性
DNA 片段，在实施上具有很大的灵活性。重组工
程是目前改造染色体最有效、易操作的方法。近几
年，基于 Red 重组进行精确位点修饰的研究取得
一些新的进展。2010 年，Ying 等 [6] 优化电转条件
以及优化阿拉伯糖诱导的策略，通过抗性筛选成
功将长约４kb 的 PCR 片段整合到染色体上，并证
明基因组整合后能够降低生物噪音。2010 年，
Albermann 等 [7] 通过将基因整合到非必需的碳源降
解途径位点，应用 MacConKey 平板进行筛选，成
功地将类胡萝卜素合成基因 crtE、crtB、crtI、crtY
和 crtZ 逐个整合到大肠杆菌基因组上不同的糖降解
途径位点上。然而，对于大片段 DNA 来说这种方
法不适合：一方面，通过 PCR 扩增难以获得足够
量高保真的产物；另一方面随着片段大小增加，转
化及整合效率出现了显著降低，当片段的长度超过
3 kb 时就难以获得成功，尽管也有一些成功的报道。
另外，这种方法通常需要一个抗性标记用于筛选。
2010 年，Kuhlman 和 Cox[8] 描述了一种利用着
陆垫 (landing pad) 将大片段 DNA 定位插入到染色
体上的方法。他们利用这个方法成功地将长达 7 kb
的片段插入到染色体的指定位置上。因着陆区序列
很短，需要双链断裂促进整合。因此，这种方法可
以连续使用，不需要构建新的着陆区序列。但是，
该方法的一个潜在的缺陷是重复应用标准的着陆序
列有可能会导致以前插入片段丢失。因此，需要适
当的抗生素选择压力来保留已整合到基因组上的片
段。在许多应用事例中，需要在不同位点整合不同
的序列。因此，仍然需要一种无痕精确修饰方法。
针对现实需求，我们实验室构建了能够表达
I-Sce I 归巢核酸内切酶和 Redαβγ 重组系统的辅助
质粒，将 Red 重组技术和 I-Sce I 特异性切割技术以
及 Cm-SacB 正负筛选相结合，建立了一种异源代
谢途径无痕无突变基因组定位整合技术。这种方法
的重组效率高，可直接利用 PCR 方法筛选重组修
饰菌株，避免了现有基因组修饰方法存在的上述问
题。利用供体质粒将异源代谢途径引入宿主内，可
避免 PCR 扩增产生的突变。应用该方法可将 8 kb
以上的重组途径整合到基因组上，我们已成功将青
蒿素前体倍半萜、番茄红素的人工合成代谢途径整
合到大肠杆菌基因组上，并获得高效表达，表达水
平优于质粒载体。我们建立的染色体整合技术可用
来多次连续地将不同的异源基因整合到染色体上的
不同位置，对构建超长基因簇稳定表达工程菌具有
指导意义，对微生物合成生物学的发展具有一定的
促进作用。
2　染色体进化技术
代谢工程以及合成生物学研究中常用的方法是
在宿主的细胞内引入一个新的基因或者是直接协调
各个基因间的表达活性 [9-10]。在质粒上表达的基因
可以获得多拷贝，这样从某些方面来说可以获得一
个更高的产量，而且通过质粒介导的方法简单易行，
操作简便。因此，质粒介导的途径工程是短时表达
重组基因的最好选择，尤其是用来高表达重组蛋白
时更是一个理想的选择。但是，对于多酶催化途径
合成产物的研究来说，过强的表达基因对长期生产
不利。此外，质粒不仅有着结构和分配的不稳定性、
需要用选择标记来维持其在宿主细胞内的存在 [11]，
还会因为等位基因分离导致非生产质粒替代生产质
粒，从而引起质粒表达系统的不稳定 [12]。更为重要
的是质粒还会影响细胞代谢途径 ( 尤其是中心代谢
途径 )，除了会增加代谢负荷不利于菌体生长外，
还会引起其他的生理变化，如增加氧摄取率和葡糖
吸收、促进 ATP 合成等 [13-14]。因此，质粒介导的途
径工程存在着影响遗传稳定性，进而影响重组途径
的缺点，更为甚者还可能通过影响宿主细胞的全局
转录网络而影响目标产物的合成。
蔡　钒，等：应用基因组工程构建新型大肠杆菌细胞工厂第9期 851
基于质粒介导异源途径存在的诸多缺点，
Keith 等 [12] 在 2009 年发展了一种能够适用于大肠
杆菌的化学诱导染色体进化技术 (chemically inducible
chromosomal evolution, CIChE)，提高基因组上某个
基因或代谢途径的拷贝数。首先，利用 λInCh 基因
组整合系统 [15] 将代谢途径、氯霉素抗性标记和两
侧与大肠杆菌基因组不同源的相同 1 kb 外源 DNA
序列整合到染色体的 gal-bio 位置。两侧相同的 1
kb 序列作为后续交叉重组事件中的同源底物。通过
逐渐提高氯霉素浓度，促进依赖 recA 同源重组的
染色体进化，提高重组途径的拷贝数。最高基因拷
贝数可以达到 30~40 个。最后将 recA 基因敲除，
获得遗传稳定的工程菌。与质粒载体系统比较，该
方法构建的工程菌的遗传稳定性提高了 10 倍，在
规模化培养时不需要添加抗生素等选择压力，符合
商业生产的要求。在表达合成 PHB 的途径中，在
无抗生素选择压力存在时，质粒载体系统的生产能
力在传 5 代后降至 0 ；有抗生素压力时，在传 40 代
后丢失 PHB 合成能力，实验结果与质粒稳定性模
型预测结果相当吻合。而染色体整合系统在传 70
代后仍保持 90% 的生产能力。他们还应用该方法
提高番茄红素产量约 60%。
3　多元自动化基因组工程
自然界中微生物基因组的广泛多样性是微生物
群体适应各种各样环境的基础。但是，在实验室里
难以获得基因组多样性，在一个有实际意义的时间
尺度内获得一个新表型也不太容易。体外直接进化
可以产生有用表型的突变体，但受限于单个基因操
作，不适于基因网络或基因组的平行进化。2009 年，
Wang 等 [16] 发展了一种称为多元自动化基因组工程
(multiplex automated genome engineering，MAGE)
技术，可对细胞进行大尺度编程和进化研究。
MAGE 可同时对染色体许多位点进行修饰，修饰的
方法可以是错配、插入或缺失。被研究的主体可以
是单细胞，也可以是一个细胞群体。因此，可以产
生基因组多样性组合。由于这个过程是一个循环的、
可放大的，可以通过自动装置来反复实施。这个装
置包括维持细胞生长的培养室和反复转化 DNA 的
电转室。他们应用一个合成的复合 DNA 库，利用
这种方法对合成番茄红素的 DXP 途径中 20 个基因
的 SD 序列进行协同进化表达，同时敲除 4 个基因，
每天产生 43 亿个突变子，3 d 内就获得了番茄红素
产量提高了 5 倍的突变株。
这个方法的成功实施是基于三个基础：(1) 基
于 Red 单链 DNA 结合蛋白的同源置换技术，他们
通过多个参数优化使同源置换效率最大化，可使
30% 以上的细胞群体发生遗传修饰；(2) 已清楚哪
些基因影响目的产物的合成，这样就可以有针对性
地设计复合 DNA 库；(3) 要有简单快速筛选产物表
达水平的方法，便于从大量的突变库中筛选所需的
突变。
4　可寻迹的多元重组技术
微生物基因组具有巨大的组合多样性潜力。尽
管大肠杆菌基因组已测序完成很多年，有 4 000 多
个编码基因，但是其中很多基因的功能还不明确，
它们与微生物性状，如物质代谢能力、环境抵抗能
力等之间的关系知之甚少。2010 年，Warner 等 [17]
发展了一种可寻迹的多元重组技术 (trackable
multiplex recombineering, TRMR)。TRMR 组合了平
行 DNA 合成、重组工程和分子条形码技术，能够
快速修饰所有大肠杆菌基因组，并可同时定位影
响某一性状的遗传修饰位点。应用这种方法，他
们对大肠杆菌基因组上 4 077 个基因的表达进行组
合突变，每一个基因均包括两种突变模式 ：表达
上调和表达下调。用于突变的 DNA 片段大小约
800 bp，包含用于重组的同源区、条形码标签、抗
性筛选标记、功能区 ( 启动子 /RBS 突变子 )。为了
构建如此大小 DNA 片段的文库，应用了寡核苷酸
库芯片合成技术、Uracil 切割连接技术、滚环复制
技术。Warner 等 [17] 应用该技术在一周内定位了几
千个影响大肠杆菌在不同环境中生长的基因，包括
纤维素水解物、几种生长抑制剂等。应用这种方法
在基因组尺度定位性状基因，工作效率提高了几个
数量级。将其与定向进化等策略结合将会进一步促
进生物技术的发展。
5　展望
当前基因组工程正处于一个快速上升的时期。
技术的不断发展和创新同时又为我们提供了许多新
的设计思路。通过基因组改造也可以构建合成特殊
修饰多肽的大肠杆菌宿主，如乙酰化修饰 [18]、糖基
化修饰 [19] 等，建立药物和疫苗生产的新工艺。发
展“正交体系”或“遗传隔离”技术，防止自身的
遗传特征转移到环境中野生型的菌株体内 [20-21]，同
时构建自身免疫体系防护外源 DNA 的入侵 [22]，可
以为构建微生物细胞工厂提供一个更加安全的环
生命科学 第23卷852
境。另外，删除基因组上一些影响遗传稳定性的序
列，能够为构建微生物细胞工厂提供一个更加稳定
的环境 [23]。而那些占用细胞资源的非必需组分的删
除则能够为微生物细胞工厂节约大量的资源，从而
更有利于提高目的产物的产量。基因组工程能够让
我们在工程上合成生态系统、多细胞发育系统等，
构建一些新型微生物细胞工厂高效生产化工原料、
生物燃料以及医药健康产品，必将为社会经济的可
持续发展发挥巨大作用。
[参　考　文　献]
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