全 文 ：第25卷 第10期
2013年10月
Vol. 25, No. 10
Oct., 2013
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
文章编号：1004-0374(2013)10-0943-09
合成生物学在微生物细胞工厂构建中的应用
戴住波，朱欣娜，张学礼*
(中国科学院天津工业生物技术研究所，天津 300308)
摘　要：通过微生物发酵的方法生产大宗化学品和天然产物能够部分替代石油化工炼制和植物提取。合成
生物学技术的发展极大地提高了构建微生物细胞工厂生产大宗化学品和天然产物的能力。一方面综述了合
成生物学在构建细胞工厂时的关键技术，包括最优合成途径的设计、合成途径的创建与优化、细胞性能的
优化；另一方面，介绍了应用这些技术构建细胞工厂生产燃料化学品、大宗化学品和天然产物的典型案例。
关键词：合成生物学；细胞工厂；生物燃料；大宗化学品；天然产物
中图分类号：Q81；Q939.97 文献标志码：A
Synthetic biology for construction of microbial cell factories
DAI Zhu-Bo, ZHU Xin-Na, ZHANG Xue-Li*
(Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China)
Abstract: Production of bulk chemicals and natural products through microbial fermentation is an excellent
alternative to petrochemical-based production and extraction from plant sources. Development of synthetic biology
tools has facilitated construction of microbial cell factories for production of these compounds. This work reviews
the key tools of synthetic biology to construct microbial cell factories, including design of the optimal synthetic
pathway, construction and optimization of synthetic pathway and optimization of cellular properties. Successful
examples of using these tools for production of fuel chemicals, bulk chemicals and natural products are also
described.
Key words: synthetic biology; cell factories; biofuels; bulk chemicals; natural products
收稿日期：2013-08-27
基金项目：国家重点基础研究发展计划(“973”项目)
(2011CBA00806)
*通信作者：E-mail: zhang_xl@tib.cas.cn
石油是液体运输燃料和化工产业的基础。然而
石油资源是不可再生的，以其为基础的化工炼制是
一个高能耗、高污染的过程。另一方面，很多天然
产物具有抗肿瘤、抗寄生虫、消炎、抗氧化、防衰
老等功效，一直是新药的重要来源。目前天然产物
主要从药用植物中直接提取分离，然而植物生长周
期长、产物含量低，导致这种生产方式对野生植
物资源造成很大的破坏 [1]。
如何以一种可持续、绿色清洁的方式生产燃
料、大宗化学品和天然产物对于维持社会经济的
可持续发展至关重要。生物质是一种可再生的清
洁资源。通过生物制造技术，生物质可以被转化
为燃料、大宗化学品和天然产物，从而部分替代
石油化工炼制和植物提取。生物制造的核心技术
是构建高效的微生物细胞工厂，将生物质原材料
转化为各种终端产品。
然而，自然微生物能生产的化学品种类很少，
远不能满足生产能源、化工、材料和药物领域各种
化学品的需求。另一方面，自然微生物即使能生产
某些化学品，其产量也很低，不具备经济可行性。
如何拓展微生物生产化学品的种类以及如何提高微
生物的生产效率是限制细胞工厂产业化的两个关键
因素 [1]。合成生物学技术的发展极大地提升了细胞
工厂的构建能力。本综述将介绍使用合成生物学技
术构建微生物细胞工厂的技术路线，及其在生产燃
∙ 专题：人造细胞工厂 ∙
生命科学 第25卷944
料化学品、大宗化学品和天然产物方面的应用。
1　使用合成生物学技术构建微生物细胞工厂
的技术路线
通过以下几个方面的改造 (图 1)，可以快速构
建出生产各种化学品的高效细胞工厂。
1.1　最优合成途径的设计
生产目标化学品的合成途径可能不存在于单一
生物中，通过计算机模拟设计，可以将不同的生化
反应组装到一个细胞中，形成一条完整的合成途
径 [2]。在此基础上，根据基因组代谢网络和调控网
络模型，设计出目标化学品的最优合成途径，使其
合成过程中能量供给充足，氧化还原平衡，碳代谢
流最大程度地流入产品合成 [3]。另一方面，自然界
中可能不存在某步关键的生化反应，导致合成途径
不能被打通。通过计算机模拟设计，可以人工合成
出一个全新的蛋白，使其催化该步生化反应，从而
进一步拓展化学品的合成种类 [4]。
1.2　合成途径的创建
目标产品合成途径由一系列生化反应及相关的
编码基因组成，其中某些基因是外源生物的。传统
的 PCR扩增方法周期长，而且很多外源基因在宿
主细胞中的表达及翻译效率很低。DNA合成技术
的发展很好地解决了这一问题。基于芯片的高通量、
高保真 DNA合成技术显著降低了合成时间、合成
成本和错误率 [5-6]；单个酶的大量合成和高通量筛
选相结合，能有效解决外源基因的表达和翻译问题；
另外，标准化的结构元件和调控元件文库，如启动
子、核糖体结合位点和信使 RNA稳定区文库，为
合成途径的创建提供了坚实的物质基础 [7-8]。
合成途径组装技术也日趋成熟，许多新方法和
策略构建的外源途径不仅高效而且遗传更稳定。如
Koma等 [9]开发了高效的原核生物大肠杆菌遗传操
作系统；另外，基于酿酒酵母体内高效的同源重组
能力，科学家们也开发出快速高效的 DNA组装技
术，能够短时间内将若干个短 DNA片段组装成几
十甚至上百个碱基长的 DNA片段 [10-11]。
1.3　合成途径的优化
合成途径创建之后，通常效率都很低，远远达
不到产业化生产的要求，因此需要对合成途径进行
优化，提高其效率。高效的合成途径很多时候不仅
仅受限于某个单一的限速反应步骤 , 而是需要多个
酶的协同平衡。基于标准化调控元件文库，可以对
合成途径各个基因的表达进行精确调控，从而获得
多个基因协调表达的状态 [12]。多重基因组自动改造
技术可以同时对染色体上的多个基因进行改造，结
合高通量筛选技术，可以快速高效地鉴定出最优的
调控组合 [13]。通过人工合成的蛋白质骨架，既可以
使合成途径相邻的两个酶聚集在物理空间比较近的
区域，提高两个生化反应的速率，也可以获得这些
酶的最优组合比例 [14]，小分子 RNA技术能大规模
调控目标基因的表达，实现合成途径的精确调控来
提高产量 [15]。另外，根据基因转录因子与代谢关键
中间物质的相互作用，开发出动态感应调控系统
(dynamic sensor-regulator system，DSRS)调控基因
表达，也能显著提高目标产品的合成能力 [16-17]。
1.4　细胞生产性能的优化
合成途径优化完之后，可以获得一个初步的人
工细胞。需要进一步提高人工细胞的生理性能和生
产环境适应能力，才能将其转变为实际生产可用的
细胞工厂。进化代谢和全局扰动等技术的发展可以
有效地提高细胞的生产性能 [18-23]。在此基础上，使
用各种高通量组学分析技术可以解析细胞性能提升
的遗传机制，并可用于新一轮细胞工厂的构建 [24-26]。
使用上述的合成生物学技术，科学家成功构建
了一系列高效的细胞工厂生产燃料化学品、大宗化
学品和天然产物。
2　燃料化学品细胞工厂
传统的燃料化学品主要是乙醇和丁醇。随着合
成生物学技术的发展，许多新型燃料化学品被开发
出来 [27-28]，主要包括长链醇 (丙醇、正丁醇、异丁醇、
异戊醇 )、脂肪酸酯、脂肪醇、烷烃和烯烃。
2.1　依赖2-酮基酸和Ehrlich途径的长链醇细胞工厂
2-酮基酸是分支氨基酸 (缬氨酸、亮氨酸、异图1 构建微生物细胞工厂的技术路线
戴住波，等：合成生物学在微生物细胞工厂构建中的应用第10期 945
亮氨酸 )生物合成前体，在大肠杆菌中引入外源的 2-
酮基酸脱羧酶 (2-keto-acid decarboxylase, KDC) 和醇
脱氢酶 (alcohol dehydrogenase, ADH)，即可将不同
氨基酸合成途径的 2-酮基丁酸、2-酮基戊酸、2-
酮基异戊酸、2-酮基 -3-甲基戊酸、2-酮基 -4-甲
基戊酸和苯基丙酮酸中间产物转化为相应的长链
醇：丙醇、正丁醇、异丁醇、2-甲基丁醇、3-甲基
丁醇 (异戊醇 )和苯乙醇等 [29-30](图 2)。
Liao研究小组利用 2-酮基酸和 Ehrlich途径构
建和优化了异丁醇合成途径。首先，在大肠杆菌中
引入乳酸乳球菌 (Lactococcus lactis)的酮酸脱羧酶
基因 (KivD)和酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)
的醇脱氢酶基因 (adh)，创建出异丁醇合成途径；
在此基础上，过表达芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)的
乙酰乳酸合成酶基因 (alsS)、大肠杆菌自身的乙酰
羟酸还原异构酶基因 (ilvC)和二羟酸脱水酶基因
(ilvD)，并敲除竞争途径相关基因醇脱氢酶基因
(adhE)、乳酸脱氢酶基因 (ldhA)、富马酸还原酶基
因 (frd)、磷酸乙酰转移酶基因 (pta)、丙酮酸甲酸裂
解酶基因 (pflB)和转录调控因子 (fnr)，来提高异丁
醇合成途径的效率。最终获得的细胞工厂在微氧条
件下，112 h 异丁醇产量达到 22 g/L的水平；采用
1 L发酵罐，应用 Gas Striping原位提取技术，72 h
异丁醇产量达 50 g/L [31]。
Liao研究小组构建的异丁醇细胞工厂，代谢途
径相关基因的表达为诱导型，在实际的应用中还存
在一定的局限性。Zhang研究小组基于实验室构建
的组成型表达的人工调控元件 [7]，通过无痕基因表
达调控技术，对异丁醇合成途径进行了精确调控，
构建出了组成型稳定生产异丁醇的工程菌。在此基
础上，使用人工调控元件对转氢酶基因 pntAB和
NAD激酶基因 yfjB的表达进行组合调控，实现
NADH到 NADPH的高效转化。厌氧条件下，异丁
醇产量提高了 80%，产率提高了 39%，达到 0.92
mol/mol，接近理论最大值。好氧条件下，异丁醇
产量提高了 28%，产率提高了 22%；发酵 24 h可
以生产 10.8 g/L异丁醇，产率为 0.62 mol/mol[32]。
利用该途径的其他长链醇的合成尽管已有不
少研究，但是得到的细胞工厂长链醇的产量还很
低 [30, 33]，主要原因是合成途径中负责 2-酮基酸碳
原子数延长的 2-异丙基苹果酸合成酶和负责 2-酮
基酸脱羧的酮酸脱羧酶对相应底物的亲和力比较
低。对这两个关键酶分子进行改造将有助于提高相
应长链醇的产量。
2.2　正丁醇及依赖CoA途径长链醇细胞工厂
自然界中的梭菌 (Clostridium)能通过辅酶 A
(CoA)介导的途径产生正丁醇。两分子的酰基 CoA
经过缩合、还原、脱水和再还原形成正丁醇 [34]。由
于梭菌为混合醇发酵，为了得到单一产品，Liao研
究小组通过在大肠杆菌中过表达梭菌的 3-羟基丁
酰 CoA脱氢酶基因 (hbd)、巴豆酸酶基因 (crt)和醛
醇脱氢酶基因 (adhE2)，大肠杆菌自身的酰基 CoA
酰基转移酶基因 (atoB)，以及齿垢密螺旋体 (Trepo-
nema denticola)的反式 -烯酰 CoA还原酶基因 (ter)，
图2 依赖2-酮基酸和Ehrlich途径的长链醇合成途径
生命科学 第25卷946
创建了正丁醇合成途径。在此基础上，敲除了竞争
途径基因 (ldhA、adhE、frdBC和 pta)来提高丁醇
产量，并过表达甲基营养酵母 (Candida biodinii)的
甲酸脱氢酶基因 (fdh)提高还原力供给。最终获得
的细胞工厂，在 1 L发酵罐厌氧发酵 7 d，采用 Gas
Striping原位提取技术，产量达 30 g/L, 转化率达 0.28
g/g，产率为 0.18 g/L/h [35](图 3)。
利用该技术思路也可合成其他长链醇。正丁醇
途径中产生的丁酰 CoA和酰基 CoA经过再一轮的
缩合 (反向 β-氧化 )、还原、脱水和再还原形成正
己醇，如此反复，以 +2方式形成各种长链醇 [36-37] (图
3)。
2.3　烷烃和脂肪酸酯(生物柴油)细胞工厂
由 5至 9个碳原子组成的烷烃是很好的内燃
机燃料，而由 10至 16个碳原子组成的烷烃更适
合作为柴油和航空燃料 [28,38]。最近，Schirmer等 [39]
通过在大肠杆菌中共表达来自细长聚球藻 (Syne-
chococcus elongates PCC 7942)的烷烃生物合成基因
orf1594和 orf1593 (分别编码酰基载体蛋白还原酶
和醛脱羧酶 )，构建了产烷烃的细胞工厂，发酵产
物为烷烃的混合物 (约 0.3 g/L)，包括十三烷、十五
烯、十五烷和十七碳烯，比例约为 10:10:40:40。
Keasling研究小组在大肠杆菌中构建了脂肪酸
酯的合成途径 [39]。利用脂肪酸生物合成途径和运
动假单胞菌产乙醇途径，通过酰基 CoA酰基转移
酶催化脂酰基 CoA和乙醇生成脂肪酸酯。在此基
础上，敲除 fadE基因提高前体游离脂肪酸和酰基
CoA的供给，过表达植物来源的硫酯酶 (TES)和鲍
曼不动杆菌 (Acinetobacter baylyi)的酰基 CoA连接
酶 (ACL)，提高脂酰基 CoA代谢流量。最终获得的
细胞工厂，脂肪酸乙基酯 (生物柴油 )产量达 674
mg/L，相当于理论产率的 9.4% [40]。
2.4　类异戊二烯类细胞工厂
自然界中甲羟戊酸 (MVA)和 1-脱氧木酮糖 -5-
磷酸 (MEP)两个合成途径均能合成类异戊二烯类化
合物的 C5通用前体：异戊烯基焦磷酸 (IPP)和二甲
基烯丙基焦磷酸 (DMAPP)。通过异戊烯基转移酶，
IPP的5碳转移至DMAPP，产生香叶基焦磷酸 (GPP，
C10)，或继续转移形成法尼基焦磷酸 (FPP，C15)等
具有挥发性的精油类化合物的前体 [41-42]。根据不同
的酶，这些类异戊二烯可以直接转换为两种不同的
燃料化学品。通过萜烯合成酶，转换类异戊二烯生
产环烯烃和支链烷烃；通过焦磷酸酶和其他类型的
酶，水解类异戊二烯生产醇。这些代谢产物包括环
烯烃 (没药烯 )、支链烯烃 (法呢烯 )和醇 (金合欢醇 )，
是重要的生物燃料，可以作为汽油的替代品，而长
图3 正丁醇及依赖CoA途径的长链醇
戴住波，等：合成生物学在微生物细胞工厂构建中的应用第10期 947
碳链更适合于柴油和喷气燃料的替代品 [43-44]。
基于法尼基焦磷酸来源的 C15类异戊二烯在生
物燃料方面表现出的良好潜力，最近吸引了众多研
究者关注。Lee研究组在 C15没药烯 (bisabolene)研
究中，开发了大肠杆菌和酿酒酵母两种生产 C15
生物燃料的微生物平台，目前产量均能达到 900
mg/L以上，并且建立了将没药烯化学催化为没药
烷 (bisabolane)的方法体系，为生物方法生产环化
C15燃料奠定了基础
[41]。在 C15 金合欢醇研究中，
Wang等 [45]通过在大肠杆菌中引入外源的甲羟戊酸
(MVA)途径构建了可以产生 135.5 mg/L的金合欢醇
工程菌。Kim 研究组在大肠杆菌中引入密码子优化
的 α-法呢烯 (α-farnesene)合成酶，将法尼基焦磷酸
转化为 α-法呢烯，产量已经达到 380.0 mg/L[46]。同
时，美国 Amyris公司已经开始在甘蔗产区巴西建
立了酵母工程菌发酵生产生物法呢烯 (biofene, trans-
β-farnesene)的示范工厂 [44]。
3　大宗化学品
过去的 20年间，随着代谢工程的发展，科学
家已经成功开发出一系列生产 C3 (乳酸、1,3-丙二
醇、1,2-丙二醇、3-羟基丙酸、丙烯酸、丙氨酸 )、
C4 (丁二酸、苹果酸、富马酸、异丁烯、丁二烯 )、
C5 (异戊二烯、戊二胺、戊醇、木糖醇 )和 C6 (己
二酸、葡萄糖酸、甘露醇 )等化学品的细胞工厂，
其中很多已实现产业化生产，并被进一步用于塑料、
纤维、尼龙、橡胶等一系列终端产品的生产。近几
年来，随着合成生物学技术的发展，科学家又成功
创建出很多以前不能创建的大宗化学品合成途径，
比较有代表性的有以下两种。
3.1　聚乳酸
催化生化反应的酶是合成途径中的关键元件。
通过随机突变、定向进化等实验方法与计算机模拟
相结合，可以改造自然界中已有的酶去执行新的功
能，甚至可以人工合成一个新酶去执行全新的功能。
聚乳酸 (polyactic acid, PLA)是一种潜力很大的
生物可降解性塑料。自然微生物中不存在从乳酸到
聚乳酸的合成途径，目前只能通过化学合成的方式
获得。通过对酶反应的底物和化学反应类型的分
析发现，丙酸梭菌 (Clostridium propionicum)的丙酸
CoA转移酶 (Pct)可催化乳酸形成乳酰 CoA，假单
胞菌 (Pseudomonas sp. MBEL 6-19)的聚羟基脂肪酸
酯合成酶 (PhaC1)可能催化乳酰 CoA聚合形成
PLA，但他们均不能很好地将催化底物乳酸或乳酰
CoA转换为相应的产物。对 Pct用易错 PCR进行随
机突变，且对 PhaC1进行定点突变及饱和突变，筛
选得到最佳改造的两个关键酶，在大肠杆菌中创建
出 PLA合成途径并进一步优化后，葡萄糖发酵产
PLA达到 11 wt% [47-48]。
对于某个自然界不存在的酶反应，若不能找到
一个可以改造的天然酶，就要采用从头设计的方法。
通过计算机辅助设计，模拟活性中心的结构，分析
底物和催化中心的变构状态，然后置于酶分子骨架
上。目前通过这种方法已经成功构建了以 4-羟
基 -4-6-甲基 -2-萘基 -2-丁酮为底物，催化逆醛醇
缩合反应的酶 retro-aldolase[4]。
3.2　1,4-丁二醇
通过代谢网络模型和计算机模拟分析，理论上
可以设计出目标化学品各种可能的合成途径 [3, 49]。
1,4-丁二醇 (1,4-BDO)是工业上用于制造聚酯和氨
纶的重要原料，而自然微生物中不存在 1,4-BDO的
生物合成途径。Genomatica公司根据已知化合物官
能团的转换，从中央代谢物如乙酰基 -CoA、α-酮
戊二酸、谷氨酸和琥珀酰 -CoA出发，设计出 10 000
种可能的 1,4-BDO合成途径。基于能量供给、还原
力供给、细胞生长等约束条件，最后评价出两种最
优的 1,4-BDO合成途径。在此基础上，将不同生物
来源的各个基因在大肠杆菌中进行组装，创建出
1,4-BDO的合成途径，最终产量达 18 g/L [50]。
4　天然产物
4.1　萜类
目前自然界发现的萜类超过 5万多种，其中大
部分是植物用来生物防御和信号转导的次生代谢产
物，被人类广泛应用于医疗健康和化妆品领域 [42]，
如抗疟疾药物青蒿素 (倍半萜，C15)、抗癌药物紫
杉醇 (二萜，C20)、心脑血管治疗和保健作用显著
的人参皂苷 (三萜，C30)及抗衰老作用的胡萝卜素
类 (四萜，C40)等。这些从药用植物中提取的天然
产物有巨大的应用潜力和市场前景，特别是二萜类
化合物中丹参酮Ⅱ A、雷公藤内酯和紫杉醇，以及
三萜中的人参皂苷 Rh2和人参皂苷 Rg3等具有抗
癌活性的成分 [51]。
4.1.1　倍半萜
由 3个 IPP (DMAPP)单元组成的法尼烯焦磷
酸 (FPP，C15)是这类化合物的基本前体。倍半萜类
代表性化合物青蒿素 (artemisinin)属于倍半萜内酯，
最初 Keasling研究小组通过提高酿酒酵母麦角固醇
生命科学 第25卷948
合成途径中上游的 3-羟基 -3-甲基戊二酰辅酶 A还
原酶 (HMGR)和萜类调控因子蛋白 UPC2的基因表
达来提高前体 FPP供给，同时抑制鲨烯合酶基因
(ERG9)的表达减少分支途径底物竞争的方案，构
建了一个高效生产青蒿素前体青蒿酸的酿酒酵母人
工细胞，产量达 100 mg/L[52]。基于近年在青蒿素生
物合成方面的研究突破，2012年 Amyris公司通过
进一步的菌株改造和发酵工艺的优化，获得能生产
青蒿素前体紫穗槐二烯 (amorpha-4,11-diene)>40g/L
的技术，并且开发出将紫穗槐二烯化学方法转化
为二氢青蒿酸的高效方法 [53]。目前发酵法生产青
蒿素前体青蒿酸 (artemisinic acid)的能力已经达到
25 g/L的产业化水平 [54]。
4.1.2　二萜
紫杉醇、丹参酮、银杏内酯和香紫苏醇等化合
物均为由 4个 IPP (DMAPP)单元组成的牻牛儿牻牛
儿基焦磷酸 (GGPP，C40)在各种酶的作用下生成的
二萜类化合物。在抗癌药物紫杉醇的研究案例中，
最初 Croteau 领导的研究组系列报道了他们克隆
和鉴定紫杉醇生物合成途径中关键基因的工作进
展 [55]。在此基础上，目前较为突出的工作是 Step-
hanopoulos研究小组在大肠杆菌中引入紫杉二烯合
成途径，并对其合成途径的两个功能模块进行精确
调控，降低了中间产物的毒性，最终获得高产紫杉
二烯的大肠杆菌人工细胞，产量达 1 000 mg/L[12]。
丹参酮是药用植物丹参中的药效成分，广泛应用于
心脑血管疾病防治领域。Huang研究组最初利用在
大肠杆菌中建立次丹参酮二烯合成途径的方法，克
隆鉴定了丹参酮合成途径的关键中间化合物次丹参
酮二烯 (miltiradiene)合成所需的功能基因 SmCPS
和 SmKSL [56]。在此基础上，Zhao研究组和 Zhang
研究组分别在酿酒酵母中引入次丹参酮二烯合成途
径，并对合成途径进行了系统优化，最终次丹参酮
二烯的产量分别达到 386 mg/L[57]和 486 mg/L[58]。
另外，Prather研究小组结合途径改造和酶定向进化，
在大肠杆菌中构建并优化了银杏内酯类前体左旋海
松二烯 (levopimaradiene)的合成途径，最终产量达
700 mg/L[59]。在生物二萜类香料研究中，Schalk等 [60]
先从南欧丹参植物中克隆到合成香紫苏醇的功能基
因 SsLPS和 ScScS，并且在大肠杆菌中构建生产香
紫苏醇产量超过 1.5 g/L的工程菌，为微生物方法
生产香料降龙涎香醚提供了新的途径。
4.1.3　四萜
八氢番茄红素合成酶 (PSY)能催化两个 GGPP
分子得到类胡萝卜素等天然四萜类 (C40)有色化合
物的基本前体八氢番茄红素。八氢番茄红素能被各
种生物酶继续催化为包括番茄红素 (lycopene)、β-
胡萝卜素 (β-carotene)、虾青素 (astaxanthin)、玉米
黄素 (zeaxanthin)和角黄素 (cathaxanthin)等系列强
抗氧化和提高免疫力的功能性四萜化合物。在细胞
工厂构建方面，Yoon等 [61]在大肠杆菌中引入外源
MVA途径，并调控表达大肠杆菌自身 MEP 途径的
dxs 和 idi 基因，β- 胡萝卜素产量达 503 mg/L。
Zhang研究组对大肠杆菌的MEP、β-胡萝卜素合成、
ATP合成、磷酸戊糖途径、TCA这 5个功能模块进
行组合调控，将 β-胡萝卜素产量提高了 74倍，最
终获得细胞工厂 β-胡萝卜素产量达 2.1 g/L[62]；
Wang 等 [13]开发了MAGE (multiplexed automated genome
engineering) 方法应用于基因组的大规模修饰编译
及宿主表型的优化。他们通过MAGE对大肠杆菌
中生产萜类的MEP途径进行优化，以每天产生 43
亿基因组突变体的速度，仅用 3 d就筛选到番茄红
素产量提高 5倍的目标菌株。Scaife等 [63]以高产 β-
胡萝卜素的大肠杆菌为出发细胞，对比分析了 12
个 β-胡萝卜素酮基化酶基因和 4个 β-胡萝卜素羟
基化酶基因，选取了最优组合，使得类总胡萝卜素
化合物的单位产量达 1.99 mg/g细胞干重，且虾青
素比例大于 90%。另外，番茄红素的颜色指示作用
已被开发作为 GGPP合成酶定向进化高通量筛选的
标记 [59]。
4.2　生物碱类
生物碱 (alkaloids)在生物体内是以鸟氨酸、赖
氨酸、苯丙氨酸、组氨酸和色氨酸等氨基酸为底物
进行生物合成得到的一类含氮的碱性有机化合物。
其生物活性强，是临床药物的重要来源，如吗啡
(morphine)、麻黄素 (ephedrine)、长春新碱 (vincristine)、
可待因 (codeine)和黄连素 (berberine)等药物在临床
上已经广泛使用 [51]。目前其相关的生物工程菌研究
较少，主要集中在苄基异喹啉类生物碱的研究 [64]。
早期，Smolke研究小组利用在植物中克隆的外源
基因在酵母中成功构建了将去甲基罂粟 (norlau-
danosoline)转化为苄基异喹啉生物碱前体牛心果碱
[(S)-reticuline]的工程菌 [65]。在进一步的工作中，
牛心果碱被转化为血根碱 (sanguinarine)，黄连素和
吗啡等药物的中间体生物合成途径中相关关键酶反
应被鉴定 [65]。Nakagawa等 [66]为避免加入昂贵的代
谢中间物作为底物生成牛心果碱，在大肠杆菌工程
菌中通过提高 L-酪氨酸上游途径的基因表达，构
戴住波，等：合成生物学在微生物细胞工厂构建中的应用第10期 949
建和优化牛心果碱生物合成的外源途径策略，开发
出能利用简单碳源甘油合成 (S)-reticuline的细胞工
厂，产量达 46 mg/L。
4.3　苯丙素类
苯丙素类是天然存在的一类苯环与三个直链碳
连接 (C6-C3基团 )构成的化合物。在生物合成上，
这类化合物多数通过苯丙氨酸和酪氨酸等芳香氨基
酸，经脱氨、羟基化和聚合等一系列反应形成，主
要包括：抗氧化作用显著的白藜芦醇 (resveratrol)、
具心血管保健作用的柚皮素 (naringenin)、抗病毒和
凝血作用显著的咖啡酸 (caffeic acid)等等 [51]。以白
藜芦醇为代表的这类化合物的人工细胞工厂构建有
较长的研究历史，在酿酒酵母和大肠杆菌中均构建
了工程菌，如最近 Lim等 [67]利用高拷贝质粒将来
源于葡萄的白藜芦醇合酶 (STS)基因和来源于拟南
芥的 4-香豆酸 :辅酶 A连接酶 (4CL)基因共同引入
大肠杆菌中，并通过抑制工程菌中脂肪酸代谢，提
高白藜芦醇合成底物丙酰辅酶 A的供应，以及整合
araE基因促进白藜芦醇的胞外转移，构建了以对羟
基肉桂酸为底物生产白藜芦醇的大肠杆菌细胞工
厂，产量达 2.3 g/L。由于这类高产的工程菌基本上
都需要加入成本较高的中间体 (如对羟基肉桂酸 )，
Stephanopoulos研究组通过优化大肠杆菌 L-酪氨酸
的合成和引入从酪氨酸到柚皮素的外源功能模块，
最终在大肠杆菌中构建了能以廉价碳源葡萄糖为原
料生产柚皮素的细胞工厂，产量达 29 mg/L[68]；另外，
Lin和 Yan[69]构建的大肠杆菌细胞工厂能将酪氨基
酸转化为咖啡酸，产量达 50.2 mg/L；最近Wu等 [70]
在大肠杆菌中转入多个外源基因模块，构建出能以
葡萄糖为碳源发酵生产生松黄烷酮 (pinocembrin)的
细胞工厂，产量达 40.02 mg/L。
5　结语和展望
随着石油资源匮乏、价格飞速增长以及全球气
候变暖、环境恶化等问题的日益严重，各国政府、
企业和科学界均在大力推动传统石油化工和天然产
物制造行业的产业升级。构建高效的微生物细胞工
厂，能够极大地提升目前工业微生物的发酵能力，
提高其生理性能；既可以降低微生物发酵的生产成
本，又能拓展发酵产品的多样性，使其能够逐步在
与传统石油化工和天然产物制造技术的竞争中占据
上风。随着合成生物学技术的不断发展，微生物细
胞工厂的构建技术也将越发完善，其必将极大地推
动传统石油化工制造和药物生产的产业升级，为人
类社会的可持续发展做出巨大的贡献。
注：本文部分内容引自：(1)《2012工业生物技术
发展报告》“天然产物的人工细胞工厂合成”；(2)《中
国科学报》 (2013-01-02，第 6版，生物 )“合成生
物学促进微生物细胞工厂构建”。
[参　考　文　献]
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