全 文 ：生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
第 19卷 第 3期
2007年 6月
Vol. 19, No. 3
Jun., 2007
人胚胎干细胞培养系统的研究进展
刘雪梅，朱桂金*
（华中科技大学同济医学院附属同济医院生殖中心，武汉 430030）
摘　要：人胚胎干细胞(hESC)具有永久的自我更新和多潜能分化能力，可在一定条件下定向分化为三个
胚层的各种细胞。这些特性使其在再生医学(细胞治疗)、药物筛选及早期胚胎发育研究中具有重要的应
用前景；但人胚胎干细胞培养系统中大量的动物源性物质和复杂的未知成份大大阻碍了其医学应用价
值，所以建立一个没有动物源物质、成份确定的人胚胎干细胞培养系统是非常重要的。本文简要介绍
了为适应 hESC 临床应用和基础研究的需要，改良其培养系统的研究进展。
关键词：人胚胎干细胞(hESC); 临床等级；成份确定培养基(DM)
中图分类号：Q 81 3　　文献标识码：A
Progress on the culture of human embryonic stem cells
LIU Xuemei, ZHU Guijin*
(Reproductive Medicine Center, Tongji Hospital, Tongji Medicine College, Huazhong University of Science and
Technology, Wuhan 430030, China)
Abstract: Human embryonic stem cells (hESC) are self-renew unlimitedly and pluripotent, they have an ability
to differentiate to multiple cell types representing all primitive embryonic germ layers: ectoderm, mesoderm and
endoderm under appropriate conditions. These properties imply great potential in regenerative medicine (cell
therapy), drug screening, and developmental studies. However, the medical application of hESCs is hampered
by many animal products in the culture medium and/or the complexity of conditions required for hESC growth.
Therefore, it is important to establish a defined medium without animal products. This review summarizes the
progress on the culture of hESC for clinical use and studies.
Key words: human embryonic stem cells (hESC); clinical-grade; defined medium (DM)
人胚胎干细胞(human embryonic stem cells, hESC)
主要来自入植前IVF(in vitro ferlilization)的囊胚内细
胞团，具有永久自我更新和多潜能分化能力。hESC
在体外已成功的定向分化出了多种细胞[1-6]，因此，
可以作为治疗性克隆的工具和研究人类疾病的模
型，广泛应用于再生医学、药物筛选及胚胎发育生
理学的研究。为促进 hESC的临床应用，正在建立
含有不同HLA(人类白细胞抗原，也称组织相容性
抗原)的干细胞库[7]，将来还可以利用别的技术(如
文章编号 ：1004-0374(2007)03-0306-05
收稿日期：2006-12-13；修回日期：2007-01-11
作者简介：刘雪梅(1978 —)，女，博士研究生；朱桂金(1944 —)，女，教授，博士生导师，* 通讯作者，E-mail:
zhu_guijin@sina.com
核移植、胚胎干细胞质对体细胞核的再编程作用
等)建立自身同源的 hESC[8-9]。因此，hESC可成为
再生医学、药物筛选及胚胎发育研究的主要来源。
但是，传统 hESC培养系统中含有大量的动物
源成份，易激发免疫反应，发生免疫排斥，同时
增加了其感染外源性病毒、病原体的危险性，从而
大大限制了 hESC的临床应用价值[10]。另外培养系
统中的各种复杂未知的营养成份，干扰了基础研究
的结果，使研究结果失去了真实性。因此，为了
·评述与综述 ·
307第3期 刘雪梅，等：人胚胎干细胞培养系统的研究进展
充分利用 hESC的医学应用价值，必须优化培养系
统，逐步建立一个没有动物源物质、成份确定的培
养系统。近年来 hE SC 培养系统已经有了很大改
良，以适应 hESC临床应用和基础研究的需要。
1　饲养层共培养系统
hESC体外培养必须满足两个基本条件，即促
进细胞分裂增殖的同时抑制细胞的自发性分化。早
期 hESC的培养系统是由鼠 ESC的培养系统衍化而
来，同样利用胎牛血清、鼠胚胎成纤维细胞(MEF)
做饲养层来支持 hESC增殖。 但培养系统中大量的
动物源物质(MEF和胎牛血清)大大增加了hESC感染
病原微生物的危险性。此外，hESC还有被外源糖
分子污染的可能性。 Martin等[10]在hESC的细胞表面
检测到了非人源唾液酸Neu5Gc，发现Neu5Gc可以
激发免疫反应，发生免疫排斥，从而使 hESC相关
的细胞治疗失败。
为了尽量清除 hESC建系和培养中的鼠源性物
质，研究者们尝试着用人源饲养层来代替鼠源饲养
层。Richards等[11]首先用人胎儿的皮肤、肌肉及成
人输卵管上皮制备饲养层，成功地支持了用MEF做
饲养层建系的 hESC的生长；同时他们也尝试了用
人饲养层(胎儿肌肉)及人血清来建立 hESC系。但他
们发现 hESC在这些人源饲养层上生长较慢，同时
流产胎儿来源有限，而且涉及到论理学问题，故大
大阻碍了其发展。后来他们又尝试用成人皮肤、肌
肉组织制备饲养层来支持 hESC的生长[12]。Amit
等[13]发现用人包皮成纤维细胞作为饲养层也可支持
hESC的生长。Hovatta等[14]用此饲养层及胎牛血清
成功的建立了 25个 hESC系，后来为避免用动物血
清又用代血清(serum replacement，SR)成功地建立
了 hESC系[15]。其他人源饲养层也可以用于 hESC的
建系和培养，包括成人骨髓基质细胞[16]和人子宫内
膜细胞[ 17 ]等。
在器官和组织同种异体移植过程中，HIV-1、
HIV-2、乙型肝炎病毒、柯萨奇病毒及其他传染原
可以从供者传给受着，因此，这些用于 hESC建系和
培养的人源饲养层要先筛查供者潜在病原微生物。
由于胎盘屏障作用使胎盘成纤维细胞感染病原微生
物的可能性大大减少，为了避免人源饲养层携带病
原微生物，Genbacev等[18]用人胎盘成纤维细胞来制
备饲养层。胎盘成纤维细胞是胎盘的主要成分，未
分化的 hESC被胎盘包围，从而提供了一个与体内
干细胞生长相似的环境。还有研究者用 hESC分化
出成纤维样细胞，用此成纤维细胞制备饲养层来维
持自身的生长[19]，这样既可以随时制备饲养层，又
可避免饲养层携带外源性病原微生物，提供了一个
更安全的自身同源培养系统。如果从临床等级
hE S C 分化出细胞制备饲养层，就可以广泛用于
hESC的建系，从而减少交叉感染。另外，这样制
备饲养层不必花费时间取材，也不必牺牲动物。
由于制备饲养层过程中都用胎牛血清，hESC
建系分离内细胞团时多用免疫外科的方法，所以，
以上方法不是纯无动物源物质的培养系统。
2　无饲养层培养系统
由于饲养层共培养系统费时费力，限制了
hESC的大量培养；同时，由于饲养层的存在限制
了相关基因技术操作，而且无法保证饲养层细胞从
hESC完全分离，阻碍了其临床应用。为克服这些
障碍，需要建立一个无饲养层的培养系统。
2.1　条件培养基(conditioned medium, CM)　2001年
Xu等[20]建立了第一个无饲养层培养系统。传统系
统中MEF提供了大量维持 hESC生长的重要因子，
故将 hESC培养液加到MEF单层上，定时收集培养
液，从而制备了条件培养基(MEF-CM)。研究发
现，用基质胶(Matrigel)或层黏连蛋白(Laminin)包被
培养皿，结合MEF-CM可以维持 hESC 的生长。
Brimble等[21]比较了hESC在MEF和MEF-CM培养体
系中的mRNA表达水平，发现表达谱相似，说明
hESC在MEF-CM中不会受到额外的应激。hESC可
以在此无饲养层培养系统中保持未分化状态生长两
年以上，但如果没有细胞外基质(Matrigel、Laminin
等)包被，只有MEF-CM则不能维持 hESC的未分化
状态。另外，Choo等[22]建立了一个永生的MEF细
胞系(δE-MEF)，用此细胞制备的条件培养基可以使
hESC处于未分化状态增殖 40代以上。
为消除鼠源性物质，Xu等[23]又用人饲养层制
备条件培养基来建立无饲养层培养系统。用 hESC
(H1)分化出成纤维样细胞(HEF1)，再将表达人端粒
酶逆转录酶(hTERT)的逆转录病毒感染HEF1，形成
永生化的细胞(HEF1-hTERT)。用HEF1-hTERT细
胞制备的条件培养基及Matrigel包被的培养皿建立无
饲养层培养系统，此系统可以很好的维持 hESC生
长。Stojkovic等[19]也证实，用 hESC诱导分化出的
成纤维样细胞(hES-dF)制备条件培养基(hES-dF-
CM)，在Matrigel包被的培养皿上可以维持hESC的
生长。但Matrigel是从Engelbreth-Holm-Swarm鼠肉
308 生命科学 第19卷
瘤中制备的，所以仍为鼠源性物质。Stojkovic等[24]
为尽量减少培养系统中的动物源性物质，又尝试用
人血清包被培养皿建立无饲养层培养系统。结果发
现此培养系统可以成功维持 hESC的生长，从而建
立了一个更为安全的培养系统。
2.2　成份确定培养基(defined medium)　由于条件培
养基批次间存在差异，无法保证不同批次含有相同
的成份和浓度，从而不能正确分析判断影响 hESC
生长状态的因素，同时也不利于分析 hESC相关的
研究结果。所以需要明确培养液中的营养成份，从
而保证不同批次间成份和浓度的稳定性。
现在已经确定了数种维持hESC生长的生长因子，
其中基本成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth
factor，bFGF)是维持 hESC自我更新必需的[25-27]。Xu
等[25]发现在Matrigel包被的无条件培养基培养系统
中，40 ng/ml bFGF单独即可维持 hESC保持未分
化多潜能状态达 15代。但 Levenstein等[27]在比较不
同浓度 bFGF对 hESC的作用时，发现 4、24和 40
ng/ml bFGF不能维持 hESC到 3代，而 100 ng/ml
bFGF却能发挥跟条件培养基一样效果的作用。这
种试验结果的差异可能是由于采用的培养条件和
hESC系不同造成的。
低浓度 bFG F 可以与其他因子一起共同维持
hESC的生长。hESC在非条件培养基中具有高水平
的骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，
BMP)信号，而在条件培养基（MEF-CM）中则降
低，说明抑制BMP信号可以维持未分化 hESC的生
长。Xu等[28]发现 BMP拮抗剂Noggin (500 ng/ml)联
合 bFGF (40 ng/ml)可以在Matrigel包被的培养系统
中有效的维持 hESC生长达 33代，说明Noggin可能
与 bFGF协同作用共同抑制 BMP信号，从而维持
hESC未分化增殖。Wang等[29]也做了相似的研究，
在无条件培养基系统中，Noggin (500 ng/ml)单独不
能维持 hESC (H1)的未分化生长，bFGF (40 ng/ml
或 80 ng/ml)也仅能维持其生长 15 d，但两者联合
(500 ng/ml Noggin和 40 ng/ml bFGF)可以维持H1生
长至少 7 代。
激活素A (Activin A)对维持hESC生长也是非常
重要的，Beattie等[30]研究发现Activin A、尼克酰胺
( n i c o t i n a mi d e，N I C )和角质化细胞生长因子
(keratinocyte growth factor，KGF)能够维持 hESC在
Laminin包被的培养皿上持续生长达 20代。如果培
养基中不加 Activin A，则 hESC迅速分化，说明
Act ivin A 可以抑制 hESC 的分化；如果单独用
Activin A，培养基中没有KGF或NIC，细胞的生长
速度会大大降低。其他研究者也注意到了Activin A
的作用，James等[31] 发现 SMAD2/3磷酸化激活的
TGFβ/activin/Nodal信号，是维持 hESC未分化必需
的；Vallier等[32]也证实了Activin/Nodal信号在维持
hESC生长中的作用。近来Xiao等[33]充分证实了Activin
A在 hESC生长中的作用，他们发现在无饲养层无
血清的培养系统中，Activin A可以长期有效的维持
hESC的未分化和多潜能状态。Activin A能够诱导
Oct4、Nanog、Nodal、Wnt3(一组编码调节胚胎
发育的分泌蛋白质，由Wingless和 Int而得名)、bFGF
和 FGF8的表达，同时抑制 BMP信号通路，说明
Activin A是维持 hESC干细胞状态的关键调控子。
在无饲养层的培养系统中，Wnt3a也可以促进
hESC的增殖。糖原合成酶激酶 3(glycogen synthase
kinase-3，GSK-3)的特殊药物抑制剂 BIO(6-bromo-
indirubin-3-oxime)能够激活Wnt信号通路，从而维
持 hESC的未分化和多潜能性[34]。但Dravid等[35]发
现在无饲养层系统中，Wnt信号不能充分维持hESC
的长期增殖。
2.3　培养皿包被物质　几乎所有的无饲养层培养系
统均用Matrigel包被培养皿，促进 hESC的粘附生
长。但Matrigel是含有未知因子的鼠源性物质，为
了建立一个完全无动物源物质成份确定的培养系
统，就要用人源确定成份的物质取代Ma tr igel。
Amit等[36]首先做了这方面的工作，发现人纤维连接
蛋白(Fibronectin)可以代替Matrigel来包被培养皿。
后来Lu等[37]也证实了人Fibronectin包被培养皿的培
养系统能有效的维持 hESC的生长。Laminin包被的
培养系统也能很好的维持 hESC的未分化、多潜能
状态 [ 3 8 ]。
2.4　血清　胎牛血清(FBS)最先用于细胞培养，后来
迅速被基因敲除代血清(knock-out serum replacement,
KSR)取代。KSR能有效的促进 hESC未分化增殖，
但它仍来源于血清，而且含有大量牛血清白蛋白和
其他未知蛋白质。所以要建立一个完全无动物源物
质成份确定的培养系统，必须要清除KSR。许多研
究小组做了这方面的研究，Pebay等[39]检测了血清
中三种主要成份(sphingosine-1-phosphate，S1P；
lysophosphatidic acid，LPA；platelet-derived growth
factor，PDGF)在维持 hESC生长中的作用，发现
S1P和PDGF在无血清培养基中能成功维持hESC的
309第3期 刘雪梅，等：人胚胎干细胞培养系统的研究进展
未分化增殖，说明 S1P及 PDGF等分子可以取代
K S R。
完全无动物源物质成份确定的培养系统不仅利
于 hESC的临床应用和基础研究，也利于提高培养
系统的可重复性和标准化。近来报道了数种成份确
定培养系统能够有效的维持 hESC的自我更新。Li
等[38]将以前培养造血干细胞的系统应用于hESC的培
养，此系统仅含有人源蛋白、基因重组蛋白( X -
VIVO 10)及基因重组生长因子，从而建立了一个不
需条件培养基的无血清的培养系统(NC-SFM)。在
Laminin包被的培养系统中，NC-SFM能很好的维持
hESC的未分化、多潜能状态，且 hESC的增殖速
度是在MEF-CM中的两倍。Lu等[37]也建立了一种成
份简单的培养基(hESC Cocktail，HESCO)，含有 8
种成份，均为人源或化学合成。在Matrigel或人
Fibronectin包被的培养系统中，HESCO均能长期有
效的维持hESC的生长。Yao等[40]发现了另一种成份
确定培养基(N2/B27-CDM)，N2/B27联合 bFGF(20
ng/ml)能够长期有效地维持hESC未分化状态及正常
的生长速度。Liu等[41]发现了同样的培养系统，命
名为NBF(N2、B27和 bFGF)。与在MEF-CM中相
比，hESC在NBF培养系统里具有较低的调亡率和
较高的增殖速度。另外，Ludwig等[42]用成份确定
培养基建立 hESC系时，也建立了一种成份确定培
养基(TeSR1)，但由于用鼠源性物质Matrigel包被培
养皿使此系统不能很好地应用于临床；同时此系统
高昂的费用不能很好的用于基础研究。后来，此研
究小组又调整了培养系统(命名为mTeSR1)，用动
物源性物质(包括牛血清白蛋白和斑马鱼bFGF等)代
替人源性物质来降低成本，从而很好地用于基础研
究 [ 4 3 ]。
这些成份确定培养系统，尽量减少了动物源物
质，从而促进了 hESC的临床应用和基础研究，但
这些培养系统的花费均很高。
3　结语与展望
本文简要介绍了 hESC从标准饲养层培养到条
件培养基培养，到最后的成份确定培养基培养的动
态发展过程。早期大多数 hESC建系和维持培养的
系统中含有大量动物源物质或饲养层，这些异种或
同种异体的物质主要造成四个方面的问题：(1)含有
的免疫原和毒蛋白能激发免疫反应，发生免疫排
斥；(2)增加了病原微生物污染 hESC的危险性；(3)
从饲养层中分离纯化 hESC费时费力；(4)培养系统
中大量未知因子干扰研究结果。所以要尽量减少培
养系统中的外源性物质，并明确维持 hESC生长的
具体成份，建立无外源物质、成份明确的培养系
统。这不仅有利于 hESC的临床应用和基础研究，
也有利用提高培养系统的可重复性和标准化。随着
研究者的不断努力和研究的深入，不久的将来肯定
会建立一个临床等级的经济实用的hESC培养系统。
[参　考　文　献]
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