全 文 ：第 １４卷第 ４期
２０１６年 ７月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １４ Ｎｏ􀆰 ４
Ｊｕｌ􀆰 ２０１６
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１６􀆰 ０４􀆰 ００２
收稿日期：２０１５－０９－０２
基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３计划）（２０１１ＣＢＡ００８０７）；江苏省大学生创新项目（２０１５１０２９１０６５Ｙ）
作者简介：尤业兵（１９９１—），男，安徽六安人，研究方向：特种酵母培育及应用；缪冶炼（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｙｌｍｉａｏ＠ ｎｊｔｅｃｈ．ｅｄｕ．ｃｎ
海藻酸钙凝胶颗粒固定化抗冻酵母 ＡＦＹ １的
机制分析及条件优化
尤业兵１，缪冶炼１，陈介余２，季　 萌１，孙　 研１，许　 琳３
（１􀆰 南京工业大学 食品与轻工学院，江苏 南京 ２１１８００；２􀆰 日本秋田县立大学 生物资源学部，
秋田 ０１０ ０１９５，日本；３􀆰 南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 ２１１８００）
摘　 要：本文旨在开发抗冻酵母 ＡＦＹ １ 的海藻酸钙凝胶固定化技术，探明固定化机制。 在不同海藻酸钠浓度、
ＣａＣｌ２浓度和固化时间条件下制备固定化酵母，并在一定条件下进行乙醇发酵，分析发酵能力与酵母生长、凝胶颗
粒通透性之间的关系，然后通过响应面实验优化固定化条件。 实验结果显示，乙醇收率随凝胶颗粒通透性的增加
呈线性增加，而酵母生长与固定化条件无关，基本保持不变。 当固定化条件为海藻酸钠质量分数 １􀆰 ４５％、ＣａＣｌ２质量
分数 １７􀆰 ４５％、固化时间 １􀆰 ０９ ｈ时，固定化酵母的乙醇收率可达 ２４􀆰 １％，高于游离酵母的 ２０􀆰 ９％。 此外，固定化酵母的
生长能力明显强于游离酵母。 在固定化酵母的乙醇发酵中，每个三角瓶（２５０ ｍＬ）内的总细胞数从 ５􀆰 ０×１０８ 个增加到
大约 １１􀆰 ２×１０８ 个；而在游离酵母的乙醇发酵中，每个三角瓶内的总细胞数从 ５􀆰 ０×１０８ 个仅增加到 ７􀆰 ５×１０８ 个。
关键词：酵母；固定化；海藻酸钙凝胶；颗粒；通透性；发酵
中图分类号：Ｑ８１５　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１６）０４－０００５－０７
Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
ｆｒｅｅｚｅ⁃ｔｏｌｅｒａｎｔ ｙｅａｓｔ ＡＦＹ⁃１ ｗｉｔｈｉｎ Ｃａ⁃ａｌｇｉｎａｔｅ ｇｅｌ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ
ＹＯＵ Ｙｅｂｉｎｇ１，ＭＩＡＯ Ｙｅｌｉａｎ１，ＣＨＥＮ Ｊｉｅｙｕ２，ＪＩ Ｍｅｎｇ１，ＳＵＮ Ｙａｎ１，ＸＵ Ｌｉｎ３
（１􀆰 Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｌｉｇｈｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ；
２􀆰 Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｋｉｔａ Ｐｒｅｆｅｃｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ａｋｉｔａ ０１０⁃０１９５，Ｊａｐａｎ；
３􀆰 Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙ ａｉｍｅｄ ａｔ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｉｎｇ ｆｒｅｅｚｅ⁃ｔｏｌｅｒａｎｔ ｙｅａｓｔ ＡＦＹ⁃１ ｗｉｔｈｉｎ Ｃａ⁃ａｌｇｉｎａｔｅ ｇｅｌ
ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，ａｎｄ ｃｌａｒｉｆｙｉｎｇ ｉｔｓ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ． Ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｗａｓ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｕｎｄｅｒ ｖａｒｉｏｕｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
Ｎａ⁃ａｌｇｉｎａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ， ＣａＣｌ２ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｓｏｌｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｉｍｅｓ， ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｅｔｈａｎｏｌ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｙｅａｓｔｓ ｗｅｒｅ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｕｎｄｅｒ ａ ｐｒｅ⁃ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ． Ｔｈｅ
ｉｎｔｅｒｒｅｌａｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｂｉｌｉｔｙ， ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｇｅｌ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｗａｓ
ａｎａｌｙｚｅｄ． Ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ． Ｔｈｅ
ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｔｈａｎｏｌ ｙｉｅｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌｌｙ ｗｉｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ
ｇｅｌ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ， ｗｈｅｒｅａｓ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｄ ｎｏｔ ｃｈａｎｇｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ􀆰 Ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｗａｓ ａｔ ａ Ｎａ⁃ａｌｇｉｎａｔｅ ｍａｓｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ １􀆰 ４５％，ａ ＣａＣｌ２
ｍａｓｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ １７􀆰 ４５％ ａｎｄ ａ ｓｏｌｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｆ １􀆰 ０９ ｈ，ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｙｅａｓｔ ｈａｄ ａｎ ｅｔｈａｎｏｌ
ｙｉｅｌｄ ｏｆ ２４􀆰 １％，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ２０􀆰 ９％ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｆｒｅｅ ｙｅａｓｔ􀆰 Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｙｅａｓｔ
ｇｒｅｗ ｆａｓｔｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｆｒｅｅ ｙｅａｓｔ ｄｉｄ． Ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｃｅｌｌ ｎｕｍｂｅｒ ｉｎ ｅａｃｈ Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ ｆｌａｓｋ （２５０ ｍＬ） ｉｎｃｒｅａｓｅｄ
ｆｒｏｍ ５􀆰 ０×１０８ ｔｏ １１􀆰 ２×１０８ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｅｔｈａｎｏｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｙｅａｓｔ，ｗｈｉｌｅ ｉｔ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ
ｆｒｏｍ ５􀆰 ０×１０８ ｔｏ ７􀆰 ５×１０８ ｏｎｌｙ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｅｔｈａｎｏｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｆｒｅｅ ｙｅａｓｔ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｙｅａｓｔ； ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ； Ｃａ⁃ａｌｇｉｎａｔｅ ｇｅｌ； ｐａｒｔｉｃｌｅ； ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ； ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
　 　 随着酵母固定化技术的发展，固定化酵母在酿
酒［１－４］、香料生产［５］、生物合成［６］和生物转化［７］等生
物工程领域的应用越来越受到人们的关注。 酵母
的固定化不仅可提高细胞浓度，改善细胞对环境
（如温度、ｐＨ和抑制物）的耐受性，而且有利于酵母
的回收和再利用，实现连续操作，提高反应器的生
产性［４，８］。 采用固定化酵母生产葡萄酒，可使挥发
性酸度在 ７２ ｈ 内降低 ２８％、在 １６８ ｈ 内降低
６４％［３］。 在以橘子皮水解物为原料的香料生产中，
固定化酵母比游离酵母的生长能力强，并能生产出
更多的“水果”芳香物［５］。
海藻酸钠是从褐藻中提取的高分子化合物，无
毒性，价格低廉。 其中，海藻酸由 β Ｄ 甘露糖醛
酸（Ｍ单元）和 α Ｌ 古洛糖醛酸（Ｇ单元）经 １，４
糖苷键连接而成，具有 ＭＭ、ＭＧ 和 ＧＧ 等 ３ 种结构
片段。 在水溶液中，海藻酸钠中 Ｇ 单元上的 Ｎａ＋被
Ｃａ２＋等二价金属离子取代，形成乳白色的水凝
胶［９－１０］。 海藻酸钙凝胶具有生物相容性、亲水性以
及立体多孔结构，被认为是最合适的细胞和微生物
固定化载体之一［４，１１］。
在保证凝胶颗粒力学强度的同时，降低其内部
传质阻力，是目前酵母固定化研究的重点之一。
Ｎｅｄｏｖｉｃ＇等［１２］发明了一种海藻酸钙凝胶的静电造粒
法，凝胶颗粒直径为 ０􀆰 ５ ～ ０􀆰 ６ ｍｍ 时最有利于酵母
生长。 颗粒直径较小时，颗粒表面的细胞损失过
大；颗粒直径较大时，颗粒内部的传质阻力过大。
Ｙａｍａｇｉｗａ等［１３］采用两步法制备海藻酸钙胶囊。 随
着胶囊壁厚度的降低，酵母细胞浓度有所增加，但
是乙醇收率没有变化。 Ｃｈｅｎｇ 等［１４］在利用固定化
腈水解酶生产恶臭假单胞菌的研究中，通过向海藻
酸钙凝胶中添加成孔剂聚乙二醇（ＰＥＧ），使固定化
细胞的催化能力提高到游离细胞的同样水平。 ＰＥＧ
添加增加了凝胶颗粒的内部空隙，从而降低了传质
阻力，这是固定化细胞催化能力改善的主要原因。
然而另一方面，在固定化酵母的乙醇发酵中，以下
问题有待进一步探讨：固定化酵母的发酵能力与细
胞生长、凝胶颗粒内部传质能力之间存在怎样的定
量关系？ 什么是酵母固定化的最佳条件？
笔者在前期研究中以面包酵母 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＧＭＣＣ ２􀆰 １４２３为出发菌株，采用低温等离
子体诱变结合定向驯化的手段，培育出一株发酵能力
强、耐冷冻性好的酵母菌 Ｓ􀆰 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＦＹ １［１５］。 用
生理盐水制备的细胞悬液在－２０ ℃条件下冷冻保藏
３５ ｄ后，抗冻酵母 ＡＦＹ １的细胞存活率为 ８７􀆰 ３％，
远远高于其原始酵母的 ４６􀆰 ４％。 此外，抗冻酵母
ＡＦＹ １及原始酵母在新鲜面团中的发酵力同样为
７１４ ｍＬ，而当面团在－２０ ℃条件下冷冻保藏 ３５ ｄ
后，抗冻酵母 ＡＦＹ １的发酵力仍然维持在 ６０５ ｍＬ，
远远高于原始酵母的 １５０ ｍＬ。 定量分析结果表明，
酵母的抗冻能力与胞内海藻糖、谷氨酸、精氨酸、脯
氨酸、天冬氨酸、甘油等成分的含量显著相关［１６］。
本文旨在开发抗冻酵母 ＡＦＹ １ 的海藻酸钙凝
胶固定化技术，探明固定化机制。 在不同海藻酸钠
浓度、ＣａＣｌ２浓度和固化时间条件下制备固定化酵
母，并在一定条件下进行乙醇发酵。 分析发酵能力
与酵母生长、凝胶颗粒通透性之间的关系；并以乙
醇收率为响应值，通过响应面实验优化固定化条件。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 酵母
抗冻酵母菌种 ＡＦＹ １ 保存于 ４ ℃、ＹＰＤ 斜面
培养基。 使用时，用接种环将抗冻酵母菌种 ＡＦＹ １
接种至装有 １００ ｍＬ 种子培养基（葡萄糖 ２％，酵母
浸粉 １％，蛋白胨 ２％）的 ２５０ ｍＬ 三角瓶中，在 １８０
ｒ ／ ｍｉｎ、３０ ℃条件下振荡培养 ２１ ｈ至对数期后期，作
为种子液。
取 ５ ｍＬ种子液，接种至装有 １００ ｍＬ扩大培养基
（葡萄糖 ２２０ ｇ ／ Ｌ，酵母浸粉 ３０ ｇ ／ Ｌ，无机离子母液 ２０
ｍＬ ／ Ｌ，维生素母液 ２０ ｍＬ ／ Ｌ）的 ２５０ ｍＬ三角瓶中，在
１８０ ｒ ／ ｍｉｎ、３０ ℃条件下振荡培养 ２４ ｈ。 培养结束后，
３ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 １０ ｍｉｎ，收集菌体，用去离子水洗涤
２次，抽滤，得到鲜酵母泥。 血小板计数法的测定结
果表明，每克鲜酵母泥的细胞数为 ８􀆰 ４×１０９ ～９􀆰 ４×１０９
个（随酵母培养批次的不同而略有变化）。
６ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
１􀆰 ２　 试剂与仪器
海藻酸钠（相对分子质量 １２ ０００ ～ ８０ ０００；Ｍ ／ Ｇ
的摩尔比 １􀆰 ５６；在 １０ ｇ ／ Ｌ、２０ ℃条件下的黏度＞２
Ｐａ·Ｓ），Ｓｉｇｍａ公司；无水 ＣａＣｌ２（纯度＞９９％），汕头市
西陇化工厂有限公司。
ＢＴ５０ １Ｊ 型蠕动泵，保定兰格恒流泵有限公
司；ＨＪ ３型恒温磁力搅拌器，常州国华电器有限公
司；ＴＨＺ Ｄ型恒振荡器，太仓市实验设备厂；ＳＢＡ
４０Ｅ型生物传感分析仪，山东省科学院生物研究所。
１􀆰 ３　 酵母固定化
称取 ２ ｇ的鲜酵母泥，用适量的去离子水制得酵
母悬液。 另称取一定量的海藻酸钠，加入适量去离子
水，加热溶解，冷却至室温，制得海藻酸钠溶液。 将酵
母悬液和海藻酸钠溶液混合，用去离子水定容至 １００
ｍＬ，制得海藻酸钠 酵母混合液。 在蠕动泵的驱动
下，将海藻酸钠 酵母混合液通过硅胶软管和注射针
滴入轻微搅拌的 ＣａＣｌ２溶液中，固化一定时间。 固化
结束后，收集凝胶颗粒状的固定化酵母，用去离子水
洗涤 ３次，存放于 ４ ℃冰箱中备用。 海藻酸钠质量分
数分别设定为 ０􀆰 ５％、１􀆰 ０％、１􀆰 ５％、２􀆰 ０％和 ２􀆰 ５％；
ＣａＣｌ２质量分数分别设定为 ５％、１０％、１５％、２０％和
２５％；固化时间分别设定为 ０􀆰 ５、１、２、４和 ６ ｈ。
在本实验条件范围内，凝胶颗粒的大小（直径
２􀆰 ２ ｍｍ）以及每克凝胶颗粒的固定化酵母细胞数
（２􀆰 ０×１０８ ～ ２􀆰 ９×１０８ 个）基本一定。 在固定化酵母
细胞数测定中，取约 ２ ｇ 的凝胶颗粒，用适量 ５％柠
檬酸钠溶液将凝胶颗粒溶解，并定容至 ２５ ｍＬ。
１􀆰 ４　 乙醇发酵
将 ５０ ｍＬ发酵培养基（葡萄糖 ３５０ ｇ ／ Ｌ，酵母浸
粉 ６１ ｇ ／ Ｌ，蛋白胨 １０ ｇ ／ Ｌ）装入 １５０ ｍＬ 三角瓶中，
加入适量的游离酵母或固定化酵母，使每个三角瓶
内的总细胞数达到 ５􀆰 ０ × １０８ 个。 在 ３０ ℃、 １８０
ｒ ／ ｍｉｎ、无氧条件下发酵 ３０ ｈ。 发酵结束后，测定发
酵液的乙醇和残糖的质量浓度。 乙醇收率（Ｙ，％）
定义为发酵后发酵液乙醇质量浓度（ｇ ／ Ｌ）与发酵前
培养基糖质量浓度（ｇ ／ Ｌ）的百分比。 每个固定化酵
母的乙醇发酵实验重复 ３次，取平均值。
１􀆰 ５　 凝胶颗粒的通透性测定
将海藻酸钠溶液滴入 ＣａＣｌ２溶液中，制备出不
含酵母的凝胶颗粒（直径 ２􀆰 ２ ｍｍ）。 海藻酸钠浓
度、ＣａＣｌ２浓度和固化时间等凝胶颗粒制备条件与酵
母固定化相同。 取 ３０ ｇ凝胶颗粒于 １５０ ｍＬ 三角瓶
内，加入质量浓度为 １５０ ｇ ／ Ｌ的葡萄糖溶液 １００ ｍＬ，
在 ３０ ℃、１８０ ｒ ／ ｍｉｎ恒温摇床上振荡 ４ ｈ 后，测定葡
萄糖溶液的质量浓度。 凝胶颗粒的通透性 （ Ｐｅ，
ｇ ／ ｇ）定义为每克凝胶颗粒的葡萄糖吸收量（即浸泡
后葡萄糖溶液中葡萄糖的减少量，ｇ）。 每个凝胶颗
粒的通透性测定重复 ３次，取平均值。
１􀆰 ６　 发酵液的乙醇和残糖质量浓度测定
发酵液的乙醇和残糖质量浓度采用生物传感
分析仪进行测定。 每个发酵液的乙醇和残糖质量
浓度测定重复 ３次，取平均值。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 固定化条件对乙醇发酵能力的影响
当 ＣａＣｌ２质量分数为 １５％、固化时间为 ２ ｈ 时，
海藻酸钠质量分数对固定化酵母乙醇发酵能力的
影响如图 １所示。 由图 １ 可知：乙醇收率在０􀆰 ５％～
１􀆰 ０％的海藻酸钠质量分数范围内，随海藻酸钠质量
分数的增加而上升，但在 １􀆰 ０％ ～ ２􀆰 ５％的海藻酸钠
质量分数范围内，乙醇收率随海藻酸钠浓度的增加
而下降。 残糖质量浓度随海藻酸钠质量分数的变
化与乙醇收率相反。 当海藻酸钠质量分数为 １􀆰 ０％
时，乙醇收率和残糖质量浓度分别达到最高值
２２􀆰 ９％和最低值 １８􀆰 ９ ｇ ／ Ｌ。
图 １　 海藻酸钠质量分数对固定化酵母乙醇
发酵能力的影响
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｃａ⁃ａｌｇｉｎａｔｅ ｍａｓｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｅｔｈａｎｏｌ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｙｅａｓｔ
当海藻酸钠质量分数为 １􀆰 ５％、固化时间为 ２ ｈ
时，ＣａＣｌ２质量分数对固定化酵母乙醇发酵能力的影
响如图 ２所示。 由图 ２ 可知：在 ５％ ～ ２０％的 ＣａＣｌ２
质量分数范围内，乙醇收率随 ＣａＣｌ２质量分数的增
加而上升，但在 ２０％ ～ ２５％的范围内，随 ＣａＣｌ２质量
分数的增加而下降。 残糖质量浓度随 ＣａＣｌ２质量分
数的变化与乙醇收率相反。 当 ＣａＣｌ２质量分数为
２０％时，乙醇收率和残糖质量浓度分别达到最高值
７　 第 ４期 尤业兵等：海藻酸钙凝胶颗粒固定化抗冻酵母 ＡＦＹ １的机制分析及条件优化
２３􀆰 ６％和最低值 １４􀆰 ６ ｇ ／ Ｌ。
图 ２　 ＣａＣｌ２质量分数对固定化酵母乙醇发酵能力的影响
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＣａＣｌ２ ｍａｓｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｅｔｈａｎｏｌ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｙｅａｓｔ
当海藻酸钠质量分数为 １􀆰 ５％、ＣａＣｌ２质量分数
为 １５％时，固化时间对固定化酵母乙醇发酵能力的
影响如图 ３ 所示。 由图 ３ 可知：当固化时间小于
１􀆰 ０ ｈ时，乙醇收率随固化时间的延长而略有增加；
当固化时间大于 １􀆰 ０ ｈ 时，乙醇收率与固化时间无
关，基本保持在 ２２􀆰 ２％。 残糖质量浓度随固化时间
的变化与乙醇收率相反。 当固化时间大于 １􀆰 ０ ｈ
时，残糖质量浓度基本保持在 ２２􀆰 ０ ｇ ／ Ｌ。
图 ３　 固化时间对固定化酵母乙醇发酵能力的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｏｌｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｎ ｅｔｈａｎｏｌ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｙｅａｓｔ
在乙醇发酵过程中，部分固定化酵母会从凝胶
颗粒内渗漏出来，成为游离酵母。 发酵液中游离酵
母和固定化酵母的细胞数测定结果表明，在本研究
的实验条件范围内，固定化酵母的生长基本不受固
定化条件的影响。 发酵前，每毫升发酵液的游离酵
母细胞数为 ０个，每克凝胶颗粒的固定化酵母细胞
数为 ２􀆰 ０×１０８ ～２􀆰 ９×１０８ 个，每个三角瓶（发酵液 ５０
ｍＬ，凝胶颗粒 １􀆰 ７～２􀆰 ５ ｇ）内的总细胞数为 ５􀆰 ０×１０８
个。 发酵后，每毫升发酵液的游离酵母细胞数为
４􀆰 ０×１０６ ～６􀆰 ５×１０６ 个，每克凝胶颗粒的固定化酵母
细胞数为 ２􀆰 ５×１０８ ～ ３􀆰 ５×１０８ 个，每个三角瓶（发酵
液 ５０ ｍＬ，凝胶颗粒 ２􀆰 ５ ～ ３􀆰 １ ｇ）内的总细胞数为
８􀆰 ３×１０８ ～ １４􀆰 １×１０８ 个。 发酵后，三角瓶内固定化
酵母的细胞数是游离酵母的 ３ 倍左右，固定化酵母
在乙醇发酵中起着主要作用。
一般来说，酵母在有氧条件下进行呼吸和细胞
生长，而在厌氧条件下进行发酵和乙醇生产［１７］。 在
本研究的乙醇发酵过程中，密闭三角瓶内无外部 Ｏ２
补充，酵母的呼吸作用和细胞生长只能在有限的有
氧范围进行。 当三角瓶内的 Ｏ２耗尽后，酵母即停止
呼吸作用和细胞生长，仅进行发酵作用和乙醇生
产。 这是固定化酵母生长与固定化条件无关的原
因。 此外，在乙醇发酵过程中，固定化酵母一方面
不断生长，另一方面有部分从凝胶颗粒内渗漏出
来，因而固定化酵母细胞数是一个复杂的动态平衡。
２􀆰 ２　 乙醇发酵能力与凝胶颗粒通透性的关系
如上所述，各条件下制备的固定化酵母在乙醇
发酵中的生长基本相同。 因此可以认为，固定化酵
母的生长没有影响其乙醇发酵。 然而，另一方面，
凝胶颗粒的通透性随海藻酸钠浓度、ＣａＣｌ２浓度和固
化时间等条件而变化，从而影响了固定化酵母的乙
醇发酵能力。 图 ４表示固定化酵母乙醇发酵中乙醇
收率与凝胶颗粒通透性的关系。 乙醇收率（Ｙ，％）
随凝胶颗粒通透性（Ｐｅ，ｇ ／ ｇ）的增加呈线性增加，其
关系可用经验公式（１）表示：
Ｙ ＝ １５５􀆰 ９２Ｐｅ － ２􀆰 １４ 　 （Ｒ２ ＝ ０􀆰 ８７５ ４） （１）
　 　 在一定的环境条件下，凝胶颗粒的通透性代表
了培养基中营养成分向颗粒内部移动以及发酵产
物向颗粒外部移动的难易程度。 通透性越大，颗粒
内部的传质阻力越小，越有利于乙醇发酵。 特别需
要注意的是，在固定化酵母的啤酒发酵中，凝胶颗
粒通透性还会影响到啤酒产品的质量。 如果凝胶
颗粒通透性过小或酵母的生长不良，则联二酮、高
级醇、酯类、有机酸、含硫化合物等风味物质的含量
发生较大偏差［１２，１８］。
２􀆰 ３　 通过响应面优化的酵母固定化条件
以酵母固定化中的海藻酸钠质量分数（ｘ１，％）、
ＣａＣｌ２质量分数（ｘ２，％）和固化时间（ｘ３，ｈ）为影响因
素，以固定化酵母乙醇发酵中的乙醇收率（Ｙ，％）为
响应值，利用 Ｂｏｘ⁃Ｂｅｈｎｋｅｎ Ｄｅｓｉｇｎ （ＢＢＤ） 法设计响
应面实验，其因素和水平见表 １。 根据单因素实验
结果，海藻酸钠质量分数、ＣａＣｌ２质量分数和固化时
间在 ０水平分别设定为 １􀆰 ０％、２０􀆰 ０％和 １􀆰 ０ ｈ。
８ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
图 ４　 固定化酵母乙醇发酵中乙醇收率与凝胶
颗粒通透性的关系
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｅｔｈａｎｏｌ ｙｉｅｌｄ ｉｎ ｅｔｈａｎｏｌ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｙ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｙｅａｓｔ ａｎｄ ｔｈｅ
ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｇｅｌ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ
表 １　 响应面实验中各因素的水平
Ｔａｂｌｅ １　 Ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｅａｃｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ
ｓｕｒｆａｃｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ
水平 ｘ１ ／ ％ ｘ２ ／ ％ ｘ３ ／ ｈ
－１􀆰 ６８２ ０􀆰 １６ １１􀆰 ５９ ０􀆰 １６
－１ ０􀆰 ５ １５􀆰 ０ ０􀆰 ５
０ １􀆰 ０ ２０􀆰 ０ １􀆰 ０
１ １􀆰 ５ ２５􀆰 ０ １􀆰 ５
１􀆰 ６８２ １􀆰 ８４ ２８􀆰 ４１ １􀆰 ８４
表 ２表示响应面实验的条件和结果。
利用软件 Ｄｅｓｉｇｎ⁃Ｅｘｐｅｒｔ ８􀆰 ０􀆰 ６ 进行乙醇收率与
海藻酸钠质量分数、ＣａＣｌ２质量分数、固化时间之间
的二次多项式回归，得到式（２）。
Ｙ ＝ １２􀆰 ５５ ＋ １１􀆰 １１ｘ１ ＋ ０􀆰 １５ｘ２ ＋ ５􀆰 ２３ｘ３ ＋
０􀆰 ０９ｘ１ｘ２ － ０􀆰 ０９ｘ１ｘ３ － ０􀆰 ０３ｘ２ｘ３ －
５􀆰 ０５ｘ１ ２ － ７􀆰 ０ｘ２ ２ － ２􀆰 １５ｘ３ ２ （２）
　 　 回归方程式（２）的决定系数 Ｒ２ ＝ ０􀆰 ９８４，说明乙
醇收率的预测值与实验值之间相关性较好。 此外，
如方差分析结果 （表 ３） 所示，回归模型的 Ｆ ＝
５８􀆰 ７３，Ｐ＜０􀆰 ０００ １，且失拟项的 Ｐ＞０􀆰 ０５，表明回归模
型具有显著性。 ｘ１、ｘ２、ｘ１ｘ２的 Ｐ＜ ０􀆰 ０５，ｘ３、ｘ１ｘ３、ｘ２ｘ３
的 Ｐ＞ ０􀆰 ０５，表明海藻酸钠浓度和 ＣａＣｌ２浓度对乙醇
发酵的影响显著，海藻酸钠浓度和 ＣａＣｌ２浓度之间
存在交互作用，而固化时间对乙醇发酵无显著影
响，固化时间与海藻酸钠浓度、ＣａＣｌ２浓度之间不存
在交互作用。 图 ５表示固定化酵母乙醇发酵中乙醇
收率随海藻酸钠和 ＣａＣｌ２质量分数的变化。 从响应
面可以看出，乙醇收率的最大值（极值）存在于实验
条件范围内。
表 ２　 响应面实验的条件和结果
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ
ｓｕｒｆａｃｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ
编号 ｘ１ ｘ２ ｘ３ Ｙ ／ ％
１ ０ －１􀆰 ６８２ ０ ２３􀆰 ６
２ ０ ０ ０ ２３􀆰 １
３ １ －１ １ ２２􀆰 ６
４ ０ １􀆰 ６８２ ０ ２２􀆰 ４
５ －１ １ １ １９􀆰 ８
６ １􀆰 ６８２ ０ ０ ２２􀆰 ９
７ －１ －１ １ １９􀆰 ３
８ －１ １ －１ １９􀆰 ３
９ ０ ０ １􀆰 ６８２ ２２􀆰 ４
１０ ０ ０ ０ ２３􀆰 ３
１１ １ １ １ ２２􀆰 ９
１２ ０ ０ ０ ２３􀆰 ４
１３ １􀆰 ６８２ ０ ０ １７􀆰 １
１４ １ １ １ １９􀆰 ２
１５ １ １ １ ２２􀆰 ４
１６ ０ ０ －１􀆰 ６８２ ２０􀆰 ０
１７ ０ ０ ０ ２３􀆰 ４
１８ １ －１ －１ ２３􀆰 １
１９ ０ ０ ０ ２３􀆰 ６
２０ ０ ０ ０ ２３􀆰 ６
通过对回归方程式（２）的极值分析可以预测，
乙醇收率在海藻酸钠质量分数 １􀆰 ４５％、ＣａＣｌ２质量分
数 １７􀆰 ４５％、固化时间 １􀆰 ０９ ｈ 的条件下取得最大值
２３􀆰 ７％。 与此相对应，在该条件下进行酵母固定化
及乙醇发酵实验并重复 ３ 次，得到乙醇收率的测定
值 ２４􀆰 １％。 预测值与测定值基本一致，表明回归方
程式（２）可信。
本研究在与固定化酵母乙醇发酵相同的条件
下进行了游离酵母乙醇发酵。 在游离酵母乙醇发
酵中，乙醇收率为 ２０􀆰 ９％。 发酵前，每毫升发酵液
的游离酵母细胞数为 １􀆰 ０×１０７ 个，每个三角瓶（发
酵液 ５０ ｍＬ）内的总细胞数为 ５􀆰 ０×１０８ 个；发酵后，
每毫升发酵液的游离酵母细胞数为 １􀆰 ５×１０７ 个，每
个三角瓶（发酵液 ５０ ｍＬ）内的总细胞数仅为 ７􀆰 ５×
１０８ 个。 通过乙醇发酵结果的比较可以发现，固定
化酵母的生长和乙醇发酵能力明显强于游离酵母。
９　 第 ４期 尤业兵等：海藻酸钙凝胶颗粒固定化抗冻酵母 ＡＦＹ １的机制分析及条件优化
表 ３　 回归模型方差分析
Ｔａｂｌｅ ３　 Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｍｏｄｅｌ
变量 平方和 自由度 均方 Ｆ值 Ｐ值
模型 ５３􀆰 ８９ ９ ５􀆰 ９９ ５８􀆰 ７３ ＜０􀆰 ０００ １
ｘ１ ２６􀆰 ６４ １ ２６􀆰 ６４ ３０４􀆰 ２６ ＜０􀆰 ０００ １
ｘ２ １􀆰 １１ １ １􀆰 １１ １２􀆰 ６４ ０􀆰 ００５ ２
ｘ３ ０􀆰 ３８ １ ０􀆰 ３８ ４􀆰 ３５ ０􀆰 ０６３ ７
ｘ１ｘ２ ０􀆰 ４４ １ ０􀆰 ４４ ４􀆰 ９９ ０􀆰 ０４９ ５
ｘ１ｘ３ ０􀆰 ００３ ６ １ ０􀆰 ００３６ ０􀆰 ０４１ ０􀆰 ０８４ ３
ｘ２ｘ３ ０􀆰 ０３３ １ ０􀆰 ０３３ ０􀆰 ３７ ０􀆰 ５５５ ９
ｘ１ ２ ２２􀆰 ９６ １ ２２􀆰 ９６ ２６２􀆰 １７ ＜０􀆰 ０００ １
ｘ２ ２ ０􀆰 ４４ １ ０􀆰 ４４ ５􀆰 ０４ ０􀆰 ０４８ ６
ｘ３ ２ ４􀆰 １６ １ ４􀆰 １６ ４７􀆰 ５２ ＜０􀆰 ０００ １
失拟项 ０􀆰 ８５ ５ ０􀆰 １７ ４􀆰 ８８ ０􀆰 ０５３ ４
图 ５　 固定化酵母乙醇发酵中乙醇收率随海藻酸钠和
ＣａＣｌ２质量分数的变化
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌ ｙｉｅｌｄ ｉｎ ｔｈｅ ｅｔｈａｎｏｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ｂｙ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｙｅａｓｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ
ｓｏｄｉｕｍ ａｌｇｉｎａｔｅ ａｎｄ ＣａＣｌ２
３　 结论
在不同海藻酸钠浓度、ＣａＣｌ２浓度和固化时间条
件下进行抗冻酵母 ＡＦＹ １ 的海藻酸钙凝胶固定
化，并在一定条件下进行乙醇发酵，讨论了固定化
对酵母乙醇发酵的影响及其机制，得到结论如下：
１）海藻酸钠和 ＣａＣｌ２浓度是影响凝胶颗粒通透
性和固定化酵母乙醇发酵能力的主要影响因素。
２）在固定化酵母的乙醇发酵中，乙醇收率随凝
胶颗粒通透性的增加呈线性增加，而酵母生长与固
定化条件无关，基本保持不变。
３）当固定化条件为海藻酸钠质量分数 １􀆰 ４５％、
ＣａＣｌ２质量分数 １７􀆰 ４５％、固化时间 １􀆰 ０９ ｈ 时，固定
化酵母的乙醇收率可达 ２４􀆰 １％，高于游离酵母
的 ２０􀆰 ９％。
４）在固定化酵母的乙醇发酵中，每个三角瓶内
的总细胞数从 ５􀆰 ０×１０８ 个增加到大约 １１􀆰 ２×１０８ 个，
而在游离酵母的乙醇发酵中，每个三角瓶内的细胞
数从 ５􀆰 ０×１０８ 个仅增加到 ７􀆰 ５×１０８ 个。 固定化酵母
的生长能力明显强于游离酵母。
固定化酵母 ＡＦＹ １的发酵速度和重复使用性
能将成为下一步的研究内容。
参考文献：
［ １ ］ 　 ＶＥＲＢＥＬＥＮ Ｐ Ｊ， ＳＣＨＵＴＴＥＲ Ｄ Ｐ Ｄ， ＤＥＬＶＡＵＸ Ｆ， ｅｔ ａｌ．
Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｙｅａｓｔ ｃｅｌｌ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］ ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ，２００６，２８（１９）：１５１５⁃１５２５．
［ ２ ］ 　 ＡＬＭＯＮＡＣＩＤ Ｓ Ｆ， ＮÁＪＥＲＡ Ａ Ｌ， ＹＯＵＮＧ Ｍ Ｅ， ｅｔ ａｌ． Ａ
ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｓｔｏｕｔ ｂｅｅｒ ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｆｒｅｅ ａｎｄ
ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｙｅａｓｔｓ［ Ｊ］ ． Ｆｏｏｄ Ｂｉｏｐｒｏｃ Ｔｅｃｈ，２０１２，５（ ２）：
７５０⁃７５８．
［ ３ ］ 　 ＶＩＬＥＬＡ Ａ，ＳＣＨＵＬＬＥＲ Ｄ，ＭＥＮＤＥＳ⁃ＦＡＩＡ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｖｏｌａｔｉｌｅ ａｃｉｄｉｔｙ ｏｆ ａｃｉｄｉｃ ｗｉｎｅｓ ｂｙ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｃｅｌｌｓ ［ Ｊ］ ． Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１３，９７ （ １１）：
４９９１⁃５０００．
［ ４ ］ 　 ＢＥＨＥＲＡ Ｓ，ＲＡＹ Ｒ Ｃ． Ｂａｔｃｈ ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｃａｓｓａｖａ
（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ Ｃｒａｎｔｚ．） ｆｌｏｕｒ ｕｓｉｎｇ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ｃｅｌｌ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｉｎ ｃａｌｃｉｕｍ ａｌｇｉｎａｔｅ ［ Ｊ］ ． Ａｎｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１４，
ｄｏｉ：１０．１００７ ／ ｓ１３２１３⁃０１４⁃０９１８⁃８．
［ ５ ］ 　 ＬＡＬＯＵ Ｓ，ＭＡＮＴＺＯＵＲＩＤＯＵ Ｆ，ＰＡＲＡＳＫＥＶＰＯＵＬＯＵ Ａ，ｅｔ ａｌ．
Ｂｉｏｆｌａｖｏｕｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｏｒａｎｇｅ ｐｅｅｌ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ｕｓｉｎｇ
ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ［ Ｊ］ ． Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔ，
２０１３，９７（２１）：９３９７⁃９４０７．
［ ６ ］ 　 ＯＵ Ｚ， ＺＨＡＯ Ｈ， ＴＡＮＧ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ
ｄｕｌｏｘｅｔｉｎｅ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ （ Ｓ ）⁃（⁃）⁃３⁃Ｎ⁃ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ⁃１⁃（ ２⁃
ｔｈｉｅｎｙｌ）⁃１⁃ｐｒｏｐａｎｏｌ ｕｓｉｎｇ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｉｎ
ｌｉｑｕｉｄ⁃ｃｏｒｅ ｓｏｄｉｕｍ ａｌｇｉｎａｔｅ ／ ｃｈｉｔｏｓａｎ ／ ｓｏｄｉｕｍ ａｌｇｉｎａｔｅ
ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ ［ Ｊ ］ ． Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｓｙｓｔ Ｅｎｇ， ２０１４， ３７ （ １１ ）：
２２４３⁃２２５０．
［ ７ ］ 　 ＦＥＮＧ Ｃ， ＪＩＮ Ｓ， ＸＩＡ Ｘ Ｘ， ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ
ｓｏｐｈｏｒｉｃｏｓｉｄｅ ｔｏ ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ｆｒｕｃｔｕｓ ｓｏｐｈｏｒａｅ ｕｓｉｎｇ
ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ａｎｄ ｙｅａｓｔ ［ Ｊ ］ ． Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｍｉｃｒｏｂ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１４，ｄｏｉ：１０．１００７ ／ ｓ１１２７４⁃０１４⁃１７７７⁃ｙ．
［ ８ ］ 　 ＷＥＳＴＭＡＮ Ｊ Ｏ，ＹＬＩＴＥＲＶＯ Ｐ，ＦＲＡＮＺéＮ Ｃ Ｊ，ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ
ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ
ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ［ Ｊ］ ．Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１２，９６
（６）：１４４１⁃１４５４．
［ ９ ］ 　 ＧＥＯＲＧＥ Ｍ，ＥＭＩＬＩＡ ＡＢＲＡＨＡＭ Ｔ． Ｐｏｌｙｉｏｎｉｃ ｈｙｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄｓ ｆｏｒ
ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇｓ： ａｌｇｉｎａｔｅ ａｎｄ ｃｈｉｔｏｓａｎ：ａ
ｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］ ．Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，２００６，１１４（１）：１⁃１４．
［１０］ 　 ＦＡＮＧ Ｙ， ＡＬ⁃ＡＳＳＡＦ Ｓ， ＰＨＩＬＬＩＰＳ Ｇ Ｏ． Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｔｅｐｓ ａｎｄ
ｃｒｉｔｉｃａｌ ｂｅｈａｖｉｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ｔｏ ａｌｇｉｎａｔｅ［Ｊ］ ．Ｊ Ｐｈｙｓ
Ｃｈｅｍ Ｂ，２００７，１１１，２４５６⁃２４６２．
０１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
［１１］　 ＫＵＭＡＲＩ Ｓ， ＰＡＮＥＳＡＲ Ｐ Ｓ， ＢＥＲＡ Ｍ Ｂ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ
ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｐｈｙｓｉｃｏ⁃ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｃｅｌｌｓ
ｅｎｔｒａｐｐｅｄ ｗｉｔｈ ａｌｇｉｎａｔｅ ａｎｄ ｈｙｂｒｉｄ ｂｅａｄｓ［Ｊ］ ．Ｉｒａｎ Ｐｏｌｙｍ Ｊ，２０１４，
２３（２）：１１１⁃１１９．
［１２］ 　 ＮＥＤＯＶＩＣ＇ Ｖ Ａ，ＯＢＲＡＤＯＶＩＣ＇ Ｂ，ＬＥＳＫＯŠＥＫ⁃Ｃˇ ＵＫＡＬＯＶＩＣ＇ Ｉ，ｅｔ
ａｌ． Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｇｉｎａｔｅ ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ ｌｏａｄｅｄ ｗｉｔｈ
ｂｒｅｗｉｎｇ ｙｅａｓｔ［Ｊ］ ．Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００１，３７（１）：１７⁃２２．
［１３］ 　 ＹＡＭＡＧＩＷＡ Ｋ， ＳＨＩＭＩＺＵ Ｙ， ＫＯＺＡＷＡ Ｔ， ｅｔ ａｌ． Ｅｔｈａｎｏｌ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ａｎｄ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｙｅａｓｔ［Ｊ］ ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
Ｔｅｃｈ，１９９４，８（４）：２７１⁃２７４．
［１４］ 　 ＣＨＥＮＧ Ｙ，ＭＡ Ｌ，ＤＥＮＧ Ｃ，ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＰＥＧ⁃ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｏｒｅ
ｆｏｒｍｉｎｇ ｏｎ Ｃａ⁃ａｌｇｉｎａｔｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｉｔｒｉｌａｓｅ⁃ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
ｂａｃｔｅｒｉａ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＸＹ４ ［ Ｊ］ ．Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｓｙｓｔ Ｅｎｇ，
２０１４，３７（８）：１６５３⁃１６５８．
［１５］ 　 缪冶炼，时晓剑，陈玲，等．一株抗冻能力强的面包酵母及其
在冷冻生胚加工中的应用： ＺＬ２０１３１０１３５０２１． Ｘ ［ Ｐ ］． ２０１４⁃
０９⁃１７．
［１６］ 　 ＳＨＩ Ｘ，ＭＩＡＯ Ｙ，ＣＨＥＮ Ｊ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｆｒｅｅｚｅ
ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｉｎ ｂａｋｅｒ’ｓ ｙｅａｓｔｓ［Ｊ］ ．Ａｐｐｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ，２０１４，１７２： ３０４２⁃３０５３．
［１７］ 　 ＳＥＲＩＯ Ｍ Ｄ，ＴＥＳＳＥＲ Ｒ，ＳＡＮＴＡＣＥＳＡＲＩＡ Ｅ．Ａ ｋｉｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｍａｓｓ
ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｏｄｅｌ ｔｏ ｓｉｍｕｌａｔｅ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｂａｋｅｒ􀆳ｓ ｙｅａｓｔ ｉｎ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ
ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ［Ｊ］ ．Ｃｈｅｍ Ｅｎｇ Ｊ，２００１，８２，３４７⁃３５４．
［１８］ 　 ＨＡＹＥＳ Ｓ Ａ，ＰＯＷＥＲ Ｊ，ＲＹＤＥＲ Ｄ Ｓ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ
ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｂｒｅｗｉｎｇ ［ Ｊ］ ． Ｂｒｅｗ Ｄｉｇ， １９９１， ６６：
２８⁃３３．
（责任编辑　 管珺）
􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌
（上接第 ４页）
以上。 以预水解液混合糖液为菌种培养碳源，可使
米根霉生物量有效增殖，进而采用栗苞酶解液作为
发酵碳源，富马酸质量浓度达到 １５􀆰 ７８ ｇ ／ Ｌ，糖酸转
化率为 ０􀆰 ３４ ｇ ／ ｇ，证明板栗栗苞生物质作为发酵碳
源具有可行性。
参考文献：
［ １ ］　 顾夕梅，周瑾，陈云，等．碱处理玉米芯米根霉同步糖化发酵
产富马酸［Ｊ］ ．生物加工过程，２０１５，１３（６）：１３⁃１７．
［ ２ ］ 　 ＸＵ Ｑ，ＬＩ Ｓ，ＨＵＡＮＧ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｋｅｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ ｂｙ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ［ Ｊ］ ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｄｖ，
２０１２，３０：１６８５⁃１６９６．
［ ３ ］ 　 李霜，徐晴，黄和．发酵法制备富马酸的关键技术及其进展
［Ｊ］ ．生物加工过程，２０１３，１１（２）：５２⁃５７．
［ ４ ］ 　 ＹＵ Ｓ，ＨＵＡＮＧ Ｄ，ＷＥＮ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ａ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ
ｏｒｙｚａｅ ｆｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｆｅｍｔｏｓｅｃｏｎｄ
ｌａｓｅｒ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ［Ｊ］ ．Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ Ｔｅｃｈｎｏｌ，２０１２，１１４：６１０⁃６１５．
［ ５ ］ 　 徐桂转，常春．纤维素生物质新型水解技术的研究进展［ Ｊ］ ．生
物加工过程，２０１２，１０（３）：７１⁃７６．
［ ６ ］ 　 方诩，秦玉琪，李雪芝，等．纤维素酶与木质纤维素生物降解
转化的研究进展［Ｊ］ ．生物工程学报，２０１０，２６（７）：８６４⁃８６９．
［ ７ ］ 　 ＨＡＮ Ｑ，ＪＩＮ Ｙ，ＪＡＭＥＥＬ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ａｕｔｏｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ
ｗａｓｔｅ ｗｈｅａｔ ｓｔｒａｗ ｆｏｒ ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ ｅｎｔｈａｎｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｃｏ⁃
ｌｏｃａｔｅｄ ｓｔｒａｗ ｐｕｌｐ ｍｉｌｌ［Ｊ］ ．Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１５，１７５：
１１９３⁃１２１０．
［ ８ ］ 　 杨志斌，杨柳，徐向阳．板栗加工现状及剩余物利用前景［ Ｊ］ ．
湖北林业科技，２００７（１）：５７⁃５９．
［ ９ ］ 　 李昌春，王雪峰，魏先敏，等．板栗蒲壳栽培香菇试验初报［ Ｊ］ ．
食用菌，１９９３（１）：１５．
［１０］ 　 雷潇，徐向阳．罗田县利用板栗苞壳栽培食用菌技术取得突
破［Ｊ］ ．湖北林业科技，２０１２（６）：６２．
［１１］ 　 陈牧，黄阳，连之娜，等．玉米秸秆不同部位的组成及其对预
处理的影响［Ｊ］ ．生物加工过程，２０１０，８（６）：２８⁃３２．
［１２］ 　 荆磊，金永灿，张厚民，等．自水解预处理对稻草化学成分及
酶解性能的影响［Ｊ］ ．纤维素科学与技术，２０１０，１８（２）：１⁃１０．
［１３］ 　 ＸＵ Ｑ，ＬＩ Ｓ，ＦＵ Ｙ，ｅｔ ａｌ． Ｔｗｏ⁃ｓｔａｇｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｎ ｓｔｒａｗ ｂｙ
Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ ｆｏｒ ｆｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ［ Ｊ ］ ． Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ
Ｔｅｃｈｎｏｌ，２０１０，１０１：６２６２⁃６２６４．
［１４］ 　 ＶＩＡＬＬＹ Ｇ， ＭＡＲＣＨＡＬ Ｒ， ＧＵＩＬＢＥＲＴ Ｎ． Ｌ （ ＋ ） Ｌａｃｔａｔｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ａｎｄ ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｂｙ
Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＵＭＩＰ ４． ７７ ［ Ｊ］ ． Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，
２０１０，２６（４）：６０７⁃６１４．
［１５］ 　 窦畅，徐晴，宋萍，等．米根霉利用木糖与葡萄糖的代谢差异
［Ｊ］ ．微生物学报，２０１１，５１（４）：４６８⁃４７３．
（责任编辑　 荀志金）
１１　 第 ４期 尤业兵等：海藻酸钙凝胶颗粒固定化抗冻酵母 ＡＦＹ １的机制分析及条件优化