全 文 ：第 １３卷第 ３期
２０１５年 ５月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ３
Ｍａｙ ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０３􀆰 ００４
收稿日期：２０１４－０５－０６
基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３计划）重大项目（２０１２ＡＡ０２２２０５）；国家重点基础研究发展计划（９７３计划）（２０１１ＣＢ７１０８００）
作者简介：承龙飞（１９８８—），男，江苏宜兴人，硕士研究生，研究方向：生物化工；何冰芳（联系人），教授，博士生导师，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｂｉｎｇｆａｎｇｈｅ＠ ｎｊｔｅｃｈ．ｅｄｕ．ｃｎ
蜡样芽胞杆菌蛋白酶的克隆及在枯草芽胞杆菌
系统中的高效表达
承龙飞，朱富成，刘可可，何冰芳
（南京工业大学 生物与制药工程学院， 江苏 南京 ２１１８００）
摘　 要：基于来源于 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ＷＱ９ ２ 的耐有机溶剂蛋白酶 ＷＱ 的液相色谱 双质谱（ＬＣ ＭＳ ＭＳ）分析结
果，设计引物，克隆耐有机溶剂蛋白酶ＷＱ的基因，测序分析表明该蛋白酶的开放阅读框（ＯＲＦ）大小为 １ ７０１ ｂｐ，编
码 ５６６个氨基酸，其中含有信号肽（２８个氨基酸）、前肽（２２０ 个氨基酸）及成熟肽序列（含 ９５４ ｂｐ 编码 ３１８ 个氨基
酸），相对分子质量约为 ３􀆰 ７×１０４。 将不带自身信号肽的蛋白酶基因 ａｐｒＷＱ插入穿梭质粒 ｐＭＡ５中，构建了表达载
体 ｐＭＡ５ ／ ａｐｒＷＱ。 该表达载体导入枯草芽胞杆菌 ＷＢ６００中获得阳性重组子 ＷＢ６００ ｐＭＡ５ ／ ａｐｒＷＱ，通过优化培养
基成分以及培养条件，重组子发酵产蛋白酶体积酶活达到 １７ ４００ Ｕ ／ ｍＬ，约为高产野生菌产酶量的 ５倍。 重组蛋白
酶在多种有机溶剂（体积分数为 ５０％）中表现出了良好的耐受性，验证了重组菌表达的蛋白酶与来源于 Ｂ􀆰 ｃｅｒｅｕｓ
ＷＱ９ ２的耐有机溶剂蛋白酶性质一致，该耐有机溶剂蛋白酶的高效表达为进一步发挥其高效生物催化作用等实
际应用奠定了基础。
关键词：耐有机溶剂蛋白酶；枯草芽胞杆菌；高表达；发酵优化
中图分类号：Ｑ７８６　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０３－００２０－０６
Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｏｖｅｒ⁃ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ
ＷＱ９⁃２ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ
ＣＨＥＮＧ Ｌｏｎｇｆｅｉ，ＺＨＵ Ｆｕｃｈｅｎｇ，ＬＩＵ Ｋｅｋｅ，ＨＥ Ｂｉｎｇｆａｎｇ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ⁃ｍａｓｓ⁃ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ （ＬＣ⁃ＭＳ⁃ＭＳ） ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｒｙｐｓｉｎ⁃
ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｏｌｖｅｎｔ⁃ｓｔａｂｌｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ＷＱ ｆｒｏｍ ａ ｓｏｌｖｅｎｔ⁃ｓｔａｂｌｅ ｓｔｒａｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ
ＷＱ９⁃２，ｓｏｌｖｅｎｔ⁃ｓｔａｂｌｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｌｏｎｅｄ． Ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｃｏｎｔａｉｎｓ ａｎ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ ｏｆ
１ ７０１ ｂｐ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｐｒｅ⁃ｐｒｏ⁃ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｚｙｍｅ ｏｆ ５６６ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（２８⁃ａａ ｐｒｅ⁃ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ，２２０⁃ａａ ｐｒｏ⁃
ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ３１８⁃ａａ ｍａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ ｏｆ ３􀆰 ７×１０４）． Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＭＡ５ ／
ａｐｒＷＱ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ ｉｎｓｅｒｔｉｎｇ ｔｈｅ ａｐｒＷＱ ｇｅｎｅ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＡ５ ｗｉｔｈｏｕｔ ｎａｔｉｖｅ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ． Ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｗａｓ １７ ４００ Ｕ ／ ｍＬ，５ ｆｏｌｄ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ
ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ，ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｏｌｖｅｎｔ⁃ｓｔａｂｌｅ
ｐｒｏｔｅａｓｅ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｔｏ ｔｈｅ ｎａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ． Ｔｈｅ ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ
ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔ⁃ｓｔａｂｌｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｓｏｌｖｅｎｔ⁃ｓｔａｂｌｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ； Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ； ｏｖｅｒ⁃ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ； ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ
　 　 蛋白酶广泛应用于食品、制药、纺织等领域，在世
界酶类销售市场中占有主要地位［１－２］。 蛋白酶为典
型的水解酶，通常在水相中催化肽链水解反应，而在
非水相中，往往其逆反应占主导地位，能够催化肽链
的合成［３－４］。 利用蛋白酶进行有机相催化反应有诸
多优势：使水解反应的热力学平衡转向合成反应，抑
制不良反应的进行，提高底物溶解度和改变底物特异
性等。 然而，大多数蛋白酶在高浓度亲水性有机溶剂
中易于失活、酶活力低、稳定性差，限制了蛋白酶在有
机相催化中的应用［５－６］。 耐有机溶剂蛋白酶能耐受
高浓度的亲水性有机溶剂，可应用于催化肽合成以及
手性药物拆分等反应［７］。
近年来，耐有机溶剂蛋白酶不断地被发现和开
发，多数耐有机溶剂蛋白酶来自于极端微生物，并
且以 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ 属和 Ｂａｃｉｌｌｕｓ 属细菌居多［８－１３］。
然而大多数的极端微生物产酶能力弱，限制了这类
高性能的耐有机溶剂蛋白酶的使用。 为了进一步
开发并拓宽这类酶的应用，基因工程的方法是一种
有效的手段。 Ｏｇｉｎｏ等［１４］筛选到了 １ 株耐有机溶剂
蛋白酶产生菌 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＳＴ ０１，并
在大肠杆菌宿主中对 ＰＳＴ ０１ 蛋白酶进行了克隆
表达，但表达的酶产量较低，限制了进一步应用。
笔者所在课题组在前期研究中筛选到 １株产耐
有机溶剂蛋白酶菌株 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ＷＱ９ ２［１５］，该
菌所产耐有机溶剂蛋白酶对广泛 Ｌｏｇ Ｐ 值的亲水性
以及疏水性有机溶剂具有很好的耐受性，该酶在有
机相中能有效催化内吗啡肽 １［１６］、内吗啡肽 ２［１７］
以及水凝胶［１８］等产物的合成。 尽管野生型菌株所
产蛋白酶产量已达到 ３ ５００ Ｕ ／ ｍＬ，但仍然难以满足
后续开发应用的需求，因此，笔者进一步研究耐有
机溶剂蛋白酶 ＷＱ的克隆及表达，以期通过优化提
高耐有机溶剂蛋白酶的产量，使其更有利于实际应
用与开发。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 菌株与质粒
耐有机溶剂蛋白酶产生菌为 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ
ＷＱ９ ２，由笔者所在课题组分离筛选并寄存于中国
典型 菌 种 保 藏 中 心 （保 藏 登 记 号 为 ＣＣＴＣＣ
Ｎｏ􀆰 Ｍ２０１００１０）。 克隆宿主 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ ｃｏｌｉ ＤＨ５α 保
存于笔者所在实验室，穿梭载体 ｐＭＡ５ 以及枯草芽
胞杆菌宿主 ＷＢ６００ 由江南大学周哲敏教授
惠赠［１９］。
１􀆰 ２　 实验材料
１􀆰 ２􀆰 １　 培养基
ＬＢ 培养基［２０］ （ ｇ ／ Ｌ）：蛋白胨 １０、酵母粉 ５、
ＮａＣｌ １０。
ＬＢ牛奶平板培养基：ＬＢ 培养基中添加质量分
数 １％的脱脂奶粉以及 １􀆰 ５％的琼脂粉，脱脂奶粉混
悬液分开灭菌后，按照比例混合。
Ｓｕｐｅｒｒｉｃｈ 改善培养基［２１］（ ｇ ／ Ｌ）：酵母粉 ２０、胰
蛋白胨 ２５、ＫＨ２ ＰＯ４ ３、 ＭｎＳＯ４ ０􀆰 １、酪蛋白水解物
１０、葡萄糖 ３０。
培养基均在 １２１ ℃灭菌 ２０ ｍｉｎ，１％脱脂奶粉溶
液在 １１５ ℃下灭菌 ２０ ｍｉｎ。
１􀆰 ２􀆰 ２　 试剂以及工具酶
有机溶剂购买于国药集团药业股份有限公司；
ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ、ｐｆｕ ＤＮＡ聚合酶、限制性内切酶Ｓａｌ Ⅰ、
ＢａｍＨ Ⅰ、Ｔ４ ＤＮＡ连接酶、质粒提取试剂盒、胶回收
试剂盒购于宝生物工程有限公司（ＴａＫａＲａ）；ＰＣＲ引
物由上海英骏生物技术有限公司合成；其余试剂和
药品均为进口或国产分析纯。
１􀆰 ３　 蛋白酶基因的克隆和表达载体 ｐＭＡ５ ／
ａｐｒＷＱ的构建
　 　 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ＷＱ９ ２ 所产蛋白酶分离纯化
后，经 ＳＤＳ ＰＡＧＥ 分析，切下所示蛋白条带送至
国家医学分析中心进行氨基酸测序，并进行液相
色谱 双质谱（ＬＣ ＭＳ ＭＳ）分析，通过序列比对，
参考相似度最高的蛋白酶的氨基酸序列设计扩增
引物，并经过测序确定了该蛋白酶的基因 ａｐｒＷＱ
的序列［２２］ 。
笔者采用载体 ｐＭＡ５ 自带信号肽序列，因此去
除蛋白酶基因自带信号肽，表达引物分别引入 ＳａｌＩ
和 ＢａｍＨＩ酶切位点（下划线部分）：Ｆ：５′ ＧＧＧＧＴ⁃
ＣＧＡＣＴＣＴＡＡＡＡＡＴＧＴＴＣＴＣＴＣＴ ３′；Ｒ：５′ ＧＧＧ⁃
ＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＴＴＴＡＴＡＣＣＡＡＣＡ ３′。 克隆产物
ａｐｒＷＱ基因经两酶切割后插入相同酶切的载体
ｐＭＡ５ 中，经 Ｔ４ 连接酶连接后得到表达载体
ｐＭＡ５ ／ ａｐｒＷＱ。 最后，重组质粒 ｐＭＡ５ ／ ａｐｒＷＱ经双
酶切验证阳性克隆。
１􀆰 ４　 重组菌ＷＢ６００ ｐＭＡ５ ／ ａｐｒＷＱ的构建
将重组质粒 ｐＭＡ５ ／ ａｐｒＷＱ 导入枯草芽胞杆菌
ＷＢ６００感受态中，涂布于含 ５０ μｇ ／ ｍＬ 的卡那霉素
ＬＢ牛奶平板培养基，挑取周边有显著透明圈的转化
子，提取质粒 ｐＭＡ５ ／ ａｐｒＷＱ 送至公司进行测序
验证。
１２　 第 ３期 承龙飞等：蜡样芽胞杆菌蛋白酶的克隆及在枯草芽胞杆菌系统中的高效表达
１􀆰 ５　 蛋白酶ＷＱ在重组菌中的表达以及表达条件
的优化
　 　 将重组菌与含空质粒 ｐＭＡ５ 的 ＷＢ６００ 菌株接
入含 ５０ μｇ ／ ｍＬ 的卡那霉素的 ＬＢ 培养基中，在 ３７
℃、１８０ ｒ ／ ｍｉｎ 条件下过夜培养。 以 ２％的接种量接
入 ５０ ｍＬ含 ５０ μｇ ／ ｍＬ的卡那霉素的 Ｓｕｐｅｒｒｉｃｈ改善
培养基中，于 ３７ ℃、１８０ ｒ ／ ｍｉｎ 条件下培养，每 ２４ ｈ
取样 １ 次测蛋白酶酶活以及菌体生物量（ＯＤ６６０）。
为了进一步提高重组菌的产酶能力，考察培养基的
不同初始 ｐＨ、培养温度以及培养基成分对表达酶活
的影响。
１）蛋白酶活力测定 　 参照文献［２３］方法。 酶
活定义：在 ４０ ℃、ｐＨ８􀆰 ０条件下，每分钟催化酪蛋白
底物水解产生 １ μｇ 酪氨酸所需要的酶量为 １ 个酶
活单位，即 １ Ｕ。
２）相对酶活　 在发酵优化过程中，以相同因素
下每次发酵最高的酶活力为 １００％，其他发酵情况
下酶活与最高酶活的比例。
１􀆰 ６　 蛋白酶有机溶剂耐受性的检测
将酶液加入到等体积的有机溶剂中，亲水性有
机溶剂选取二甲基亚砜 （ＤＭＳＯ）、二甲基甲酰胺
（ＤＭＦ）和乙醇等，疏水性有机溶剂选取环己烷、甲
苯等，对照组为无菌水，在 ３７ ℃、１８０ ｒ ／ ｍｉｎ 条件下
振荡 ２４ ｈ后，检测蛋白酶的残余活力。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 目的蛋白酶基因的克隆
蛋白酶 ＷＱ９ ２ 经水解后的多肽片段经 ＬＣ ／
ＭＳ ／ ＭＳ分析获得部分氨基酸序列，通过序列比对，
发现蛋白酶 ＷＱ９ ２ 与 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ 分泌的中性
蛋白酶（ｇｉ ｜ ７６３６４０３０）的氨基酸序列具有最高的相
似性，叠合片段为 ＳＬＮＴＴＬＳＧＳＳＹＹＬＱＤＮＴＲＧＡＴＩＦ⁃
ＴＹＤＡＫ，ＮＳＩＮＧＡＧＡＰＬＫ，ＰＤＷＥＩＧＥＤＩＹＴＰＧＫ。
根据该中性蛋白酶基因序列进行扩增引物的
设计，以本研究自行筛选的蜡样芽胞杆菌 ＷＱ９ ２
的基因组为模板，对蛋白酶基因 ａｐｒＷＱ 进行扩增，
经测序表明扩增产物编码基因开放阅读框（ＯＲＦ）
为 １ ７０１ ｂｐ，包含信号肽、前肽序列及成熟肽 ３ 部
分，编码 ５６６个氨基酸，其中含有信号肽（２８ 个氨基
酸）、前肽（２２０个氨基酸）及成熟肽序列（含 ９５４ ｂｐ
编码 ３１８ 个氨基酸），相对分子质量约为 ３􀆰 ７×１０４，
将该序列提交 ＧｅｎＢａｎｋ 进行 ＢＬＡＳＴ分析，发现其与
蜡样芽胞杆菌 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ１４５７９ 的芽胞菌
粘素基因同源性为 ９２％。
２􀆰 ２　 表达载体及重组菌 ＷＢ６００ ｐＭＡ５ ／ ａｐｒＷＱ
的构建结果
　 　 去除蛋白酶 ＷＱ 自带信号肽，设计分别带有
Ｓａｌ Ｉ和 ＢａｍＨ Ｉ 酶切位点的引物，扩增产物经双酶
切后插入到载体 ｐＭＡ５ 中得到 ｐＭＡ５ ／ ａｐｒＷＱ 重组
质粒，其构建图见图 １。 重组质粒导入枯草芽胞杆
菌 ＷＢ６００中得到重组菌 ＷＢ６００ ｐＭＡ５ ／ ａｐｒＷＱ，重
组子培养 ２４ ｈ后菌落周围有明显的透明圈，表明重
组子有较高的蛋白酶活力。
图 １　 重组质粒 ｐＭＡ５ ／ ａｐｒＷＱ的物理图谱
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｐｈｙｓｉｃａｌ ｍａｐ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ
ｐＭＡ５ ／ ａｐｒＷＱ
图 ２　 重组菌的生长与产酶曲线
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎ
２􀆰 ３　 蛋白酶ＷＱ基因表达以及表达条件优化
重组菌ＷＢ６００ ｐＭＡ５ ／ ａｐｒＷＱ发酵上清液蛋白
酶活力以及菌体生长曲线见图 ２。 由图 ２可知：对照
组重组菌 ＷＢ６００ ｐＭＡ５ 发酵后未检测到蛋白酶酶
活，重组菌ＷＢ６００ ｐＭＡ５ ／ ａｐｒＷＱ在发酵７２ ｈ时酶活
达到 ３ ７７２ Ｕ ／ ｍＬ，已经超过了野生型蜡样芽胞杆菌
ＷＱ９ ２的产酶水平（３ ５００ Ｕ ／ ｍＬ） ［１５］。 这表明该菌
在大量表达蛋白酶后菌体量迅速下降，推测有溶融现
２２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
象，重组菌的菌体生物量较低，表明有较大的优化提
升空间。
２􀆰 ３􀆰 １　 发酵碳源对重组菌产酶的影响
在 Ｓｕｐｅｒｒｉｃｈ改善培养基中，葡萄糖质量浓度为
３０ ｇ ／ Ｌ，占碳源比例较大，且葡萄糖代谢较易产酸。
因此，考察不同碳源（蔗糖、甘油、糊精、玉米粉）替
代葡萄糖对发酵产酶的影响，结果见图 ３。 由图 ３
可知：使用玉米粉作为碳源时显著促进菌体生长与
产酶，菌体生长旺盛，菌体生物量最高，此时菌体生
物量约为以葡萄糖（对照）为碳源条件下的 ２􀆰 １ 倍，
且酶活为对照的 ３􀆰 ５ 倍。 因此，选择玉米粉作为碳
源进行后续优化。
图 ３　 碳源对重组菌产酶的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｎ ｐｒｏｔｅａｓｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎ
图 ４　 氮源对重组菌产酶的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｎ ｐｒｏｔｅａｓｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎ
２􀆰 ３􀆰 ２　 发酵氮源对重组菌发酵产酶的影响
氮源是发酵产酶的关键因素，在 Ｓｕｐｅｒｒｉｃｈ 改善
培养基中，氮源加入量为 １０ ｇ ／ Ｌ，其中氮源酪蛋白水
解物成本较高，考察不同氮源（棉酚蛋白、豆粕粉、
豆饼粉和尿素）替代酪蛋白水解物对发酵产酶的影
响，结果见图 ４。 由图 ４可知：添加酪蛋白水解物时
重组菌的产酶量最高，豆粕粉、豆饼粉和棉酚蛋白
均有促进菌体生长的作用，但发酵液中酶产量较
低。 尿素作为无机氮源替代氮源时，菌体生长较
差，但是产酶效果与酪蛋白水解物相近，考虑到生
产成本原因，选用无机氮源尿素替代酪蛋白水解物
进行发酵产酶。
进一步优化酵母粉和尿素 ２种氮源质量比对发
酵产酶的影响，结果见图 ５。 由图 ５ 可知：在两者比
例为 ２ ∶ １和 ３ ∶ １时，重组菌产酶量均较高，达到
１７ ０００ Ｕ ／ ｍＬ左右。 考虑到成本问题，选择酵母和
尿素两者为 ２ ∶ １的氮源比例。
图 ５　 氮源比例对重组菌产酶的影响
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｎ
ｐｒｏｔｅａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎ
２􀆰 ３􀆰 ３　 发酵温度及培养基初始 ｐＨ 对重组菌发酵
产酶的影响
图 ６ 为发酵温度对重组菌发酵产酶的影响结
果。 由图 ６可知：重组菌在 ３０ ℃下利于菌体生长，
但酶活较低；而在发酵温度 ３７ ℃下，重组菌发酵后
产酶效果较好。 因此，选用 ３７ ℃作为培养条件进行
后续优化。
图 ６　 温度对重组菌产酶的影响
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ ｏｎ ｐｒｏｔｅａｓｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎ
图 ７是培养基初始 ｐＨ 对重组菌发酵产酶的影
响结果。 由图 ７可知：该重组菌在 ｐＨ ８􀆰 ０时有利于
菌体生长，而在初始 ｐＨ ７􀆰 ０、 ７􀆰 ５、８􀆰 ０ 及 ８􀆰 ５ 条件
３２　 第 ３期 承龙飞等：蜡样芽胞杆菌蛋白酶的克隆及在枯草芽胞杆菌系统中的高效表达
下对重组菌的发酵产酶均较适宜，该培养基初始 ｐＨ
为 ７􀆰 ４，因此可以采用不调节 ｐＨ 直接进行发酵
培养。
图 ７　 初始 ｐＨ对重组菌产酶的影响
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｅｄｉｕｍ ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ｏｎ ｐｒｏｔｅａｓｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎ
２􀆰 ４　 优化后重组菌的发酵产酶曲线
优化后重组菌 ＷＢ６００ ｐＭＡ５ ／ ａｐｒＷＱ 的产酶
曲线见图 ８。 由图 ８ 可知：重组菌发酵 ２４ ｈ 内开始
产酶，到 ７２ ｈ时菌体快速生长且达到最高产酶量 １７
４００ Ｕ ／ ｍＬ，约为 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ＷＱ９ ２ 菌产酶量的
５倍。 与优化前比较，产酶量显著增加，为实现该酶
的扩大化应用生产奠定了基础。
图 ８　 重组菌在优化培养基中生长曲线
Ｆｉｇ􀆰 ８　 Ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｉｎ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｍｅｄｉｕｍ
２􀆰 ５　 重组菌表达产物有机溶剂耐受性及 ＳＤＳ
ＰＡＧＥ分析
２􀆰 ５􀆰 １　 表达蛋白酶的有机溶剂耐受性
重组蛋白酶在有机溶剂中（体积分数 ５０％）的
耐受性见表 １。 由表 １ 可知：该重组蛋白酶在有机
溶剂中显示了很好的耐受性，亲水性有机溶剂
ＤＭＳＯ、甘油以及疏水性有机溶剂正辛烷、环己烷、
己烷、甲苯对该酶有促进作用，在上述有机溶剂中
放置 ２４ ｈ后显示了一定程度的激活现象，而亲水性
有机溶剂 ＤＭＦ和乙醇对该酶有一定的影响，重组菌
表达的蛋白酶与野生菌产生的蛋白酶的溶剂耐受
性基本一致，其微量差异可能是溶剂体系中蛋白酶
的含量差异所致。
表 １　 表达蛋白酶ＷＱ的有机溶剂耐受性
Ｔａｂｌｅ １　 Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｐｒｏｔｅａｓｅ ＷＱ
有机溶剂 Ｌｏｇ Ｐ 重组蛋白酶相对酶活 ／ ％
野生蛋白酶
相对酶活 ／ ％ ［１５］
对照 — １００ １００
正辛烷 ４􀆰 ５ １０７ １０５
己烷 ３􀆰 ５ １０４ １０４
环己烷 ３􀆰 ２ １０５ １０４
甲苯 ２􀆰 ５ １０１ １０１
乙醇 －０􀆰 ２４ ６９ ６０
ＤＭＦ －１ ６１ ３５
ＤＭＳＯ －１􀆰 ３５ １３３ １０３
甘油 －１􀆰 ７６ １３３ １６８
２􀆰 ５􀆰 ２　 ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析
Ｍ—标准蛋白； １—重组菌 ＷＢ６００ ｐＭＡ５ ／ ａｐｒＷＱ发酵上清液；
２—ＷＢ６００ ｐＭＡ５发酵上清液
图 ９　 发酵上清的 ＳＤＳ ＰＡＧＥ电泳图谱
Ｆｉｇ􀆰 ９　 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎ
取重组菌 ＷＢ６００ ｐＭＡ５ ／ ａｐｒＷＱ 以及含空质
粒的 ＷＢ６００ ｐＭＡ５ （对照）的发酵上清液进行
ＳＤＳ ＰＡＧＥ蛋白电泳，结果见图 ９。 由图 ９ 可知：重
组菌 ＷＢ６００ ｐＭＡ５ ／ ａｐｒＷＱ 发酵上清酶液在３􀆰 ７×
１０４处有 １条明显的条带，发酵酶液的条带位置与前
期研究中 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ＷＱ９ ２所分泌蛋白酶的相
对分子质量一致，说明重组酶与野生酶成熟肽的大
小一致，并且重组菌在表达过程中自行剪切前肽成
为成熟的蛋白酶ＷＱ，而对照组在 ３􀆰 ７×１０４处没有相
４２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
应条带。 以上分析进一步验证了重组菌高效表达
的蛋白酶，即为目标蛋白酶 ＷＱ。
３　 结论
克隆了 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ＷＱ９ ２的耐有机溶剂蛋
白酶基因 ａｐｒＷＱ，构建了表达载体 ｐＭＡ５ ／ ａｐｒＷＱ 并
在枯草芽胞杆菌 ＷＢ６００中实现了分泌表达，通过对
重组菌 ＷＢ６００ ｐＭＡ５ ／ ａｐｒＷＱ 表达条件的优化调
整了 Ｓｕｐｅｒｒｉｃｈ培养基中碳氮源及培养条件，在 ３７
℃下重组菌发酵产酶量最高可达 １７ ４００ Ｕ ／ ｍＬ，约
为野生菌产酶的 ５ 倍，表明达到了高效分泌表达。
有机溶剂耐受性实验表明蛋白酶ＷＱ在亲水性以及
疏水性有机溶剂中均有良好的耐受性，与本实验室
前期研究的野生型蛋白酶ＷＱ耐受性基本一致。 该
耐有机溶剂蛋白酶的高效表达为进一步发挥其高
效生物催化作用等实际应用奠定了基础。
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（责任编辑　 荀志金）
５２　 第 ３期 承龙飞等：蜡样芽胞杆菌蛋白酶的克隆及在枯草芽胞杆菌系统中的高效表达