全 文 ：第23卷 第9期
2011年9月
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
Vol. 23, No. 9
Sep., 2011
文章编号：1004-0374(2011)09-0900-12
合成生物学与天然产物开发
卢志国1,2，汪建峰1,2，蒙海林1，熊智强1，王　勇1*
(1中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所合成生物学重点实验室，
上海 200032；2华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237)
摘　要：天然产物依然是临床用药的重要来源。合成生物学的诞生为天然产物的开发提供了全新的机遇，
传统的微生物药物、植物天然产物等研究领域都因合成生物学而获得新生。重点介绍了合成生物学在天然
产物开发中的应用，包括新化合物及其生物合成元件的筛选，基于理性设计的天然产物异源生物合成，人
工底盘细胞的系统优化等。
关键词：合成生物学；天然产物；异源生物合成
中图分类号：O621.33; O636 文献标志码：A
Synthetic biology and natural products development
LU Zhi-Guo1,2, WANG Jian-Feng1,2, MENG Hai-Lin1, XIONG Zhi-Qiang1, WANG Yong1*
(1 Key Laboratory of Synthetic Biology, Institute of Plant Physiology & Ecology, Shanghai Institutes for Biological
Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032, China; 2 State Key Laboratory of Bioreactor Engineering,
East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China)
Abstract: Natural products (NPs) traditionally have played an important role in drug discovery and were the basis
of most early medicines. The emergence of synthetic biology provides a new opportunity for the traditional natural
products development. Natural products development and manufacturing based on the concept of synthetic biology
will attract more and more attentions. This article reviews the application of synthetic biology in natural products
development and manufacturing, including novel compounds discovery, biosynthetic elements screening, rational-
design-based natural products biosynthesis, natural products biosynthesis and optimization in the heterologous
artificial chassis cells.
Key words: synthetic biology; natural product; heterologous biosynthesis
收稿日期：2011-05-11
基金项目：国家自然科学基金项目(31070030)；上海
市浦江人才计划(09PJ1403600)；上海市科委2010年度
“科技创新行动计划”生物医药与临床医学领域重大
科技项目(10dz1910103)；中科院知识创新工程生命科
学研究前沿专项(KSCX2-EW-J-12)
*通信作者：E-mail: yongwang@sibs.ac.cn
历史上天然产物曾经是人类药物的惟一来源。
即使在现代科学发达的今天，天然产物依然是临床
用药的主要来源。据统计，目前全世界被批准广泛
使用的抗肿瘤药物中，约半数以上直接来自于天然
产物；而在过去 20年上市的新药中，约 70%直接
或间接来自于天然产物。因此，从天然产物中获取
具有独特活性与结构的化合物在药物研究过程中具
有不可替代的作用。多数天然产物具有复杂的结构，
它们一般来源于生物体的次生代谢过程。在生物合
成的过程中，由初级代谢提供基本构造单元，经复
杂的次生代谢过程形成各种不同的天然产物 (图 1)。
如萜类化合物的前体 IPP/DMAPP(异戊烯基焦磷
酸 /二甲丙烯焦磷酸 )，聚酮类化合物的前体乙酰
CoA、丙酰 CoA等都来自于初级代谢，这些通用的前
体合成了后续结构和活性多样的复杂次级代谢产物。
合成生物学的诞生深刻地影响了天然产物的开
卢志国，等：合成生物学与天然产物开发第9期 901
发研究，赋予了这一传统的领域以新的活力。这其
中最引人注目的成就就是，2006年美国加州大学伯
克利分校的 Keasling实验室将来源于不同生物的基
因进行设计、组装，最后在酵母工程菌中建立了一
条非天然的代谢途径用于大量合成抗疟疾药青蒿素
前体——青蒿酸 [1]。紧接着，2010年，麻省理工
学院和塔夫茨大学的合作者通过在大肠杆菌中重建
紫杉二烯的合成途径，成功地获得了这一紫杉醇的
中间体 [2]。这些研究不仅印证了通过合成生物学的
设计，实现珍稀天然产物的异源生物合成的可行性，
其研究结果也显示这一技术的巨大优势和应用潜
力。
合成生物学的核心思想是对生命的理性设计，
它强调经由设计的生物元件的集成与装配，获得性
能改善的人造生命系统 [3-4]。对于天然产物生物合
成而言，通过合成生物学不仅可以获得结构更新颖
的“非天然的天然产物”，更重要的，天然产物的
合成打破了种属的界限，其生物合成可以在通用的
底盘细胞中完成。而对于这些复杂产物的生物合成
的调控，也完全可以置于人工设计的调控元件或回
路之中来完成。天然产物的研究、开发、生产、制
造都因此而发生了深刻的变化。本文将介绍该领域
所取得的最新研究进展。
1　基于合成生物学的新化合物筛选
利用合成生物学的设计，生物工程师们将潜在
的药物靶标集成到具有特定功能的基因回路中，开
发了一系列能够响应小分子化合物的人工基因回
路。这些基因回路借助于小分子化合物与受体蛋白
的特异性结合，从而目的性地开启或关闭报告基因
的表达 [5-6]，实现药物的高通量筛选。目前，研究
人员已经成功建立了与链阳性菌素 (Streptogramin)、
四环素 (Tetracycline)和大环内酯类抗生素 (Macrolide)
相关的基因回路，用于调控哺乳动物细胞内的基因
表达 [5,7-9]。这些基因回路都包括一个编码转录激活
域和抗生素结合蛋白域的融合基因。该融合蛋白在
宿主中组成型表达，特定抗生素与结合蛋白的作用
特异性地诱导或者阻遏报告基因的表达，从而表征
该基因回路的响应特性。当这些回路中的抗生素蛋
白基因被药物作用靶点基因取代后，该基因回路被
快速地改造成活性化合物筛选的平台，可以高通量
筛选和检测具有抗结核、抗癌及抗微生物感染的化
合物 (图 2)。
一个典型的例子是抗结核药物的筛选。如抗结
图1 复杂天然产物的生物合成
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核药物乙硫异烟胺 (Ethionamide)需要 EthA加单氧
酶催化的 Baeyer-Villiger氧化反应才能转化为相应
的活性组分，但在耐药型的结核分枝杆菌中，该酶
的表达通常因 EthR与其特异性的结合位点 OethR
的结合而处于被阻遏的状态，因而表现出对该类药
物的耐药性。因此，能促使 EthR与 OethR解离的
化合物应该能逆转结核杆菌的抗药性，增加乙硫异
烟胺的抗结核效果。基于这样的原理，Weber等 [10]
设计了一个双质粒人工基因回路用于筛选具有抗耐
药结核分枝杆菌作用的化合物。首先，他们将 EthR
和 VP16转录激活域以融合基因的形式克隆到组成
型表达的质粒上。然后，将报告基因 SEAP(人胎盘
分泌型碱性磷酸酶 )置于由 EthR-专一性操纵子与
果蝇热激蛋白 70基因的启动子 5端序列组成的嵌
合启动子的控制下，获得了第二个质粒。当含有该
回路的动物细胞暴露在不同的化合物中时，目标活
性化合物与 EthR结合阻断了 EthR-VP16激活因子
与嵌合启动子的结合从而抑制 SEAP的表达。
Gonzalez-Nicolini 等 [11] 开发了 CHO-p27Kip1
基因回路来模拟癌症的发生并将该模型应用到了抗
癌药物的高通量筛选过程中。p27Kip1是 cyclin(细
胞周期调节蛋白 )依赖激酶的抑制子，能够诱导哺
乳动物细胞周期的停滞。将 p27Kip1的基因置于
tTA调节蛋白和其靶标启动子组成的 TETOFF回路
的控制下，该回路就能响应四环素从而模拟细胞的
生理状态。当存在四环素时，细胞处于野生型状态，
而当移除四环素后，p27Kip1开始表达，导致细胞
G1生长期停滞。由于 p27Kip1系统遗传不稳定性引
起自发的丢失，导致部分的停滞细胞在不存在四环
素的情况下仍再次进入细胞周期，从而精确模拟癌
症的发生。用上市的抗癌药物，如 5-氟尿嘧啶、亚
德里亚霉素等做进一步的测试实验证明，该 CHO-
p27Kip1基因回路是一个非常有效的抗癌药物筛选
模型。
基于动物细胞人工基因回路筛选策略不仅可以
实现对抗生素活性的筛选，同时还完成了对化合物
细胞毒性、专一性等特性的考察。除此之外，利用
特定的底盘细胞作为筛选平台，将不同来源的基因
或者基因簇置于合适的表达元件下并导入宿主中进
行表达进而检测新化合物的方法，能够更加广泛的
筛选一大类相似途径来源的化合物。Banik等 [12]将
来自于土壤宏基因组文库中的含硫修饰酶基因的
cosmid导入到产糖肽抗生素 A47934的 S.toyocaensis
中，成功地筛选到了 4个新的硫修饰基因并分离到
了相关的化合物。Withers等 [13]利用高产萜类化合
物的大肠杆菌工程菌作为筛选平台，将枯草芽孢杆
菌基因组文库中的 19 000个克隆导入到该宿主中进
行异源表达。当克隆的萜类合成酶活性表达后，能
够利用过量的毒性前体 IPP和 DMAPP合成相应的
萜类化合物，从而解除前体对细胞生长的抑制作用，
实现萜类合成酶基因快速鉴定，获得新的化合物。
在天然产物合成过程中，许多修饰酶在对核心骨架
进行修饰时往往具有宽泛的底物选择性和多样的反
应类型 (如甲基化、单加氧、卤化等 )。因此，将
st：人工转录调节蛋白基因，其中A编码抗生素结合蛋白域，B表示转录阻遏蛋白域；so：人工操纵单元；rg：报告基因。图
中所示的人工基因回路是一种负调控模型。目标化合物与转录调节蛋白的结合致使其从人工操纵单元上解离，成功关闭报告
基因的表达。报告基因表达的强度与化合物的活性成反比。
图2 基于人工基因回路的抗生素筛选模型
卢志国，等：合成生物学与天然产物开发第9期 903
修饰酶基因文库随机导入到能合成不同化合物的宿
主菌种中，通过对原有骨架进行随机地修饰，可以
得到一系列新的化合物。这些结果表明类似 E.coli
或 S.toyocaensis这样的能够高产某一大类化合物的
人工或天然宿主均可以作为一个高效的筛选平台来
快速地筛选自然界潜在的合成元件及相应的化合物。
2　基于合成生物学的天然产物结构改造
由于次级代谢产物通常利用模块化组装的方式
进行合成，我们可以参照 Bromley等 [14]提出的合
成生物学空间 (synthetic biology space)，按催化反应
的种类，底物、产物的特异性，组装的方式 (iterative
或者 modular)等，对获得的各种天然或经人工改造
的抗生素合成元件进行归纳总结，构建一个丰富的
功能元件库，以方便我们去理性地设计组合生物合
成途径生产非天然的天然化合物 [15-17]。
2.1　新抗菌肽(AMPs)的合成
抗菌肽是一大类通过破坏细胞膜和干扰细胞正
常功能来发挥抗菌作用的广谱抗生素。氨基酸残基
的数量、组成及排布决定了抗菌肽的活性和细胞毒
性。因此，通过氨基酸残基的置换或者重排来寻找
更有效力的抗菌肽是一种非常简单有效的方法 [18]。
其中 leu/lys模型 (LK 模型 )能够容易地形成螺旋，
具有较大的开发价值 [19]，而色氨酸残基能够增强肽
链与靶标的相互作用。Kang等 [20]将色氨酸掺入到
LK模式肽的疏水与亲水界面中，获得了活性更好
的化合物。他们将一系列具有 L1KmW2组织形式
的模式肽 (其中含有WLLKW或者WLKKW核心
序列 )经过化学合成后进行了结构与活性的分析，
结果发现一些突变体具有非常好的开发为抗菌药物
的潜力。Loose等 [21]基于对天然抗菌肽骨架分析，
设计了一套“语法模型”，能将重复出现的氨基酸
模块作为一种语言由单词表示，同时建立了一套语
法规则来排布这些不同的氨基酸模块产生新的抗菌
肽。根据以上这些合理的设计，研究者又通过化学
方法合成了数百种不同的新抗菌肽，并筛选到了部
分具有改良活性的突变体。
2.2　聚酮类和非核糖体肽类化合物改造
利用组合生物合成改造聚酮类和非核糖体肽
类化合物的研究，早期主要集中于简单的模块或
者功能域之间的替换、敲除或者插入以及前体补加
等 [22]。这些方法能够非常有效地对天然骨架进行修
饰，但是受限于传统的基于限制性内切酶的克隆技
术无法进行快速的遗传操作，Menzella等 [23]对模
块的 DNA序列进行了重新设计，并在两端添加了
合适的酶切位点。他们将 14个分别来自于 8个 PKS
基因簇的模块重新进行组合，最终产生了 154种双
模块组合，其中半数的组合能够在大肠杆菌中指导
三单位的聚酮合成。通过设计这种带有类似通用接
头 (标准化的酶切位点 )的“生物砖” (Biobrick)[24]，
研究人员可以随意且高效地进行不同模块之间的
组装，充分挖掘组合生物合成的潜力 [25]。另外，
Caboche等 [26-27]开发了一个命名为 Norine的 NRPSs
数据库，该数据库中包含某些单体与 NRPSs活性
之间的关系。这对于指导 NRPs中氨基酸单体替换，
构建活性更好的 NRPs具有非常大的指导作用。随
后他们通过替换其他的酰基载体蛋白 (ACP，特异
性地选择 NRPs中的单体 )获得了一系列活性更好
的 NRPs结构类似物 [28]。
除了以上常见的对骨架单体的改造外，包括糖
基化、卤化以及甲基化等后修饰反应，在天然产物
的合成过程中扮演着重要的角色 [29-30]。由于后修饰
酶单独作用在骨架分子上，没有涉及到合成链上负
责中间化合物的呈递过程，因此利用后修饰酶进行
组合生物合成更容易实现，而对后修饰酶的催化特
性研究也更加容易。糖基的数量和种类对于天然产
物的溶解性、活性等具有非常重要的作用，因此糖
基化作用是天然产物合成过程中非常关键的步骤。
Erb等 [31]介绍了一个包括 70种细菌糖基转移酶的
基因库，并总结了这些糖基化酶的功能、底物专一
性等，对利用糖基转移酶进行组合生物合成具有很
好的指导作用。William等 [32]对糖基转移酶 OleD
中的关键氨基酸位点进行了饱和突变，成功改进了
该酶的催化效率和糖基底物特异性。这些天然的或
者经蛋白质工程改造的糖基转移酶可方便地与抗生
素母核合成途径整合在一起，在微生物中直接合成
新的糖基化产物。近年来，广泛存在于海洋来源天
然产物中的卤化反应也是研究的热点。目前已报道
的工作主要集中在香豆素基团的吡咯环 2-羧酸结
构的修饰上，例如 clorobocin[33-34]和 coumermycin A[35]。
3　基于合成生物学的天然产物异源合成
传统的天然产物开发，通过微生物或植物，经
大规模发酵培养或生化提取来获取相应的产物。但
是，这一方式限制了许多天然产物的开发和应用，
如许多天然产物的原产宿主为生长缓慢、难以大规
模培养或难以进行遗传改造的微生物、植物、共生
菌或其他极端环境微生物。以抗癌药物紫杉醇为
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例，其原宿主太平洋红豆杉的成熟期约需要 100年，
而 3棵成熟的红豆杉仅能提取 1 g紫杉醇，一个癌
症患者一个疗程的用药量就需要 2 g；类似的例子
如抗癌药物埃博霉素，它来源于生长缓慢的纤维堆
囊菌，这一类微生物细胞代时长达 16 h，这一特性
导致很难通过大规模发酵培养经济地获得埃博霉
素。通过合成生物学，可以在遗传背景清晰且遗传
操作简单的异源宿主中重建目标产物的生物合成途
径，新建的代谢途径与宿主原有的代谢网络组成全
新的代谢网络，以此来合成特定的目标产物。与原
产株相比，在异源宿主中获得这类化合物具有诸多
的优势：异源宿主系统，如大肠杆菌 (E. coli)、酿
酒酵母 (S. cerevisiae)、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)
等，营养要求简单，生长速度快，容易进行大规模
培养；遗传背景清楚，可用的文献和数据库资源多，
遗传操作简便可靠；工业规模的控制，其优化与放
大过程也有成熟的模式可供参考等等。因此，通过
异源合成获得这类小分子化合物，无论在产量的提
高和质量的控制上，其优势都是不言而喻的。这一
领域在短短的几年时间里，进展迅速，许多不同类
型 (如聚酮类 PKS、非核糖体多肽类 NRPS、 PKS-
NRPS 杂合体、 萜类、生物碱类、黄酮类等 )、不同
来源 (如来自于黏细菌、极端环境微生物、共生微
生物、难培养微生物、植物、高等真菌，甚至于土
壤宏基因组等 )、不同功能 (如抗肿瘤、免疫调节、
生物杀虫剂、抗病毒、生物材料、生物能源 )的初
级或次级代谢产物，已成功地在异源宿主中进行了
生物合成。通过合成生物学的手段，不仅可以通过
对宿主的重新设计改善原有产物的生物合成，还可
以通过重建代谢网络，使其合成原来不能合成的新
的代谢产物。许多来源于难培养宿主、极端环境、
共生环境或沉默基因、宏基因组的代谢产物，均可
以通过这样的方式进行规模化生产。
3.1　天然产物异源合成的底盘细胞
几种常见的模式微生物，如大肠杆菌、酿酒酵
母、枯草芽孢杆菌等已经被证明是非常有潜力的异
源合成底盘细胞。它们均具备前文总结的作为一个
优良底盘细胞所需的特征。然而，由于生物元件来
源的多样性，在目前的技术条件下，不同来源的基
因和宿主还无法“即插即用”地进行整合。外源基
因在异源宿主中活性表达往往需要进行表达调控元
件替换、密码子优化等操作来消除种属差异。
3.1.1　大肠杆菌
大肠杆菌自身仅能合成少量的天然产物，如能
通过内源的 MEP途径合成萜类家族中的最小成
员——异戊二烯 [36-37]，通过一个由三个蛋白 (Ent-E,
B, F)、六个模块组成的非核糖体多肽类合成酶合成
肠菌素 (enterobactin)[38-40]等。其自身所能提供的内
源性前体数量较少，利用该系统合成复杂天然产物
需要重建某些代谢途径。与真核宿主相比，大肠杆
菌缺乏转录后修饰，缺乏内质网及辅助的 P450还
原酶，使其难以功能性表达植物来源的一些蛋白 (如
细胞色素 P450酶 )，而且大肠杆菌对密码子使用的
偏好性与真核生物比有很大不同。尽管如此，大肠
杆菌仍然是目前最为广泛使用的天然产物异源合成
宿主，这得益于其卓越的表达特性和遗传操作的简
便性，良好的可操作性是其作为底盘细胞最大的优
势。目前，几乎各大类天然产物，如聚酮类 (如红
霉素 )、非核糖体肽类 (如埃博霉素 )、萜类化合物 (如
紫杉二烯 )、苯丙烷类 (如白藜芦醇 )等化合物都在
大肠杆菌有异源合成的成功报道 [2,41-43]。
3.1.2　酵母
酵母属于低等的单细胞真核生物，它既具有原
核生物繁殖快、易培养、便于基因工程操作等特点，
又具有真核生物所具有的蛋白质加工、翻译后修饰
等功能，特别是与大肠杆菌相比更适合用于植物
细胞色素 P450蛋白的功能性表达，因而作为天然
产物的异源合成宿主有其独特的优势。用作异源
合成宿主的酵母主要有酿酒酵母 (Saccharomyces
cerevisia)、毕赤酵母 (Pichia pastoris)等。酿酒酵母
是最早发展起来的真核表达系统，目前已完成全基
因组测序，遗传背景比较清晰，遗传操作也已经系
统化标准化，容易进行异源合成的操作。目前，聚
酮类化合物和萜类化合物在酵母中的异源合成已有
许多成功的例子 [1,44]。
3.1.3　枯草芽孢杆菌
枯草芽孢杆菌 (枯草杆菌 )是一种革兰氏阳性
细菌，与大肠杆菌一样也是一种安全的异源合成宿
主。它对密码子的使用并没有什么特别的偏好性，
这使得它能更好地表达来自于真核生物的基因。枯
草杆菌的基因组也已经完全测序；与大肠杆菌一样，
已有一套成熟可靠的分子生物学工具来进行遗传及
代谢工程改造。枯草杆菌的生长速度较快，从而有
利于缩短研究周期和产物合成周期。目前已发现枯
草杆菌能产多种天然产物，包括非核糖体多肽类、
聚酮类和萜类等化合物，其中属聚酮类的抗生素
有 bacillaene和地非西丁 (difficidin)[45-48]等，而且
最近这些聚酮类抗生素的生物合成基因簇也已经
卢志国，等：合成生物学与天然产物开发第9期 905
得到了鉴定 [49]。枯草杆菌也能产生非核糖体多肽
类如抗霉菌枯草杆菌素 (mycosubtilin)[50]和表面活
性素 (surfactin)[51]。除了聚酮类和非核糖体多肽类外，
枯草杆菌还是某些萜类化合物的天然产生菌 [52-53]。
然而，目前并没有发现关于枯草杆菌产生黄酮类化
合物的相关报道。
枯草杆菌拥有合成某些类别天然产物关键前体
的代谢网络，这是异源合成相应天然产物的基础。
比如 sfp磷酸泛酰巯基乙胺 (phosphopantetheine) 转
移酶 (在大肠杆菌中该酶用于确保聚酮合酶翻译后
修饰的正确性 )就天然存在于枯草杆菌中 [54]。枯草
杆菌作为异源宿主的一大优势是它能将重组蛋白分
泌到胞外 [55]。虽然一些较大的蛋白分子难以分泌到
胞外，但其革兰氏阳性菌细胞壁的特点依然有利于
外源天然产物分子的分泌。
然而，枯草杆菌作为异源宿主也有自身的一些
缺陷。其中最大的瓶颈是缺乏稳定的质粒载体用于
将外源的基因或基因簇导入细胞中 [55]。解决该问题
的一种方法是将这些合成天然产物的相关基因直接
整合到枯草杆菌的染色体上，但由此而得到的基因
拷贝数少于多拷贝质粒带来的基因拷贝数，这可能
将导致产物合成水平的下降。此外，与大肠杆菌比，
枯草杆菌具有显著的蛋白酶背景，这样的环境可能
会造成天然产物合成酶的过快降解 [56]。
尽管如此，枯草杆菌作为异源宿主合成天然产
物的研究还是取得了一些进展。比如Eppelmann等 [57]
构建了一个能产生肽类抗生素杆菌肽 (bacitracin)的
枯草杆菌宿主。为解决外源基因转化的质粒稳定性
以及表达较多的外源基因问题，他们将来自藓样芽
胞杆菌 (Bacillus licheniformis)中合成杆菌肽的整个
基因簇 (49 kb)整合到枯草杆菌的染色体上，取代
了原有的 26 kb的表面活性素合成基因簇。
3.1.4　其他异源宿主
除了以上几种宿主外，链霉菌也是异源合成的
常用宿主之一。链霉菌能产生包括抗细菌、抗真菌
类抗生素以及范围广泛的生物活性化合物，如免疫
抑制剂、抗癌剂等，具有这些类别天然产物的前体
代谢途径，是天然产物异源合成的理想宿主之一。
目前某些链霉菌如天蓝色链霉菌 (S. coelicolor)、红
色糖多孢菌和除虫链霉菌 (S. avermitilis)等已经完
成全基因组测序并建立起了标准的遗传操作规程，
为天然产物的异源合成提供了便利。但链霉菌生长
慢、生活史复杂、遗传操作相对困难等缺陷也是其
作为异源宿主所必须考虑的问题。此外，目前用于
天然产物异源合成的宿主还有其他一些微生物，比
如细菌有假单孢菌 (Pseudomonas)、纤维堆囊菌
(Sorangium cellulosum)、黄色黏球菌 (Myxococcus xanthus)
等；放线菌有红色糖多孢菌 (Saccharopolyspora
erythraea)、变铅青链霉菌 (Streptomyces lividans)、
淡青链霉菌 (Streptomyces glaucescens)、新霉素链霉
菌 (Streptomyces fradiae)等；真菌有黑曲霉 (Aspergillus
niger)、构巢曲霉菌 (Aspergillus nidulans)等，但相
关报道不多见。
以上所提及的底盘细胞，一般都需要经过一些
改造才能符合所需的要求，合成特定的天然产物。
这种改造目前有“从上而下”或“从下而上”两种
策略。其中，简化和重构代谢与调控网络，清除
DNA中的冗余片段，解除未知调控，增加代谢和
调控网络的效率，是这种改造的一个重要目标。尽
管大片段 DNA合成技术已经取得了一些突破性的
进展，目前已经可以实现人工设计与合成特定的
DNA，但复杂微生物底盘细胞的人工合成还需时日。
因此，相比于直接人工设计和全合成遗传背景清楚、
无冗余序列的最小基因组宿主，基因组缩减宿主
也是目前倍受关注的对象。近期日本科学家敲除
了阿维链霉菌染色体端粒附近约 1.4 Mb的负责编
码次级代谢的 DNA区域，并将该宿主用于链霉素、
平板霉素以及青蒿酸前体 amorphadiene的异源合
成。结果证明在该宿主中这些化合物都获得了可
观的产量，比在原产宿主或者阿维链霉菌模式菌
中获得了明显的提高 [58]。美国、欧洲和日本在大
肠杆菌 (Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌 (Bacillus
subtiils)、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、裂
殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)等模式微生
物和有工业应用价值的微生物 (如谷氨酸棒杆菌
(Corynebacterium glutamicum)中开展了大规模的基
因组改造工程 [59-61]。人们采用的 DNA敲除技术，
从早期的转座子随机整合 /缺失、转座子协同 Cre/
loxP切除，到最近发展的 Red介导 /双链断裂促进
的重组、无疤痕缺失等。目前最多的已敲除了约
30%的基因组序列，一些基因组发生大的缺失的工
程菌株显示了不同于野生菌株的优良性状。以大肠
杆菌基因组改造工程为例，利用 Red和 SceI系统
将大肠杆菌MG1665中的 K岛和 24个转座单元进
行了连续敲除，最后得到的突变体MDS12基因组
被敲除了 8.1%。突变体MDS12与野生型在质粒转
化效率上是一样的，在基本培养基上两者的生长速
率也没有明显的差别 [62]。随后在MDS12的基础上
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继续进行基因组的缺失，得到 MDS42和 MDS43
菌株，它们的基因组相对野生型分别减少了 14.3%
和 15.27%，缺失的基因数量分别为 704和 743个 [63]。
与MG1665相比，突变菌株生长速率没有改变，但
是它们的质粒转化效率提高了两个数量级。
3.2　底盘细胞的优化
在天然产物异源合成系统的构建过程中，异源
途径被导入宿主后，会对原有生物系统产生一个巨
大的扰动，底盘细胞在合成目标化合物时会表现出
一些新的表型，如某些毒性中间产物的积累，或前
体供应与目标产物合成途径的失衡等。如何优化底
盘细胞，平衡前体供应与生物合成途径，实现整个
代谢流量的合理分配是底盘细胞优化的关键。系统
生物学研究中所采用的建模、仿真与实验方法同样
适用于合成生物学研究。
传统的通过关键基因敲除或者利用多拷贝质
粒进行强化表达的方法在底盘细胞改造过程中并不
能取得良好的效果。在合成生物学中，更强调底盘
细胞中不同代谢模块的调试与精细调控。因此，不
同表达强度的启动子、经由进化的 RBS文库等调
控元件在这些优化中能起到关键作用。如原始大肠
杆菌宿主中的 2-甲基 -D-赤藓糖醇 -4-磷酸途径
(MEP)受到严格的调控，无法提供足够的异戊酰
焦磷酸 (IPP)和二甲烯丙基焦磷酸 (DMAPP)以支
持萜类化合物的合成。Martin等 [64]将酵母来源的
甲羟戊酸途径引入了大肠杆菌中，并通过对异源
甲羟戊酸途径的精确调节构建了能够形成丰富 IPP
和 DMAPP的前体库的工程菌，为萜类的异源合
成提供了一个高效的通用平台。Tsuruta等 [65]报道，
用含有青蒿酸前体 Amorphadiene 合成酶基因的
重组菌进行为期 6 d的高密度发酵后，青蒿酸前体
Amorphadiene的产量超过了 25 g/L。Martin等 [64]
的研究虽然取得了较好的效果，但从简化的角度考
虑，最佳的宿主应该趋向于更简单的设计，而甲羟
戊酸途径的引入增加了系统的复杂性，而且途径中
的相关代谢产物对菌体会产生一定的毒害作用。为
此，Ajikumar等 [2]采用多层次系统搜寻的方法详细
地研究了 MEP途径提供 IPP和 DMAPP的能力。
结果表明单拷贝强化 dxs-idi-ispDF基因的表达比多
拷贝表达时获得了更好的效果，最终工程菌经补料
分批发酵后能够获得 1 g/L以上的紫杉烯，该结果
也预示着更精细地去调控途径中多个基因的协同表
达可能会更大的释放MEP途径的潜能。近来，Meg
等 [66]建立的启动子强度与基因表达强度的模型，
然后通过预测实际途径中关键基因所需的表达强
度，合理地选择最适强度的启动子并结合启动子敲
入 (Knock-in)技术去调控该基因的表达，从而成功
地实现途径的优化。
随着组学数据的日益丰富和完善，大肠杆菌、
酿酒酵母等多个物种的全基因组代谢网络模型得
以重建。结合经典的代谢网络通量分析方法，如代
谢通量分析 (metabolic flux analysis, MFA)[67-68]、通
量平衡分析 (flux balance analysis, FBA)[69-70]、最小
代谢调整分析 (minimization of metabolic adjustment,
MOMA)[71]等，人们可对宿主细胞的代谢表型进行
模拟和预测，从而发现一些可能影响目标化合物产
量的关键节点；通过对这些节点实施改造可改变细
胞代谢流的分布状况，使得更多的碳源底物流向目
标产物的合成，从而尽可能地提高目标产物的产量。
为此，本实验室在已有的计算系统生物学模型及通
量分析方法基础上，初步构建了可用于天然产物合
成生物学的 in silico分析研究平台。目前该平台主
要可以进行如下研究：(1)分析天然产物在异源宿
主中的最大理论产率 [72-73](即异源合成的极限目标
和方向 )；(2)考察影响目标产物产率的关键因素 [72]；
(3)选择最佳的生物合成途径或前体供应途径 [73]；
(4)对宿主系统实施模拟改造 [72]。在该平台中，我
们分别以 FBA和MOMA为基础，提出了通量分布
比较分析 (flux distribution comparison analysis, FDCA)
和 LMOMA-Based两套方法用于预测影响产物合成
的关键代谢节点或基因位点。通过应用该平台，我
们针对红霉素合成关键中间体 6dEB异源合成产率
低的问题 (也是目前异源合成普遍存在的问题 )，
分析了其在不同异源宿主中的最大理论产率，影响
理论产率的关键因素，以及为提高产率而可能需要
改造的潜在基因位点 [72]。理论产率的分析结果表明，
大肠杆菌是更高效的 6dEB异源合成宿主，而葡萄
糖是更理想的底物。以大肠杆菌为宿主，葡萄糖作
底物，分别使用 FDCA、LMOMA-Based预测了一
些可能提高 6dEB产率的基因改造位点。这些位点
不但包含了 Boghigian等 [74]用MOMA方法所得到
的敲除位点，而且还包括了更多的敲除位点以及可
能需要强化或弱化的位点。这些 in silico模拟结果
将为构建高效的天然产物生物合成底盘宿主提供强
有力的理论指导。
3.3　天然产物的异源生物合成
早期天然产物异源生物合成主要集中在聚酮类
化合物。主要代表性的工作是聚酮类化合物的典型
卢志国，等：合成生物学与天然产物开发第9期 907
代表红霉素的异源合成。大肠杆菌以其良好的表达
特性和遗传特性，越来越成为聚酮异源合成的通用
宿主之一。在过去的十年中，通过合成生物学的设
计，已经解决了通过大肠杆菌异源生物合成红霉素
的三个关键模块：
(1)ACP的后修饰模块：ACP是聚酮合酶的酰
基载体蛋白结构域，修饰化的 ACP通过磷酸泛酰
巯基臂对聚酮链起到固着和传递的作用。ACP的磷
酸泛酰巯基化修饰由磷酸泛酰巯基转移酶
(phosphopantetheinyl transferase)催化完成。尽管大
肠杆菌中也存在 ACP和 ACP磷酸泛酰巯基化酶，
但其不能识别和修饰来自于放线菌的ACP。1996年，
Lambalot等就发现来自于枯草芽孢杆菌的磷酸泛酰
巯基化酶 sfp对底物专一性不强，可对多种来源于
链霉菌基因的 ACP进行修饰。2001年，Pfeifer等
将该 sfp基因整合入大肠杆菌 BL21(DE3)，使大肠
杆菌表达的聚酮合酶蛋白 ACP可被磷酸泛酰巯基
化修饰活化。
(2)红霉素生物合成的前体供应模块：红霉素
母核 6-dEB由 1分子的丙酰 CoA和 6分子的 (2S)-
甲基丙二酰 CoA缩合而成。大肠杆菌本身不能提
供 (2S)-甲基丙二酰 CoA，并且在大肠杆菌染色体
上存在的丙酸分解基因簇 prp对丙酰 CoA的合成不
利。Pfeifer将来自于 S. coelicolor丙酰 CoA羧化酶
基因 pcc(propionyl CoA carboxylase)导入大肠杆菌，
重建了从丙酰 CoA生成 (2S)-甲基丙二酰 CoA的
合成途径，同时，将 sfp基因整合入 prp位点，删
除了染色体上有关丙酸分解代谢的基因 prpRBCD。
这些改造使大肠杆菌可以提供相应的红霉素合成前
体。
(3)红霉内酯环的后修饰模块：为了得到具有
抗菌活性的红霉素最终产物，需对大环内酯的母核
6-dEB进行糖基化、甲基化、羟基化等修饰，这一
过程需要近二十个基因的参与。同时，要产生具有
抗菌活性的红霉素，大肠杆菌宿主本身的耐受性也
是一个关键问题。为此，我们通过在大肠杆菌中重
建 6-dEB后修饰的合成途径，并最终在该系统中首
次获得了具有抗菌活性的红霉素主要组分红霉素
A[42]。
除此之外，通过大肠杆菌高效获得红霉素也做
了诸多的尝试。如为了提高质粒稳定性，Murli等 [75]
2003年将 pccB和 pccA基因整合到 E. coli编码甲基
丙二酰辅酶 A脱羧酶 ygfG位点，同时用 RSF1010
的复制起始位点替换 pET28a来源于 pBR322的起始
位点，将 pBP144改造为 pKOS207-129，获得的工
程菌株 K207-3/pKOS207-129/pBP130在摇瓶中可以
获得 22.5 mg/L的 6-dEB。Lau等 [76]利用该菌株，
在 5L生物反应器中，以分批补料的方法进行高密
度培养，得到了 1.1 g/L的 6-dEB。这是到目前为止，
6-dEB异源生物合成的最高纪录。为了提高宿主本
身的稳定性，我们将红霉素聚酮合酶基因 eryAI、
AII、AIII通过染色体重组 Red/ET方法整合到大肠
杆菌染色体上，获得了染色体修饰的稳定菌株，与
多个质粒共表达相比，该菌株可稳定的合成红霉素
中间体 6-dEB[77]。在早期的研究中发现，在红霉糖
多胞菌中过量表达 S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因对
红霉素的生物合成有促进作用 [78]。通过在大肠杆菌
中过量表达该基因，将大肠杆菌中 6-dEB的产量提
高了一倍 [79]。
除此之外，其他聚酮类化合物的异源合成也取
得了不少进展。2003年 Pfeifer等 [80]在大肠杆菌中成
功获得了 NRPS杂合聚酮耶尔森菌素 (yersiniabactin)。
2005年Wenzel等 [81]在假单胞菌 (Pseudomonas putida)
中通过 Red/ET重组技术获得了 myxochromide S，
其产率是原产菌株 Stigmatella aurantiaca的 4倍，
而生长速率为原产菌株的 3倍。2006年 Jung等 [82]
则在委内瑞拉链霉菌 (Streptomyces venezuelae)异源
合成了泰乐菌素 (Tylosin)。同年，Gross等 [83]报道
了在三种假单胞菌 (P. putida、P. stutzeri和 P. syringae)
分别异源合成了淡黄霉素 (flaviolin)的Ⅲ型 PKS基
因。这是首次在假单胞菌中成功表达天然产物生物
合成的基因。
在异源宿主中合成天然产物由早期的聚酮类化
合物为主扩展至其他类型的天然产物，如萜类 [1]、
黄酮类 [84]、生物碱类 [85]等各大类天然产物都有成
功的报道。这些生物合成途径的来源也由与宿主亲
缘关系较近的微生物慢慢扩展至亲缘关系较远的植
物、土壤宏基因组等。潜藏在陆地或海洋宏基因组
文库中的基因资源是天然产物开发的宝藏。虽然完
整的天然产物合成基因簇一般在 30 kb以上，单个
克隆很难直接获得。利用保守序列设计简并引物或
者探针，结合 PCR扩增或 DNA文库杂交可以比较
容易地获得完整的基因簇。然后将这些基因簇克隆
到合适的底盘细胞中进行表达，能够获得许多结构
新颖的化合物。鉴于这样的思路，Brady研究组的
工作人员首先在酿酒酵母中建立了一种与转化相关
的重组方法 [86]，成功地实现了位于不同 cosmid质
粒中的 DNA大片段的组装，然后运用该方法将位
生命科学 第23卷908
于 AB649和 AB185两个克隆中的 Type II PKS 合成
酶基因组装在一起，并在 S. albus中异源表达，成
功地检测到了 4个新的化合物 [87]。另外，Chung等 [88]
直接对宏基因组文库中的单克隆进行培养，将酵母
细胞作为抗真菌活性的检定菌进行快速筛选，最终
获得了一个具有抗真菌活性的克隆并分析了相关的
基因簇。虽然没有分离到活性的化合物，但他们的
研究表明异源表达是目前从宏基因组文库中筛选、
开发潜在活性化合物及其基因簇解析的有效手段，
也是必经之路。随着大规模基因组工作及比较基因
组分析的深入，人们逐渐认识到了即使是研究最彻
底的模式菌中也还存在着大量与次级代谢相关的沉
默基因簇。从合成生物学角度思考，这些沉默基因
与宏基因组 DNA一样是生物元件库的重要组成部
分，利用异源合成的方法能够有效地激活这些资源
或将其纳入到天然产物合成生物学的设计中获得新
的化合物。
4　展望
随着技术的进步，合成生物学渗透到了天然产
物开发的各个环节中，为天然产物的筛选和制造开
辟了一条新的、高效的途径。20世纪 40年代以来
抗生素研究中积累了大量的材料、方法和经验，这
些积累通过合成生物学获得了全新的诠释。如抗生
素的开发不再仅仅依赖于微生物来源，各类天然产
物都可以在通用的宿主中异源合成，种属的屏障得
以消除；组合生物合成的模块化遗传操作也不再依
赖于相似模块之间的替换或敲除——在合成生物
学的背景下，可以进行任意的组合和人工设计，其
内涵和外延获得前所未有的延伸；天然产物的筛选
也可以通过更精巧的合成生物学设计，获得更灵敏
的模型；大规模工业化的天然产物的生产，在未来
或许可以通过更容易控制的大肠杆菌等模式宿主获
得，其产量、质量和工业化规模有望获得前所未有
的改善。显而易见，合成生物学正在深刻地影响着
天然产物的开发和制造。但合成生物学毕竟是一门
崭新的学科，其理论、技术和方法仍需进一步的发
展和成熟，一些技术瓶颈，如大规模基因组人工精
细合成与拼接、高效率的染色体构建技术、人造系
统的调试等关键技术的突破将会真正迎来天然产物
的合成生物学时代。
[参　考　文　献]
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