全 文 ：第 １４卷第 ４期
２０１６年 ７月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １４ Ｎｏ􀆰 ４
Ｊｕｌ􀆰 ２０１６
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１６􀆰 ０４􀆰 ００８
收稿日期：２０１５－１０－２２
基金项目：国家自然科学基金（２１２０６０７２）；江苏省自然科学基金（ＢＫ２０１２８２５）
作者简介：韦　 敏（１９９０—），女，江苏盐城人，研究方向：食品科学；姚　 忠（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｙａｏｚｈｏｎｇ＠ ｎｊｔｅｃｈ．ｅｄｕ．ｃｎ
载体两性电解质修饰对固定化 γ 谷氨酰转肽酶
ｐＨ耐受性和催化活性的影响
韦　 敏，姚　 忠，叶丽静，王浩绮，倪　 芳，周　 治，仲兆祥，孙　 芸
（南京工业大学 食品与轻工学院，江苏 南京 ２１１８００）
摘　 要：针对 γ 谷氨酰转肽酶（ＧＧＴ）ｐＨ耐受性差的缺陷，首先以硅烷化改性的介孔氧化钛晶须（ ｓＭＴｗ）为载体对
重组枯草芽胞杆菌 ＧＧＴ进行固定化，再以 ｐＨ ８􀆰 ０～ １０􀆰 ５的载体两性电解质 Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ（ＣＡ，ｐＨ ８􀆰 ０～ １０􀆰 ５）对其进
行后修饰，得到固定化酶 ｓＭＴｗ ＧＧＴ ＣＡ。 结果发现：ｓＭＴｗ ＧＧＴ ＣＡ的 ｐＨ耐受性较游离酶明显提高，可在 ｐＨ
６􀆰 ０～１１􀆰 ０范围内保持稳定的催化活性。 同时，ｓＭＴｗ ＧＧＴ ＣＡ 的热稳定性也较游离酶有所提高，其最适作用温
度为 ５０ ℃左右，热失活反应活化能 Ｅｄ为 ４９􀆰 ８８ ｋＪ ／ ｍｏｌ。 ｓＭＴｗ ＧＧＴ ＣＡ对 γ 谷氨酰对硝基苯胺（ＧｐＮＡ）的亲和
力常数 Ｋｍ为 ０􀆰 ５７９ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，与游离酶相近。
关键词：γ 谷氨酰转肽酶；载体两性电解质；修饰；ｐＨ耐受性；催化活性
中图分类号：Ｑ８１４　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１６）０４－００３７－０６
Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｐＨ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ａｎｄ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ
γ⁃ｇｌｕｔａｍｙｌｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｂｙ ｃｏａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃａｒｒｉｅｒ ａｍｐｈｏｌｙｔｅ
ＷＥＩ Ｍｉｎ，ＹＡＯ Ｚｈｏｎｇ，ＹＥ Ｌｉｊｉｎｇ，ＷＡＮＧ Ｈａｏｑｉ，ＮＩ Ｆａｎｇ，ＺＨＯＵ Ｚｈｉ，ＺＨＯＮＧ Ｚｈａｏｘｉａｎｇ，ＳＵＮ Ｙｕｎ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｌｉｇｈｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｐＨ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ γ⁃ｇｌｕｔａｍｙｌｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅ （ ＧＧＴ ）， ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ γ⁃
ｇｌｕｔａｍｙｌｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅ （ ＧＧＴ） ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｗａｓ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｏｎｔｏ ｓｉｌｙｌａｔｅｄ ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ＴｉＯ２
ｗｈｉｓｋｅｒｓ（ ｓＭＴｗ）． Ｔｈｅｎ ｉｔ ｗａｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ｃａｒｒｉｅｒ ａｍｐｈｏｌｙｔｅ（Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ ｐＨ ８􀆰 ０ ｔｏ １０􀆰 ５，ＣＡ）． Ｔｈｅ
ｐＨ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｅｎｚｙｍｅ（ ｓＭＴｗ⁃ＧＧＴ⁃ＣＡ）ｗａｓ ｇｒｅａｔｌｙ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｉｎ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｗｉｔｈ
ｔｈｅ ｆｒｅｅ ＧＧＴ， ｓｔａｂｌｅ ｕｎｄｅｒ ｐＨ ｒａｎｇｉｎｇ ｆｒｏｍ ６􀆰 ０ ｔｏ １１􀆰 ０． Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｓＭＴｗ⁃
ＧＧＴ⁃ＣＡ ｗａｓ ａｌｓｏ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｆｒｅｅ ＧＧＴ， ｗｉｔｈ ｏｐｔｉｍａｌ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｓ ｈｉｇｈ ａｓ ５０ ℃ ． Ｔｈｅ
ｔｈｅｒｍａｌ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｅｎｅｒｇｙ（Ｅｄ） ｏｆ ＭＴｗＡ⁃ＧＧＴ⁃ＣＡ ｗａｓ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｔｏ ｂｅ ４９􀆰 ８８ ｋＪ ／ ｍｏｌ． Ａｌｓｏ，ｔｈｅ Ｋｍ ｏｆ
ＭＴｗＡ⁃ＧＧＴ⁃ＣＡ ｔｏｗａｒｄｓ ＧｐＮＡ ｗａｓ ０􀆰 ５７９ ｍｍｏｌ ／ Ｌ， ｖｅｒｙ ｃｌｏｓｅ ｔｏ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｆｒｅｅ ＧＧＴ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：γ⁃ｇｌｕｔａｍｙｌｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅ；ｃａｒｒｉｅｒ ａｍｐｈｏｌｙｔｅ；ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｐＨ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ；ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ
　 　 酶催化由于具有高度的专一性和选择性以及
反应条件温和等优点，已逐渐成为 ２１世纪化学工业
的重点发展方向，并已在医药［１－３］、生物能源［４－５］和
食品［６］领域得到了成功应用。 但由于工业催化环
境（如溶剂、ｐＨ、温度、离子强度等）与细胞生理环境
差异较大，容易引起酶的变性失活，限制了生物催
化的工业应用［７－８］。
寡聚酶（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ）的全酶是由多个亚
基组装而成，通过一些次级键，如氢键、疏水作用、范
德华力等维系其四级结构，稳定性差，极易发生亚基
解聚，从而引发酶的不可逆失活［９］。 目前，提高寡聚
酶稳定性的方法主要有控制反应 ｐＨ［１０］、在亚基间引
入二硫键［１１－１２］、物理包覆［１３］、化学交联［１４］及酶固定
化［１５－１６］等手段。 其中，酶固定化不仅有助于提高寡
聚酶的稳定性，同时还可实现催化剂的循环使用，便
于产物的回收，利于反应器设计和工艺的连续化，是
一种较为常用的酶稳定化方法。 但常用的固定化方
法（如共价交联和物理吸附），不能保证将寡聚酶的
各个亚基同时结合于载体上，因此，在实际应用中难
以有效控制寡聚酶的亚基解聚和脱落，不仅污染产
品，也大大缩短了固定化酶的使用寿命。
为此，研究者们尝试对固定化酶进行后修饰
（ｐｏｓｔ⁃ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），以进一步提高其稳
定性［１７］，其中以高分子有机聚合物（如聚乙烯亚胺
和聚醛）修饰固定化酶为常用的方法。 该方法虽然
可以提高固定化酶的稳定性和使用寿命，但由于有
机高分子的包覆大大增加了传质阻力，使固定化酶
与底物的亲和力显著下降［１３］。
γ 谷氨酰转肽酶 （ γ ｇｌｕｔａｍｙｌｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅ，
ＧＧＴ）是一种异源二聚体蛋白，在自然界中分布广
泛，是生物体内谷氨酰循环中的关键酶，可特异性
催化 γ 谷氨酰基的转移反应，在生物有机合成领域
应用广泛［１８－２３］。 但由于该反应需在碱性（最适作用
ｐＨ为 ９􀆰 ０ 左右）条件下进行，ＧＧＴ 的稳定性差，极
易发生亚基解聚，导致酶活的不可逆下降［２４］。 本课
题组在前期工作中采用硅烷化的介孔氧化钛晶须
（ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ＴｉＯ２ ｗｈｉｓｋｅｒｓ，ｓＭＴｗ）为载体对 ＧＧＴ 进
行了固定化，有效改善了其热稳定性，但固定化酶
的 ｐＨ耐受性仍然较差［２５］。
为此，在前期研究基础上，笔者尝试以 ｐＨ ８􀆰 ０～
１０􀆰 ５ 的载体两性电解质 Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ （ ＣＡ，等电点
９􀆰 ２）对硅烷化介孔氧化钛负载的 ＧＧＴ （ ｓＭＴｗ
ＧＧＴ）进行后修饰，将 ＣＡ 包覆于固定化酶表面，在
固定化酶表面形成一个等电点为 ９􀆰 ２左右的缓冲液
膜层，减弱反应主体相 ｐＨ 的改变对载体表面微环
境的影响，以期提高固定化酶的 ｐＨ 耐受性和催化
活性。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
枯草芽胞杆菌 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＧＧＴ重组菌 ＢＬ２１
（ＤＥ３） ｐＥＴ２２ｂ Ｂｇｇｔ，笔者实验室成员自行构建；
介孔氧化钛晶须（ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ＴｉＯ２，ＭＴｗ，宽度 １００ ～
３００ ｎｍ、长度 １ ～ １０ μｍ，颗粒微孔直径 ７ ～ ３０ ｎｍ），
南京工业大学陆小华教授课题组提供；Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ
ｐＨ ８ ～ １０􀆰 ５ 和 Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ， ＧＥ
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ公司；ＢＣＡ蛋白定量试剂盒，上海捷瑞生
物工程有限公司； ３ 氨丙基三乙氧基硅烷
（ＡＰＴＥＳ）、甲苯、丙酮、无水乙醇、γ 谷氨酰对硝基
苯胺（ＧｐＮＡ）、Ｎ 甘氨酰甘氨酸（双甘二肽），国药
集团化学试剂有限公司；其余试剂均为市售分析纯。
１􀆰 ２　 主要实验仪器
紫外分光光度计 Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ７０００，ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ
公司； ｐＨ 计， Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ 公司；酶标仪， ＢｉｏＴｅｋ
公司。
１􀆰 ３　 实验方法
１􀆰 ３􀆰 １　 ＢＬ２１（ＤＥ３） ｐＥＴ２２ｂ Ｂｇｇｔ的培养和纯化
发酵培养基为蔗糖 １０ ｇ ／ Ｌ、酵母膏 ２０ ｇ ／ Ｌ、ＮａＣｌ
９ ｇ ／ Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ ３ ｇ ／ Ｌ、ＭｇＳＯ４ １ ｇ ／ Ｌ，ｐＨ ７􀆰 ０。 重组菌
发酵种子液接种于发酵培养基中，于 ３７ ℃下培养 ４
ｈ（至 ＯＤ６００约 ３􀆰 ８）后，加入终质量浓度为 ２􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ
乳糖，于 ２４ ℃下诱导 １２ ｈ，发酵液酶活可达 ３􀆰 ３４
Ｕ ／ ｍＬ。 采用 Ｎｉ亲和吸附的方法对 ＧＧＴ 进行纯化，
洗脱剂为 ５００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 咪唑，得到的样品可达电泳
纯，比酶活为 ４３􀆰 １ Ｕ ／ ｍｇ。
１􀆰 ３􀆰 ２　 ｓＭＴｗ的制备
将 ＭＴｗ置于 １２０ ℃烘箱中真空干燥至恒质量。
取 ２􀆰 ０ ｇ 加入 ２５０ ｍＬ 圆底烧瓶中，再加入 １００ ｍＬ
甲苯和 ２􀆰 ４７ ｍＬ ＡＰＴＥＳ，于 ７０ ℃油浴，回流搅拌反
应 ８ ｈ。 待反应结束后，分别用 ２５０ ｍＬ的甲苯、丙酮
和无水乙醇对粉体洗涤、抽滤。 所得粉体放入 ７０ ℃
烘箱真空干燥至恒质量，即得 ｓＭＴｗ［２５］。
１􀆰 ３􀆰 ３　 固定化酶的制备
称取一定量的 ｓＭＴｗ 置于离心管中，用去离子
水反复浸泡、洗涤多次，滤干后加入纯化后的 ＧＧＴ
酶液，使酶浓度为每克载体 ２２４ Ｕ；离心管于 ４ ℃下
振荡反应 １􀆰 ５ ｈ，反应结束后取出离心管，用 １０倍于
载体量的 ｐＨ ８􀆰 ０、５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ的 Ｔｒｉｓ ＨＣｌ缓冲液洗
涤多次后滤干备用，制得的固定化酶 ｓＭＴｗ ＧＧＴ
（比活为 １８４ Ｕ ／ ｇ）。
１􀆰 ３􀆰 ４　 ｓＭＴｗ ＧＧＴ的修饰
在砂芯反应管中加入一定量的 ｓＭＴｗ ＧＧＴ，按
固液比 １ ∶ ５（ｇ ／ ｍＬ）加入 ｐＨ ８～１０􀆰 ５ 的 ＣＡ溶液，于
４ ℃下振荡反应 ２０ ｈ 后取出反应管，滤去残液，用
８３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
ｐＨ ８􀆰 ０，５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ⁃ＨＣｌ 缓冲液洗涤多次，滤干
后即得 ｓＭＴｗ ＧＧＴ ＣＡ。
１􀆰 ３􀆰 ５　 酶活测定
酶活（Ｕ）定义：以 ＧｐＮＡ为供体，双甘二肽为受
体，在 ｐＨ８􀆰 ０和 ３７ ℃条件下，每分钟催化 ＧｐＮＡ 水
解生成 １ μｍｏｌ对硝基苯胺（ｐＮＡ）所需的酶量［３１］。
１） 游离酶酶活测定方法 　 配制不同浓度的
ｐＮＡ标准溶液，在 ４１０ ｎｍ 下测定其吸光值，分别以
ｐＮＡ浓度和相应的吸光值为横、纵坐标，绘制标准
曲线。 取 ０􀆰 ５ ｍＬ ＧｐＮＡ 溶液（５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ）、０􀆰 ５ ｍＬ
双甘二肽溶液（０􀆰 １ ｍｏｌ ／ Ｌ）、０􀆰 ５ ｍＬ 酶液和 １􀆰 ５ ｍＬ
Ｔｒｉｓ⁃ＨＣｌ缓冲液（ｐＨ８􀆰 ０，５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ），混匀后于 ３７
℃水浴反应 ３０ ｍｉｎ。 反应液于 ４１０ ｎｍ 下测定吸光
值，根据标准曲线计算产物浓度和酶活。
２）固定化酶酶活测定方法　 称取 ０􀆰 ０１ ｇ（湿质
量）固定化酶，与 ０􀆰 ５ ｍＬＧｐＮＡ 溶液（５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ）、０􀆰 ５
ｍＬ双甘二肽溶液（０􀆰 １ ｍｏｌ ／ Ｌ）、２􀆰 ０ ｍＬ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ缓
冲液（ｐＨ ８􀆰 ０，５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ）混匀后加入砂芯管中，于
３７ ℃下振荡反应 １０ ｍｉｎ。 反应结束后滤出反应液，
并于 ４１０ ｎｍ下测定吸光值，再计算酶活。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 ｓＭＴｗ ＧＧＴ ＣＡ 的最适作用 ｐＨ 及 ｐＨ 稳
定性
　 　 取一定量的游离酶和固定化酶在不同 ｐＨ ６􀆰 ０～
１１􀆰 ０ 条件下分别测定其活力，以酶活最高值为
１００％，计算不同 ｐＨ下游离酶和固定化酶的相对酶
活，结果如图 １所示。 由图 １可知：游离酶和ｓＭＴｗ
ＧＧＴ ＣＡ 的最大酶活均出现在 ｐＨ ９􀆰 ０ 左右，但
ｓＭＴｗ ＧＧＴ ＣＡ 的 ｐＨ 适应范围显然更宽，在 ｐＨ
６􀆰 ０～１１􀆰 ０范围内的相对酶活均保持 ８０％以上。
图 １　 ｐＨ对游离酶及 ｓＭＴｗ ＧＧＴ ＣＡ
催化活性的影响
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐＨ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｆｒｅｅ ＧＧＴ
ａｎｄ ｓＭＴｗ⁃ＧＧＴ⁃ＣＡ
游离酶的酶活主要受反应主体相 ｐＨ 的影响，
而对于固定化酶而言，由于酶分子直接附着于载
体，因此载体表面的电荷环境对固定化酶的酶活也
有重要的影响［２６］。
经 ＣＡ 修 饰 后， 附 着 于 ｓＭＴｗ 的 ＧＧＴ 被
Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ 分子所包覆，由于 Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ 具有极强
的水合能力，可在固定化酶表面形成一个具有缓冲
能力的液膜层，使酶分子不直接与反应主体相接
触，其酶活很大程度上受液膜层 ｐＨ 的影响。 由于
Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ液膜层的 ｐＨ 近似为 ９􀆰 ２ 左右，与 ＧＧＴ
的最适 ｐＨ相近，使得 ｓＭＴｗ ＧＧＴ ＣＡ可在较宽的
ｐＨ范围内保持稳定的催化活性。
进一步将游离酶和 ｓＭＴｗ ＧＧＴ ＣＡ分别置于
ｐＨ ６􀆰 ０～１１􀆰 ０的缓冲液中，于 ３７ ℃下保温 ３ ｈ 后测
定酶活，以 ０时刻的初始酶活为 １００％，计算残余酶
活，结果见图 ２。 由图 ２ 可知：ｓＭＴｗ ＧＧＴ ＣＡ 的
ｐＨ稳定性明显高于游离酶，在 ｐＨ １１􀆰 ０的环境下保
温 ３ ｈ后，ｓＭＴｗ ＧＧＴ ＣＡ的残余酶活仍可达初始
值的 ４０􀆰 ７％。
图 ２　 游离酶和及 ｓＭＴｗ ＧＧＴ ＣＡ的 ｐＨ稳定性
Ｆｉｇ􀆰 ２　 ｐＨ ｓｔａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｆｒｅｅ ＧＧＴ ａｎｄ ｓＭＴｗ⁃ＧＧＴ⁃ＣＡ
２􀆰 ２　 ｓＭＴｗ ＧＧＴ ＣＡ 的最适反应温度及热稳
定性
　 　 分别测定游离酶和 ｓＭＴｗ ＧＧＴ ＣＡ在不同温
度（２５～５０ ℃）下的酶活力，以酶活最高值为 １００％，
计算不同温度下的相对酶活，结果见图 ３。 由图 ３
可知：在实验范围内，游离酶和 ｓＭＴｗ ＧＧＴ ＣＡ的
最适温度分别出现在 ４５和 ５０ ℃附近。
进一步将游离酶和 ｓＭＴｗ ＧＧＴ ＣＡ分别置于
不同温度（２０ ～ ５０ ℃）下保温 ３ ｈ 后取样测定酶活，
以初始酶活为 １００％，计算残余酶活，结果见图 ４。
由图 ４可知：经过 ＣＡ修饰后，固定化酶的热稳定性
有了较大的提高，在 ５０ ℃下保温 ３ ｈ 后， ｓＭＴｗ
ＧＧＴ ＣＡ的残余酶活可达初始酶活的 ６５􀆰 ８３％，而
９３　 第 ４期 韦　 敏等：载体两性电解质修饰对固定化 γ 谷氨酰转肽酶 ｐＨ耐受性和催化活性的影响
此时游离酶的残余酶活仅有 ４􀆰 ４％。 这可能是由于
ＣＡ的包覆作用抑制了 ＧＧＴ 的亚基解聚，从而提高
了固定化酶的热稳定性。
图 ３　 温度对游离酶及 ｓＭＴｗ ＧＧＴ ＣＡ
催化活性的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ
ｔｈｅ ｆｒｅｅ ＧＧＴ ａｎｄ ｓＭＴｗ⁃ＧＧＴ⁃ＣＡ
图 ４　 游离酶及 ｓＭＴｗ ＧＧＴ ＣＡ的热稳定性
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｆｒｅｅ ＧＧＴ ａｎｄ
ｓＭＴｗ⁃ＧＧＴ⁃ＣＡ
假定 ＧＧＴ的热失活是一级反应，可得失活反应
方程，见式（１）。
ｌｎ Ｅ
Ｅ０
＝ ｌｎ Ａｒ ＝ － ｋｄ ｔ （１）
式中：Ａｒ 为残余相对酶活；ｋｄ 为热失活速率常数； ｔ
为保温时间；Ｅ为时刻 ｔ未失活的酶的浓度；Ｅ０ 为初
始状态下未失活的酶的浓度。
将游离酶和 ｓＭＴｗ ＧＧＴ ＣＡ 分别在 ３０、３５、
４０、４５ 和 ５０ ℃下保温，每隔一定时间取样测定酶
活，以 ０时刻的酶活为 １００％，计算 Ａｒ。 以一定温度
下 ｌｎ Ａｒ对保温时间 ｔ 作图可得该温度下游离酶和
ｓＭＴｗ ＧＧＴ ＣＡ的 ｋｄ，结果如图 ５和表 １所示。
由图 ５和表 １可知，游离酶和 ｓＭＴｗ ＧＧＴ ＣＡ
失活反应速率常数 ｋｄ均随温度的升高而逐渐上升，
但游离酶 ｋｄ的上升幅度更大。
２􀆰 ３　 米氏常数 Ｋｍ的测定
根据 ＧＧＴ的反应机制，其催化动力学方程可表
图 ５　 游离酶及 ｓＭＴｗ ＧＧＴ ＣＡ的
失活速率常数（ｋｄ）拟合
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｆｉｔｎｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔｓ （ｋｄ）
ｏｆ ｆｒｅｅ ＧＧＴ ａｎｄ ｓＭＴｗ⁃ＧＧＴ⁃ＣＡ
ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ
表 １　 不同温度下游离酶和 ｓＭＴｗ ＧＧＴ ＣＡ的
热失活速率常数 ｋｄ
Ｔａｂｌｅ １　 Ｔｈｅｒｍａｌ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔｓ （ｋｄ） ｆｏｒ ｆｒｅｅ ａｎｄ
ＭＴｗＡ⁃ＧＧＴ⁃ＣＡ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
Ｔ ／ Ｋ
ｋｄ ／ （１０
－３ ｍｉｎ－１）
ｆｒｅｅ ＧＧＴ ｓＭＴｗ ＧＧＴ ＣＡ
３０３ — ０􀆰 ６６
３０８ — ０􀆰 ９４
３１０ １􀆰 ４０ —
３１３ １􀆰 ７５ １􀆰 ３４
３１８ ２􀆰 ２９ １􀆰 ６８
３２３ ５􀆰 ４９ ２􀆰 ２８
示为双底物的 Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ⁃Ｍｅｎｔｅｎ方程，见式（２）。
ｒ ＝
ｒｍａｘ１
ＫｍＳ１
ｃＳ１
＋
ＫｍＳ２
ｃＳ２
＋ １
（２）
式中：ｒ为反应速率（ｍｍｏｌ ／ （Ｌ·ｍｉｎ））；ｃＳ１和 ｃＳ２分别
为 ＧｐＮＡ和双甘二肽的浓度（ｍｍｏｌ ／ Ｌ）；ＫｍＳ１和 ＫｍＳ２
分别为酶对 ＧｐＮＡ 和双甘二肽的亲和力常数
（ｍｍｏｌ ／ Ｌ）。
０４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
当 ｃＳ２＞＞ｃＳ１时，该方程可简化为单底物米氏方
程，见式（３）。
ｒ ＝
ｒｍａｘ１ｃＳ１
Ｋｍ１ ＋ ｃＳ１
（３）
　 　 分别配制 ＧｐＮＡ 浓度为 ０􀆰 ５、 １、 ２、 ３、 ４、 ５
ｍｍｏｌ ／ Ｌ，受体双甘二肽浓度均为 １００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 的底
物溶液，分别以游离酶和 ｓＭＴｗＡ ＧＧＴ ＣＡ为催化
剂，于 ３７ ℃、ｐＨ ８􀆰 ０ 条件下反应 １０ ｍｉｎ，测定 ｐＮＡ
浓度并计算反应初速度，通过 Ｌｉｎｅ ｗｅａｖｅｒ Ｂｕｒｋ 双
倒数作图法，以 １ ／ ｃ（ＧｐＮＡ）为横坐标，１ ／ ｒ 为纵坐标
进行线性拟合，结果见图 ７。
图 ７　 游离酶和 ｓＭＴｗ ＧＧＴ ＣＡ对 ＧｐＮＡ的
亲和力常数（Ｋｍ）拟合
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｆｉｔｎｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ Ｋｍ ｏｆ Ｆｒｅｅ ＧＧＴ ａｎｄ
ｓＭＴｗ⁃ＧＧＴ⁃ＣＡ ｔｏｗａｒｄ ＧｐＮＡ
由图 ７可知：ｓＭＴｗ ＧＧＴ ＣＡ对 ＧｐＮＡ的亲和
力常数 Ｋｍ 为 ０􀆰 ５７９ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，与游离酶 （ ０􀆰 ５９７
ｍｍｏｌ ／ Ｌ）几乎一致，表明 ＣＡ 修饰对 ＧＧＴ 分子的催
化性能基本没有影响。 这可能是由于液膜层的 ｐＨ
环境与 ＧＧＴ 的最适 ｐＨ 相近，有利于保持其催化
构象。
２􀆰 ４　 操作稳定性
取一定量的 ｓＭＴｗ ＧＧＴ ＣＡ 置于 ４ ℃下贮
藏，定期取出测定酶活。 固定化酶稳定性的测试结
果见图 ８。
由图 ８可知：随着转化次数的增多，固定化酶的
活力略有下降，经储存 ６０ ｄ，转化 ２１ 个批次后，
ｓＭＴｗ ＧＧＴ ＣＡ 的 活 力 仍 可 保 持 初 始 值
的 ８４􀆰 ５％。
３　 结论
固定化酶的后修饰是进一步改善固定化酶稳
定性和催化活性的有效途径。 本文采用载体两性
电解质 Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ （ ｐＨ ８􀆰 ０ ～ １０􀆰 ５） 对固定化酶
图 ８　 固定化酶的操作稳定性
Ｆｉｇ􀆰 ８　 Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｆｏｒ ｓＭＴｗ⁃ＧＧＴ⁃ＣＡ
ｓＭＴｗ ＧＧＴ进行后修饰，考察了修饰前后固定化酶
的催化特性和稳定性，得到的具体结论如下：
１）经修饰后，固定化酶 ｓＭＴｗ ＧＧＴ的 ｐＨ耐受
性显著提高，在 ｐＨ ６􀆰 ０～１１􀆰 ０ 范围内均可保持稳定
的催化活性；
２）ｓＭＴｗ ＧＧＴ ＣＡ的热稳定性显著改善，其最
适作用温度提高至 ５０ ℃。 在 ５０ ℃下保温 ３ ｈ，
ｓＭＴｗ ＧＧＴ ＣＡ 的残余酶活仍可 ２）达初始值的
６５􀆰 ８３％，其热失活速率常数（ｋｄ）为 ２􀆰 ２８×１０
－３ ｍｉｎ－１
仅为游离酶的 ４１􀆰 ５％；
３） ｓＭＴｗ ＧＧＴ ＣＡ对 ＧｐＮＡ的亲和力常数 Ｋｍ
为 ０􀆰 ５７９ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，较ＭＴｗＡ ＧＧＴ有所下降，与游离
酶相近。
上述结果表明，采用等电点（ｐＩ）与目标酶最适
作用 ｐＨ接近的载体两性电解质对固定化酶进行后
修饰，不仅可进一步提高固定化酶的稳定性，同时
还可有效拓展其 ｐＨ适用范围，为高 ｐＨ耐受性酶制
剂的开发和应用提供了一条新途径。
参考文献：
［ １ ］ 　 ＭＡＴＳＵＤＡ Ｔ，ＹＡＭＡＮＡＫＡ Ｒ，ＮＡＫＡＭＵＲＡ Ｋ．Ｒｅｃｅｎｔ ｐｒｏｇｒｅｓｓ
ｉｎ ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ［ Ｊ ］ ．
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ，２００９，２０：５１３⁃５５７．
［ ２ ］ 　 ＳＩＤＤＩＱＵＩ Ｋ Ｓ． Ｓｏｍｅ ｌｉｋｅ ｉｔ ｈｏｔ， ｓｏｍｅ ｌｉｋｅ ｉｔ ｃｏｌｄ： ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ ｉｎ
ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｌｉｌｃ ｅｎｚｙｍｅｓ ［ Ｊ ］ ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｄｖ， ２０１５， ３３ （ ８ ）：
１９１２⁃１９２２．
［ ３ ］ 　 ＳＨＡＮＭＵＧＡＭ Ｋ Ｔ，ＩＮＧＲＡＭ Ｌ Ｏ． Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ ｆｏｒ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｏｄｉｔｙ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ［ Ｊ ］ ． Ｊ Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００８，１５：８⁃１５．
［ ４ ］ 　 ＲＯＢＬＥＳ⁃ＭＥＤＩＮＡ Ａ，ＧＯＮＺ􀆓ＬＥＺ⁃ＭＯＲＥＮＯ Ｐ Ａ， ＥＳＴＥＢＡＮ⁃
ＣＥＲＤ􀆓Ｎ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ： ｔｏｗａｒｄｓ ｅｖｅｒ ｇｒｅｅｎｅｒ ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］ ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｄｖ，２００９；２７：３９８⁃４０８．
［ ５ ］ 　 ＣＨＥＮ Ｓ，ＳＵ ＬＩＮＧＱＩＡ，ＣＨＥＮ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｃｕｔｉｎａｓｅ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，
ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ， ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ［ Ｊ ］ ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｄｖ， ２０１３， ３１：
１４　 第 ４期 韦　 敏等：载体两性电解质修饰对固定化 γ 谷氨酰转肽酶 ｐＨ耐受性和催化活性的影响
１７５４⁃１７６７．
［ ６ ］ 　 ＡＫＯＨ Ｃ Ｃ，ＣＨＡＮＧ Ｓ Ｗ，ＬＥＥ Ｇ Ｃ，ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｆｏｏｄｓ ｆｒｏｍ ｒｉｃｅ
ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｅ［Ｊ］ ．Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ，２００８，５６：
１０４４５⁃１０４５１．
［ ７ ］ 　 ＨＯＬＬＡＮＤ Ｊ Ｔ， ＨＡＲＰＥＲ Ｊ Ｃ， ＤＯＬＡＮ Ｐ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｒａｔｉｏｎａｌ
ｒｅｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ
ｓｔａｂｉｌｉｔｙ［Ｊ］ ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１２，７（６）：ｅ３７９２４．
［ ８ ］ 　 ＩＹＥＲ Ｐ Ｖ， ＡＮＡＮＴＨＡＮＡＲＡＹＡＮ Ｌ． Ｅｎｚｙｍｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ
ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ⁃ａｑｕｅｏｕｓ ａｎｄ ｎｏｎ⁃ａｑｕｅｏｕｓ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ［ Ｊ］ ． Ｐｒｏｃｅｓｓ
Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００８，４３：１０１９⁃１０３２．
［ ９ ］ 　 ＦＥＲＮＡＮＤＥＺ⁃ＬＡＦＵＥＮＴＥ Ｒ． Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ
ｅｎｚｙｍｅｓ：ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ｓｕｂｕｎｉｔ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ［ Ｊ］ ． Ｅｎｚｙｍｅ
Ｍｉｃｒｏｂ Ｔｅｃｈｎｏｌ，２００９，４５：４０５⁃４１８．
［１０］ 　 ＢＯＬＩＶＡＲ Ｊ Ｍ， ＣＡＶＡ Ｆ， ＭＡＴＥＯ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ⁃
ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍ
Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ［ Ｊ］ ． Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００８，８０：
４９⁃５８．
［１１］ 　 ＫＡＢＡＳＨＩＭＡ Ｔ，ＬＩ Ｙ，ＫＡＮＡＤＡ Ｎ，ｅｔ ａｌ． Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ
ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｉ ｂｙ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ
ｉｎｔｅｒｓｕｂｕｎｉｔ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ ［ Ｊ］ ． Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ， ２００１，
１５４７：２１４⁃２２０．
［１２］ 　 ＢＨＡＲＤＷＡＪ Ｈ，ＧＵＰＴＡ Ｒ，ＴＩＷＡＲＩ Ａ．Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ
ｅｎｚｙｍｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｔｉｃｓ ［ Ｊ］ ． Ｊ Ｐｏｌｙｍ
Ｅｎｖｉｒｏｎ，２０１３；２１：５７５⁃５７９．
［１３］ 　 ＢＯＬＩＶＡＲ Ｊ Ｍ，ＲＯＣＨＡ⁃ＭＡＲＴＩＮ Ｊ，ＭＡＴＥＯ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏａｔｉｎｇ ｏｆ
ｓｏｌｕｂｌｅ ａｎｄ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｅｎｚｙｍｅｓ ｗｉｔｈ ｉｏｎｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒｓ： ｆｕｌｌ
ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ
［Ｊ］ ． Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００９，１０：７４２⁃７４７．
［１４］ 　 ＰＯＬＬＥＴ Ａ， ＤＥＬＣＯＵＲ Ｊ Ａ， ＣＯＵＲＴＩＮ Ｃ Ｍ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ
ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ｘｙｌａｎａｓｅｓ ｆｒｏｍ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆａｍｉｌｉｅｓ ［ Ｊ］ ． Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，
２０１０，３０（３）：１７６⁃１９１．
［１５］ 　 ＦＵＥＮＴＥＳ Ｍ，ＢＡＴＡＬＬＡ Ｐ，ＧＲＡＺＵ Ｖ，ｅｔ ａｌ．Ｍｉｘｅｄ ｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ
ｓｕｐｐｏｒｔｓ ａｓ ｕｓｅｆｕｌ ｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：
ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｇ ａｃｙｌａｓｅ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ［ Ｊ］ ．
Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００７，８：７０３⁃７０７．
［１６］ 　 ＰＥＳＳＥＬＡ Ｂ Ｃ Ｃ，ＦＵＥＮＴＥＳ Ｍ，ＭＡＴＥＯ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｖｅｒｙ ｓｔｒｏｎｇ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｎ ａｎｉｏｎｉｃ
ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ ｂｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｈｅ ｓｕｐｐｏｒｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ［Ｊ］ ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ Ｔｅｃｈｎｏｌ，２００６，３９：９０９⁃９１５．
［１７］ 　 ＦＥＲＮ􀆓ＮＤＥＺ⁃ＬＡＦＵＥＮＴＥ Ｒ，ＲＯＤＲÍＧＵＥＺ Ｖ，ＭＡＴＥＯ Ｃ，ｅｔ ａｌ．
Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ ｖｉａ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｏｓｔ⁃
ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ［Ｊ］ ．Ｊ Ｍｏｌ Ｃａｔａｌ Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，１９９９，７：
１８１⁃１８９．
［１８］ 　 ＫＥＩＬＬＯＲ Ｊ Ｗ， ＣＡＳＴＯＮＧＵＡＹ Ｒ， ＬＨＥＲＢＥＴ Ｃ． Ｇａｍｍａ⁃
ｇｌｕｔａｍｙｌｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｃａｔａｌｙｔｉｃ
ｍｅｃｈａｎｉｓｍ［Ｊ］ ．Ｍｅｔｈｏｄ Ｅｎｚｙｍｏｌ，２００５，４０１：４４９⁃４６７．
［１９］ 　 ＳＵＺＵＫＩ Ｈ， ＩＺＵＫＡ Ｓ， ＭＩＹＡＫＡＷＡ Ｎ， ｅｔ ａｌ． Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅａｎｉｎｅ， ａｎ ＂ ｕｍａｍｉ ＂ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｔｅａ， ｆｒｏｍ
ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｎｄ ｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ ｗｉｔｈ ｂａｃｔｅｒｉａｌ γ⁃ｇｌｕｔａｍｙｌｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅ
［Ｊ］ ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ Ｔｅｃｈ，２００２，３２：８８４⁃８８９．
［２０］ 　 ＳＵＺＵＫＩ Ｈ， ＭＩＹＡＫＡＷＡ Ｎ， ＫＵＭＡＧＡＩ Ｈ， ｅｔ ａｌ． Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ γ⁃Ｌ⁃ｇｌｕｔａｍｙｌｔａｕｒｉｎｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｔｉｏｎ
ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ γ⁃ｇｌｕｔａｍｙｌｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ⁃１２
［Ｊ］ ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ Ｔｅｃｈ ２００２，３０：８８３⁃８８８．
［２１］ 　 ＳＵＺＵＫＩ Ｈ，ＫＡＴＯ Ｋ，ＫＵＭＡＧＡＩ Ｈ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ
ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄ⁃ｇｌｕｔａｍｙｌ⁃Ｌ⁃ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ （ ＳＣＶ⁃０７ ）， ａ
ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｆｏｒ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ， ｗｉｔｈ ｂａｃｔｅｒｉａｌ γ⁃
ｇｌｕｔａｍｙｌｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅ［Ｊ］ ． Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００４，１１１：２９１⁃２９５．
［２２］ 　 ＤＥＮＧ Ｈａｉｘｉａ，ＹＡＯ Ｚｈｏｎｇ，ＺＨＯＵ Ｚｈｉ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｌ⁃
ｔｈｅａｎｉｎｅ ｕｓｉｎｇ ｃｏｐｐｅｒ （ Ⅱ ）⁃Ｌ⁃ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ａｓ ｄｏｎｏｒ
ｓｕｂｓｔｒａｔｅ［Ｊ］ ．ＣＩＥＳＣ Ｊ，２００８，５９（１２）：３１１５⁃３１１９．
［２３］ 　 ＷＡＮＧ Ｈａｏｑｉ， ＹＡＯ Ｚｈｏｎｇ， ＺＨＯＵ Ｚｈｉ． Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ
ｔｈｅａｎｉｎｅ ｗｉｔｈ Ｌ⁃ｇｌｕｔａｍｉｎｅ⁃Ｚｎ （ ＩＩ ） ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ［ Ｊ ］ ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
Ｂｉｏｐｒｏｃ Ｅｎｇ，２０１２，１７：１１３５⁃１１３９．
［２４］ 　 ＱＩＮ Ｄａｎｈｕａ，ＹＡＯ Ｚｈｏｎｇ，ＷＡＮＧ Ｈａｏｑｉ． Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＧＧＴ
ｏｎ ｍｅｓｏ⁃ＴｉＯ２：ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ［ Ｊ］ ．ＣＩＥＳＣ Ｊ，２０１１，６２
（２）：３７８⁃３８５．
［２５］ 　 ＹＥ Ｌｉｊｉｎｇ，ＷＡＮＧ Ｈａｏｑｉ， ＹＡＯ Ｚｈｏｎｇ， ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｅ
ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｓｉｌａｎｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ａｇｅｎｔ ｏｎ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｐｚｃ ｖａｌｕｅ
ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ ｌｏａｄｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ＴｉＯ２ ｗｈｉｓｋｅｒｓ ［ Ｊ］ ．
ＣＩＥＳＣ Ｊ，２０１３，６４（６）：２１６０⁃２１６８．
［２６］ 　 ＦＯＲＥＳＴＩ Ｍ Ｌ，ＶＡＬＬＥ Ｇ，ＢＯＮＥＴＴＯ Ｒ，ｅｔ ａｌ． ＦＴＩＲ，ＳＥＭ ａｎｄ
ｆｒａｃｔａｌ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐａｓｅ Ｂ ｆｒｏｍ Ｃａｎｄｉｄａ
ａｎｔａｒｃｔｉｃａ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｏｎｔｏ ｔｉｔａｎｉａ ａｔ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ［Ｊ］ ．Ａｐｐｌ
Ｓｕｒｆ Ｓｃｉ，２０１０，２５６：１６２４⁃１６３５．
（责任编辑　 荀志金）
２４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷