全 文 ：生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
第 19卷 第 5期
2007年 10月
Vol. 19, No. 5
Oct., 2007
文章编号 ：1004-0374(2007)05-0518-08
人胚胎干细胞的体外定向分化
刘卫东，任彩萍*，姚开泰*
(中南大学肿瘤研究所，长沙 410078)
摘　要：人胚胎干细胞(human embryonic stem cells, hESCs)由囊胚期胚胎内细胞团分离培养获得，具有
保持未分化状态的无限增殖能力。hESCs具有多向分化潜能，在体内和体外均可分化形成所有三个胚层
(外胚层、中胚层、内胚层)的衍生物。hESCs一般在鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast, MEF)
饲养层上培养和扩增。为了优化培养条件，目前人们已发展了多种人类细胞饲养层和无饲养层、非条
件培养基体系。hESCs可以在体外定向诱导分化为多种细胞类型，为揭示人胚早期发育机制和发展多种
疾病的细胞移植治疗奠定了基础。hESCs可以在体外进行遗传修饰，将有助于揭示特定基因在发育过程
中的调控和功能。对 hESCs 的深入研究将极大地推动医学和生命科学的进展，并将最终应用于临床，
造福人类。
关键词：人胚胎干细胞；定向分化；遗传修饰
中图分类号：Q81 3　　文献标识码：Ａ
In vitro directed differentiation of human embryonic stem cells
LIU Weidong, REN Caiping*, YAO Kaitai*
(Cancer Research Institute, Central South University, Changsha 410078, China)
Abstract: Human embryonic stem cells (hESCs) can be derived from the inner cell mass of blastocyst embryo and
propagate infinitely in an undifferentiated state. hESCs display pluripotency and can be differentiated into
derivatives of all three embryonic germ layers (ectoderm, mesoderm and endoderm) both in vitro and in vivo.
Generally hESCs culture requires mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells to maintain the undifferenti-
ated state. In order to optimize the culture conditions, human feeder cells and feeder-free, unconditioned culture
systems have been developed. In vitro, hESCs can be directed to differentiate into various cell types, which lays
a foundation for cell transplantation therapy and clarification of the human embryonic development. hESCs can
be genetically modified in vitro, which will help to elucidate the specific genes regulation and functions in
embryonic development. Deeper studies of hESCs will greatly further the progression of medical and life sciences,
and will be finally applied in clinical medicine to benefit mankind.
Key words: human embryonic stem cell; directed differentiation; genetic modification
胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)，尤
其是 hESCs的建立、研究和应用在国际学术界引起
巨大轰动，被认为是继“人类基因组计划”之后，
医学、生命科学上的又一革命性进展。 hESCs一
般来自由体外受精卵发育成的囊胚期胚胎的内细胞
团[1-2]。这些细胞具有正常的核型；表达高水平的
收稿日期：2007-01-18；　　修回日期：2007-04-18
基金项目：国家自然科学基金(30200140)
作者简介：刘卫东( 1 9 6 8 －)，男，助理研究员；任彩萍( 1 9 7 2 －)，女，副研究员，硕士生导师，﹡通讯作者，
E-mail：rencaiping@xysm.net； 姚开泰(1931－)，男，研究员，博士生导师，﹡通讯作者，E-mail：ktyao@fimmu.com
519第 5期 刘卫东，等：人胚胎干细胞的体外定向分化
端粒酶活性。端粒酶是一种可使细胞无限分裂的
RNA依赖性DNA聚合酶，负责维持染色体长度，为
永生化细胞所特有，分化细胞内一般无此酶活性。
hESCs的多能性在体内和体外都被得到证明。在体
内，将 hESCs注射入免疫缺陷小鼠，形成含三个胚
层衍生物的畸胎瘤[1]；在体外，将 hESC悬浮培养导
致形成拟胚体(embryoid body, EB)。EB中的细胞分
别具有三个胚层特异的分子标志物。hESCs可在体外
诱导分化为神经细胞、角质形成细胞、心肌细胞、
内皮细胞、造血细胞、肝细胞、胰岛 β 细胞、滋
养层细胞等多种细胞类型。在研究人胚胎发育和疾
病发生、器官和细胞移植治疗、基因治疗、药物筛
选与新药开发方面，hESCs具有广阔的应用前景。
1　hESCs的来源、培养和扩增
囊胚期胚胎由内细胞团和滋养外胚层组成。前
者将产生胚胎的所有组织和胚外结构，后者形成胎
盘。hESCs一般来自囊胚的内细胞团。首先用免疫
外科方法去掉囊胚外围的滋养外胚层， 再将内细胞
团平铺于经γ-射线或丝裂霉素C处理的MEF饲养层
上，在高血清浓度条件下培养数天后，ESC集落开
始形成，此时须将 ESC集落转移至新鲜的MEF饲
养层[1-2]。此后为防止分化，须大约每隔 7d进行分
散和重新平铺，分散的方法可以是微吸管机械分
散，也可以用 IV 型胶原酶消化分散。
在MEF饲养层上或在MEF条件培养基中培养的
hESCs不可能应用于临床治疗，因其有可能将异种
生物病原体由小鼠转移至人类组织。为解决这一问
题，人们研究发现了多种可以维持 hESCs未分化状
态扩增的人类饲养层细胞，包括人胎儿肌肉、人胎
儿皮肤、成人输卵管上皮饲养层[3]、人类包皮饲养
层[4]、人类子宫内膜饲养层[5]、成人骨髓基质细胞[6]
和分化的 hESCs[7-8]等。 目前尚未发现与这些饲养层
相关且能维持 hESCs自我更新的共同的活化因子。
为避免异种生物污染，Ellerstrom等[9]发展了一种无
异种生物培养基，建立了无异种生物人包皮成纤维
细胞饲养层，并用酸性 Tyrode’s溶液溶解法代替常
规的免疫外科方法分离内细胞团，由此得到的无异
种生物hESC系SA611表达未分化状态标志分子，具
正常双倍体核型及体内外多向分化潜能，已传三十
多代并可冷冻保存。
传统的hESC培养方法需不断制备和鉴定MEF饲
养层，不利于大规模培养 hESCs。为此，Xu等[10]
利用由细胞外基质，如Matrigel或 laminin(层黏素)
组成的无饲养层体系培养 hESCs并取得成功，但这
种方法仍然需要MEF条件培养基。Xu等[11]发现在
非条件培养基中，碱性成纤维细胞生长因子 bFGF
和 BMP 信号拮抗因子 noggin协同作用可以维持
hESCs未分化增殖，同时可以维持 hESCs的正常核
型和体内外发育潜能。这一发现对于揭示 hESCs自
我更新的分子机制和简化 hESCs培养都具有重要意
义。目前，无饲养层、非条件培养基体系已成为
很多实验室的常规方法。
2　hESCs的体外定向分化
2 . 1　神经细胞　在含有胰岛素、转铁蛋白、孕
酮、腐胺、亚硒酸钠、肝素和 FGF-2的 DMEM/
F12培养基中培养 EB, 其中心部位形成玫瑰花结，
与早期神经管十分相似，并表达神经标志抗原
nestin和Musashi-1。用 dispase进行酶处理，结合
基于不同黏附力的分离方法，可以将中心部位的神
经管样玫瑰花结从周围的扁平细胞分离出来。撤除
FGF-2, 平铺于鸟氨酸和层黏连蛋白底物上，这些
hESCs来源的神经祖细胞可以体外分化成CNS所有
三种主要细胞类型，即神经元、星形细胞和少突神
经胶质细胞。大部分神经元呈谷氨酸能表型，少部
分被γ-氨基丁酸(GABA)抗体标记，还有少量神经元
表达一种多巴胺合成的限速酶——酪氨酸羟化酶
(tyrosine hydrolase, TH)。移植入新生鼠侧脑室后，
这些神经祖细胞被整合进不同的脑区，包括大脑皮
层、海马、嗅球、间隔、丘脑、下丘脑、纹状
体、中脑、胼胝体、内囊和海马纤维束等。在这
些区域， 神经祖细胞分化成神经元和星形细胞，且
没有发现畸胎瘤的形成[12]。
Reubinoff等[13]用含重组人EGF和 bFGF的培养
基培养 hESC集落，这些细胞集落发育成圆球体，
球体中99%的细胞表达NCAM，97%的细胞表达中
间纤维蛋白 nestin。球体中的神经祖细胞在体外可
分化为星形细胞、少突神经胶质细胞和成熟神经
元。移植入新生鼠脑室后，大量细胞整合入宿主脑
实质，并分化成三种神经系。移植的细胞可沿已经
建立的迁移路线迁移，并以区域特异性方式分化，
表明它们可对位置信息发生反应，并参与宿主脑的
发育进程。
除神经祖细胞外，hESCs还可被诱导分化为特
定的神经元亚型。其中多巴胺神经元由于可用于帕
金森氏病的移植治疗而引起人们的广泛关注。将
hESCs平铺于基质细胞MS5或MS5-Wnt(转染Wnt基
520 生命科学 第19卷
因的MS5细胞)饲养层上，可形成玫瑰花结神经上
皮结构，表达神经标志分子 Pax6、nestin、NCAM
和 Sox1。机械分离玫瑰花结集落，重铺于多聚鸟
氨酸 /层黏连蛋白包被的盘中，在含 SHH (sonic
hedgehog)和 FGF8的 N2培养基中培养，接着在含
SHH、FGF8并补充胶质细胞系来源的神经营养因
子、二丁酰 cAMP和转化生长因子 β3的N2培养基
中生长，第二次传代的细胞分化后，30% — 50%
的细胞为 Tuj1阳性神经元，其中 64%— 79%的细
胞表达酪氨酸羟化酶。 免疫细胞化学检测显示细胞
在分化过程中依次表达中脑多巴胺神经元标志分子
Pax2、Pax5和 engrailed-1。电镜分析显示 10%—
20%的细胞形成不成熟突触接触，2%— 4%的细胞
形成成熟突触。反向HPLC显示基础的和KCl诱导
的多巴胺释放。在 65%的细胞中可检测到去极化诱
导的动作电位，且该动作电位可被河豚毒素阻断。
这些数据表明可在体外自 hESCs获得功能性中脑多
巴胺神经元[14]。
Yan 等[15]通过在不同阶段使用 FGF8和 SHH处
理神经上皮细胞分别获得前脑和中脑多巴胺神经
元。使用 FGF8和 SHH是基于在多巴胺神经元发育
过程中需要峡组织者(isthmic organizer)合成的这两种
分子的作用[16-17]。此外，用一种简单的无血清悬浮
培养体系也可以使 hESCs分化成多巴胺神经元[18]。
将这种分化的细胞移植入6-羟基多巴胺损伤的鼠脑
中(鼠帕金森氏病模型)，8周后可在纹状体检测到
存活的 hESCs来源的 TH阳性神经元。
hESCs还可以体外诱导分化成运动神经元。用
化学限定的贴壁集落培养体系使 hESCs分化成神经
外胚层，再用视黄酸(retinoic acid, RA)和 FGF2处
理，在含 RA和 SHH的培养基上分化，最后在培养
基中加入 BDNF(brain-derived neurotrophic factor)、
GDNF(glial-derived neurotrophic factor)和IGF-1(insulin-
like growth factor-1), 并降低 SHH的浓度。这种体外
生成的运动神经元具电生理活性，与邻近神经元形
成有功能的突触，可诱导乙酰胆碱受体的群集，并
可建立有功能的神经肌肉传递[19]。Lim等[20]研究了
三株 hESC系经 EB培养分化为运动神经元的方法，
发现RA和SHH联合处理EB可使分化效率提高三倍
以上，分化的运动神经元均表达特异标志分子
HB9。而Wnt3A和骨形成蛋白 -2(bone morphogenetic
protein-2, BMP-2)对RA和SHH的诱导分化作用具有
明显的抑制效应。自 hESCs生成的功能性运动神经
元可以用于运动神经元相关疾病，如肌萎缩性侧索
硬化症的药物筛选，也可以用于运动神经元疾病或
脊髓损伤的细胞替代治疗。
2.2　星形细胞　中枢神经系统主要由神经元、小神
经胶质细胞和大神经胶质细胞组成。星形细胞是大
神经胶质细胞的主要类型，在中枢神经系统发育过
程中有着广泛的支持功能。cyclopamine是 hedgehog
(Hh)信号通路的抑制子，用 cyclopamine处理 hESCs，
随后在人星形细胞介质中培养，可导致 hESCs向星
形细胞分化。分化的细胞表达星形细胞特异的标志
分子胶质纤维酸性蛋白(GFAP)，同时也表达神经标
志分子 nestin。神经营养因子，如胶质细胞系源性
神经营养因子(GDNF)和脑源性神经营养因子(BDNF)
的表达水平也明显高于未经处理的对照细胞[21]。
2.3　黑素细胞　表皮黑素细胞保护皮肤免受紫外线
伤害，其缺损可导致白化病、花斑和白斑等。Fang
等[22]利用Wnt3A、endothelin-3和干细胞因子等生长
因子在 4—6周内使 hESC分化成黑素细胞群落。这
些细胞表达黑素细胞标志分子，如小眼相关的转录
因子和酪氨酸酶，发育出黑素体并产生黑色素。当
整合进人重建皮肤时，它们象表皮来源的黑素细胞
一样，聚集在沿基底膜的适当位置，移植入免疫缺
陷鼠后仍保持稳定的表型。
2.4　角膜上皮细胞　角膜位于眼睛前部，由一复层
上皮所覆盖。角膜上皮由位于缘区的干细胞不断更
新。角膜干细胞则在缘微环境(壁龛)提供的各种因
素中维持。由于该壁龛对于角膜干细胞十分特异，
可以假设体外复制这些因素将导致 hESCs向角膜上
皮样细胞分化。事实上， Ahmad等[23]在Ⅳ型胶原包
被的盘和缘成纤维细胞条件培养基中培养hESCs, 导
致其多潜能性丧失并向上皮样细胞分化。扫描电镜
观察发现 hESCs分化的细胞和缘上皮细胞一样具有
很多微纤毛，但比缘上皮细胞要小得多。在 hESCs
分化的过程中，Oct-4和 Nanog的表达明显下降，
SSEA4的表达也急剧下调；而 p63、CK3等上皮特
异基因的表达则相继上调。集落形成效率分析表
明，从开始培养到第 7d，集落形成效率逐渐上升，
之后开始迅速下降，与 p63的表达变化相一致。
2.5　角质形成细胞　H9细胞注射至SCID鼠 2个月
后形成含角质形成细胞的团块，团块经胰酶消化并
接种入含经辐射的 3T3细胞和 FAD培养基的平皿
中，形成的集落具角质形成细胞的形态学特征并表
达 p63、碱性核蛋白和K14。继续培养 20d后发生
521第 5期 刘卫东，等：人胚胎干细胞的体外定向分化
7分层和终末分化并表达K14和外皮蛋白。由hESCs
形成的EB中也含有向角质形成细胞系分化的细胞，
这些细胞自 EB周边向外迁移。迁移的细胞首先失
去Oct-4表达，接着依次表达 p63、K14和碱性核
蛋白。最后，与 3T3细胞共培养导致终末分化及其
标志物外皮蛋白的表达[24]。 Ji等[25]也自EB培养获得
表达K14的角质形成细胞，这些细胞在含氢化可的
松的培养基中可以传代，加入钙离子后可诱导分层
和终末分化。角质形成细胞的制备将在伤口愈合治
疗中发挥重要作用。
2.6　心肌细胞　用hESCs悬浮培养方法形成EB，平
铺于明胶包被的盘中，4— 22d后约 8.1%的 EB中
出现按节奏收缩的区域。这些自发收缩的细胞可用
机械方法进行分离，分离的心肌样细胞大多是单核
的，呈圆形或杆状，含不同程度的肌纤维组织。在
某些细胞中可观察到Z带，在许多分化的EB中还可
观察到由缝隙连接和桥粒组成的闰盘。用免疫细胞
化学方法可检测到 α / β 肌球蛋白重链、α 肌动蛋
白、心脏 I型肌钙蛋白(cTnI)、结蛋白(desmin)和
ANP，但伴肌动蛋白(nebulin)染色呈阴性，说明所
检测细胞具心肌特性而非骨骼肌[26]。另一篇报道用
相似的 EB培养方法获得心肌样细胞，其产生心肌
样细胞的EB比例高达 70%。此外还发现用 5-杂氮 -
2-脱氧胞苷处理可以加强心肌细胞分化，而DMSO
或视黄酸则无此作用[27]。Norstrom等[28]用 EB培养
方法获得心肌样细胞，自发跳动的细胞群落占EB总
数的 30%。这些细胞群落可以分散成单个细胞悬液
并可冷冻保存。用电镜可观察到 Z盘和紧密连接；
用免疫组化分析可检测到心脏特异分子的表达。药
物学刺激可导致肾上腺素能和毒蕈碱能受体偶联系
统的反应。Yoon等[29]则发现悬滴培养结合 5-杂氮
胞苷处理可大幅度提高 hESCs向心肌细胞分化的效
率。这一发现也说明基因的甲基化状态在心肌发育
过程中扮演重要的角色。Pal和Khanna[30]自两株不
同来源的hESC系用相同的方法获得EB, 接着用含低
浓度胎牛血清的培养基培养，并加入 BMP-2, 由此
获得的心肌细胞表达心脏基因和蛋白，并对功能分
析发生反应。在培养的 EB中加入 noggin可拮抗
BMP-2的诱导作用。
共培养方法也可用来从 hESCs产生心肌细胞。
Mummery等[31]将 hESCs与鼠内脏内胚层细胞END-2
共培养，15%— 20%的培养物形成跳动的心肌集落。
这些细胞对药物的反应和动作电位的特性类似于人胎
儿左心室心肌细胞，而与鼠心肌细胞则不同[31-33]。
hESCs向心肌细胞的分化研究为心肌梗塞等心
脏疾病的细胞移植治疗带来了新的希望。Capi和
Gepstein[34]对 hESC来源的心肌细胞应用于临床再生
医学的策略进行了详细而深入的探讨。
2.7　内皮细胞　EB形成也被用作内皮衍生物分离的
起始步骤。在EB中可观察到内皮标志分子的表达随
时间而增强，这些标志分子包括 PECAM1(CD31)、
血管内皮钙黏连素(VE-cad和 CD34)、血管内皮生
长因子受体２(VEGFR-2)、Tie-1、GATA-2、GATA-
3，以及血管 / 造血祖细胞表面标志分子 AC1 33/
CD133。在 EB中，这些内皮细胞不是呈单个细胞
存在，而是组织成特定的通道，表明 hESCs可自
发分化为内皮细胞并形成血管样结构。用抗内皮标
志物PECAM1的抗体标记后通过FACS可分离EB中
的内皮细胞。当分离的PECAM1阳性细胞在基质胶
上培养时，可形成类似血管的管样结构。将
PECAM1阳性细胞移植入 SCID鼠的皮下组织，可
形成具人 PECAM1和 CD34免疫活性的微血管，其
中的一些还含有鼠的血细胞[35]。
2.8　造血细胞　成体造血干细胞(HSC)移植是现今应
用得最普遍的细胞移植治疗。HSC主要源自骨髓、
外周血和脐带血，目前有约 2/3的患者得不到匹配
的供体。hESC的建立为此类移植提供了新的来源。
为促进造血细胞生成，未分化的H1细胞与经辐射的
鼠骨髓基质细胞S17或鼠卵黄囊内皮细胞C166共培
养。培养介质含 20%的胎牛血清(FBS)，但无其他
外源细胞因子或生长因子。17d后，经流式细胞计
数分析，约 1%— 2%的细胞为 CD34+CD38-，与早
期造血细胞表型一致。在CFU试验中，每105个H1/
S17细胞可产生 30.4个集落，每 105个H1/C166细
胞可产生 4.3个集落。两者都可产生红系和髓系集
落。CD34+细胞可以通过MACS富集。这种选择可
以增强 CFU形成，形成的集落包括红细胞、巨噬
细胞、粒细胞和巨核细胞集落[36]。
在EB的发育过程中用一组细胞因子结合BMP-4
进行处理，可以强有力地促进造血分化，诱导形成
的造血祖细胞可以产生红系和髓系衍生物。这些细
胞因子包括干细胞因子(SCF)、IL-2、IL-3、粒细
胞集落刺激因子(GCSF)和 Flt-3配体[37]。在细胞因
子和BMP-4的基础上加入血管内皮细胞生长因子A
(VEGF-A)可进一步加强 hESCs向红细胞分化[38]。
Bowles等[39]发现用脂质转染法将转录因子HOXB4基
522 生命科学 第19卷
因导入 hESCs可显著增强 hESCs的造血发育，且这
种分化无需加入其他的细胞因子。
Qiu等[40]报道人胎肝来源的细胞系FH-B-hTERT
诱导 hESCs分化成造血细胞的效率比 S17细胞高。
S17 和FH-B-hTERT共培养体系均能重现发生在卵黄
囊发育期的珠蛋白转换，它们产生的红系细胞首先
主要表达 ε珠蛋白mRNA, 接着转为主要表达 γ珠蛋
白mRNA，而不合成任何 β珠蛋白mRNA。
将 hESC与鼠基质细胞系OP9共培养，能同时
产生CD34+造血细胞和CD73+间充质干细胞(MSC)，
两者生成的时间动力学几乎完全相同。分离的
CD34+细胞能形成造血细胞集落。纯化的 CD73+
MSC具典型的骨髓来源MSC的形态学特征和细胞表
面标志，能够向成骨细胞、成脂肪细胞和成软骨细
胞分化 [ 41 ]。
2.9　软骨细胞　Hwang等[42]用 EB培养方法高效地
自 hESC获得间充质样细胞。这些细胞表达间充质
干细胞表面标志分子，包括 CD29、CD44、CD105
和血小板来源生长因子受体 α (PDGFR-α)。当这些
细胞包埋在精氨酸 -甘氨酸 -天冬氨酸(RGD)修饰的
聚乙二醇水凝胶中，并结合 TGF-β1处理时，可观
察到新形成的软骨。该软骨中有嗜碱性细胞外基质
沉积，软骨特异的分子如Ⅱ型胶原、Aggrecan和
连接蛋白(link protein)等的表达明显上调。
最近的一项研究比较了EB直接平铺向外生长体
系和EB来源的高密度小团块体系对hESCs软骨形成
分化的影响，发现两者均可导致软骨形成，但
Col2、Col1等基因表达的时相有很大差别，Ⅱ型
胶原的沉积和硫酸氨基葡聚糖的累积也有较大差
异。在对照条件下均有明显的 Col1、Col2a1、link
protein和 Sox9等基因的诱导表达，而 BMP-2处理
能进一步增强这些基因的表达。对照条件下可检测
到内源性BMP-2表达，这可能是对照培养中软骨形
成分化的诱导因素[43]。
2.10　肝细胞　肝细胞分化研究在肝硬化等疾病的移
植治疗及药物筛选方面有重要的价值。在丁酸钠的
处理下，hESCs可经 EB或被直接诱导分化成肝样
细胞，同时也有明显的细胞死亡。分化的细胞在形
态学上与原代培养肝细胞相似，70％— 80%的细胞
表达肝相关蛋白如白蛋白、AAT、CK8和 CK18，
70%—76%的细胞积累糖原。EROD分析表明H1和
H9 hESC来源的肝样细胞均具有可诱导的细胞色素
p450活性，说明分化细胞具成人肝细胞的功能特
性。研究表明丁酸钠可能是通过其组蛋白脱乙酰酶
抑制剂的作用介导干细胞的定向分化，因为用另一
种组蛋白脱乙酰酶抑制剂 trichostatin A对 hESCs进
行诱导，也得到相似的分化结果[44]。
Lavon等[45]用EB培养方法获得肝样细胞。他们
将肝特异的白蛋白基因启动子与 eGFP基因融合，
再将此ALB-eGFP融合基因转染hESCs。EB培养20d
后，可用共聚焦显微镜检测到 eGFP阳性细胞，免
疫染色显示这些细胞同时表达白蛋白。E B 中的
eGFP阳性细胞可用FACS分离并继续培养扩增。他
们还鉴定了几种生长因子，如 aFGF、bFGF、BMP-4
和HGF等对肝分化的影响，发现只有 aFGF具明显
的促分化效应。
2.11　胰岛β细胞　1型糖尿病一般源自胰岛β细胞
的自身免疫性损坏及由此导致的胰岛素绝对缺乏，
目前一般依赖于外源胰岛素治疗。移植治疗是一种
全新的治疗方案，其主要障碍是胰岛素生成细胞来
源有限。hESCs 的分离为获得足够的 β细胞以进行
移植治疗带来新的希望。 用EB培养方法和免疫组化
染色观察到，60%— 70%的 hESCs 来源的 EB中，
平均 1%— 3%的细胞呈胰岛素染色阳性[46]。这些
细胞分散在整个 EB中或组织成小的集落，并表达
对 β细胞功能有重要作用的基因GLUT1和GK。但
另一项研究认为这1%—3%的胰岛素阳性细胞可能
从培养基中吸收富集胰岛素，而并不从头合成和分
泌胰岛素，因为用 RT-PCR没有检测到 insulin-1的
表达，insulin-2 mRNA的转录也很微弱，而且检测
不到胰岛素从头合成的副产物 C肽的表达[47]。
Segev等[48]自 hESCs获得了由胰岛素生成细胞
组成的不成熟岛样集落。首先用悬浮培养生成 EB，
并平铺于胰岛素 -转铁蛋白 -硒 -纤维结合素(ITSF)
培养基中，再在含 bFGF、N2和 B27的培养基中扩
增胰腺前体细胞。接着降低培养基中的葡萄糖浓
度，撤消 b F G F，加入烟酰胺。最后，分离细胞
并悬浮培养以使细胞继续生长，形成细胞集落，其
胰岛素的分泌达到 225.8±78µu/ml/105cell/hour。将
这些细胞在含葡萄糖的培养基中孵育，随着时间的
延长，培养基中积累的胰岛素逐渐增加，60min后
达到最高值。RT-PCR检测到一系列胰腺基因的增
强表达。免疫荧光检测显示这些细胞共表达胰岛素
和 C肽，表明了无可否认的胰岛素生成。除胰岛素
外，大多数细胞还共表达胰高血糖素或生长抑素，
提示这些细胞类似不成熟的胰腺内分泌细胞。进一
523第 5期 刘卫东，等：人胚胎干细胞的体外定向分化
步的研究和改进将完善胰岛素生成细胞的制备以作
为移植治疗的无限制细胞来源。
2.12　生殖细胞　Chen等[49]建立了三株台湾人来源
的 hESC系，在研究其自发分化的过程中发现这些
细胞系分化的细胞除表达三个胚层的标志分子外，
还检测到生殖细胞标志分子的表达，包括 c-kit 、
STELLA、VASA和GDF9。这表明 hESC可能有向
生殖细胞分化的潜能。
2.13　滋养层　用重组人 BMP-4处理 hESCs，可使
其分化为滋养层，其特征为扁平、扩大的细胞和增
殖减少。加入 BMP信号抑制子如可溶性 BMP受体
或 BMP拮抗蛋白 noggin，可阻断由 BMP-4诱导的
形态学改变。BMP-4处理单个的ESC可观察到多核
细胞的形成，其形成方式是细胞融合而非核内倍
增。cDNA微阵列和 RT-PCR分析表明 BMP-4处理
7d后，滋养层或胎盘标志基因，如 CG-α、CG-
β、黄体化激素 β、胎盘生长因子、GCM1、HLA-
G1和CD9的表达均显著上调。BMP-4处理的H1细
胞与未分化细胞相比，其分泌入介质中的胎盘激素
CG、雌二醇和孕酮的浓度也明显升高。该研究为
进一步阐明滋养外胚层的分化机制提供了一个很好
的模型 [ 50 ]。
3　hESC的遗传修饰
hESC的遗传修饰是了解和影响其生物学特性的
重要手段。导入影响 hE SC s 存活、扩增、分化、
免疫原性或内源基因表达的基因于临床也是十分有
用的。目前，hESCs遗传修饰的方法主要有脂质体
转染、电穿孔转染(同源重组)、病毒载体转导和
siRNA干扰等。
Eiges等[51]利用TK启动子和荧光酶报道基因构
建成表达载体，分别用三种基于脂质体的试剂
Lipofectamine(Life Technologies)、FuGene(Boehringer
Mannheim)和 ExGen 500(Fermentas)进行转染实验，
发现 ExGen 500的转染效率最高。接着，用 ExGen
500转染方法，Rex1-EGFP表达载体被转染入hESCs
中，获得的稳定转染率为 10-5。随着 hESCs在形成
EB的过程中自发分化，GFP表达逐渐减弱直至停止
表达。Ren等[52]发现在表达EBNA1的hESCs中，EBV
潜伏期复制起始序列 oriP能轻微地提高瞬时转染效
率，且与不含 oriP的质粒载体相比，其稳定转染的
效率提高近1 000倍。通过含oriP的质粒表达shRNA，
EBV载体系统还能够有效地提高hESCs中的RNA干
扰效率。
用脂质体方法可有效地实现瞬时表达和随机的
稳定整合，但难以获得特异的基因打靶事件。根据
hESC和鼠胚胎干细胞(mESC)的细胞大小改变电穿孔
参数，对成团的 ESCs而不是单个的细胞进行电穿
孔，并改用等渗的、蛋白质含量丰富的标准细胞培
养液代替 PBS。Zwaka和 Thomson[53]成功地利用同
源重组对HPRT1基因和POU5F1基因实现了基因打
靶。在转染了 HPRT1和 POU5F1基因的细胞中，
同源重组的比率分别为 2%和 27%。
另一种相当成功的方法是通过使用自我失活的
慢病毒载体获得稳定的转基因 hESCs。利用水泡性
口炎病毒G蛋白(vesicular stomatitis virus G, VSV-G)
包装慢病毒载体，产生的VSV-G假型载体大大增强
了转导效率，具广泛的亲嗜性且能被超速离心浓聚
而不变性。在不同的MOI (multiplicity of infection)
条件下，稳定转导 eGFP的效率可以达到 20% —
80%。在 hESCs自发分化为三个胚层的衍生物或定
向分化为造血细胞的过程中，表达 eGFP的细胞比
率仍然维持较高水平[54-55]。VSV-G假型慢病毒载体
在高效转导hESCs的同时也高效转导MEF细胞，这
使随后的分析和研究复杂化。鉴于此，Jang等[56]
发展了长臂猿白血病病毒(GALV)和猫内源性病毒
(RD114)糖蛋白包装的 GALV假型慢病毒载体和
RD114假型慢病毒载体，两者都可以选择性地转导
hESCs而不转导MEF细胞，且在 hESCs分化过程中
保持转导的稳定性。
为阐明控制 hESCs多能性、自我更新和细胞分
化的分子机制，了解单个基因产物的功能和调节是
极其重要的。目前，siRNA已被成功地用于 hESCs
中基因的下调研究。应用这种方法， Matin等[57]和
Hay等[58]发现Oct-4而非β-2微球蛋白的表达下调可
以导致 hESCs的分化。Zaehres等[59]利用逆转录病毒
和慢病毒载体将 siRNA导入 hESCs中，使 eGFP转
基因和Oct-4、Nanog转录因子高效沉默。Oct-4和
Nanog的基因沉默促进分化，表明它们在 hESCs自
我更新过程中具有关键作用。
4　总结
综上所述，hESC及其体外分化模型能够模拟
人胚正常发育进程，为人胚发育机制的研究和多种
疾病的移植治疗提供了新的思路；但要应用于临
床，还存在一些技术上的问题。主要包括以下几个
方面：(1) hESCs很容易自发分化为其他细胞，如
何维持高效的体外扩增而不发生细胞分化仍需进一
524 生命科学 第19卷
步研究干细胞的培养条件。(2)如何高效、特异地定
向诱导分化及如何获得高纯度的分化细胞尚需进一
步研究。ESC有形成畸胎瘤的倾向，因而有必要对
ESC及其衍生细胞移植的安全性做一全面客观的评
价。(3)要使 ESC在体外发育成完整的器官尚需技术
上的突破：因为器官的形成是非常复杂的三维过
程，很多器官是由两个不同胚层的组织相互作用而
形成的。(4)目前，由体细胞克隆 hESC尚未获得成
功。这一技术的突破将有助于解决细胞移植的免疫
排斥问题。来自肿瘤、神经变性等疾病患者的疾病
特异干细胞对药物筛选方法极其有用，但目前尚未
取得突破性进展。(5)很多证据表明，肿瘤来源于肿
瘤干细胞，而肿瘤干细胞是来源于成体干细胞还是
祖细胞或者终末分化的细胞，目前尚未得到直接的
证实。很多正常发育过程中起作用的细胞信号分
子，如 BMP、Notch、Wnt等在肿瘤进程中亦有
关键作用，如何应用 hESC进行肿瘤发生发展机制
的研究还有待进一步的探索。随着上述问题的解
决，hESC必将极大地推动生命科学和医学基础领
域的研究，也必将为多种疾病的临床治疗带来新的
希望，从而造福人类。
致谢：徐仁和、彭白露、张贺军等对本文的完成给
予了大量的帮助，在此深表感谢。
[参 考 文 献]
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