全 文 ：第24卷 第1期
2012年1月
Vol. 24, No. 1
Jan., 2012
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
文章编号：1004-0374(2012)01-0037-06
胚胎干细胞诱导分化为雄性生殖细胞的研究进展
孙　敏，施青青，李碧春*
(扬州大学动物科学与技术学院，江苏省动物繁育与分子设计重点实验室，扬州 225009)
摘　要：胚胎干细胞 (embryonic stem cells, ES细胞 )具有自我更新及无限分化潜能，理论上可以分化为生
殖细胞。目前，在人及鼠中已有体外诱导 ES细胞分化为成熟精子的报道。系统阐述影响 ES细胞分化为雄
性生殖细胞的内源性及外源性因素，并结合国内外最新研究进展总结其诱导分化方法，展望应用前景，期
望为从事相关研究的学者提供参考。
关键词：胚胎干细胞；诱导；雄性生殖细胞
中图分类号：Q813 文献标志码：A
Research progress on differentiation of embryonic
stem cells into male germ cells
SUN Min, SHI Qing-Qing, LI Bi-Chun*
(Key Laboratory of Animal Breeding Reproduction and Molecular Design of Jiangsu Province, College of
Animal Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China)
Abstract: Embryonic stem cells (ESCs) have the potential ability of unlimited differentiation and self-renewal.
ESCs can differentiate into germ cells in theory. At present, a successful report has been shown that human or
mouse ESCs could be induced into mature sperm in vitro. This study aims to systematically describe the endogenous
and exogenous factors inducing ESCs differnentiate into male germ cells, meanwhile, the inducing method was
summarized combing with the latest research progress home and abroad. In addition, the applying prospect of
inducing ESCs into male germ cell was analyzed too in order to provide the evaluable information for the scholars
engaged in related research.
Key words: embryonic stem cells; differentiation; male germ cell
收稿日期：2011-06-25； 修回日期：2011-08-26
基金项目：国家自然科学基金项目 (30871791)；
江苏省高校自然科学重大基础研究项目 ( 0 8 K J A
2 3 0 0 0 1 )；高等学校博士学科点专项科研基金
(20103250110006)；2010年江苏省研究生培养科研创
新计划项目；“六大人才高峰”资助项目
*通信作者：E-mail: yubcli@yzu.edu.cn; Tel: 0514-
87997207
胚胎干细胞 (embryonic stem cells, ES细胞 )是
早期胚胎 (原肠胚期之前 )中分离出来的，具有无
限增殖的潜能和发育全能性的一类细胞。ES细胞的
全能性是指 ES细胞在解除分化抑制的条件下具有
分化为包括生殖腺在内的各种组织的发育潜力，可
以为细胞的遗传操作和细胞分化研究提供丰富的实
验材料。2003年，Hubner首次报道了体外诱导 ES
分化为卵母细胞；同年报道了鼠 ES细胞体外诱导
分化为雄性配子，随后 ES细胞诱导分化为生殖细
胞的研究进一步开展。此方面的研究有助于阐明生
殖细胞发生和配子生成过程，对揭示男性不育的病
因和治疗有重要意义。本文结合近几年 ES体外诱
导分化为雄性生殖细胞的研究报道，系统阐述 ES
细胞与雄性生殖细胞间基因表达差异、诱导分化方
法及应用前景，为从事相关研究的学者提供参考。
1　ES细胞和SSCs细胞简介
ES细胞的形态结构与早期胚胎细胞具有相似
生命科学 第24卷38
性，具有二倍体核型，胞体相对比较小，核明显，
有一个或多个核仁，细胞紧密堆积在一起，细胞间
无明显界限，呈鸟巢状集落生长。1981年，Evans
和Kaufman[1]首次成功地分离出了小鼠胚胎干细胞。
随后，人们分别建立了猪 (piedrahita)、牛 (satio)、
绵羊 (piedrahita)、山羊 (meineeke-tillmann)、水貂
(sukoyan)、兔 (qraves)[2-3]及鸡 (pain[4], park[5])等动
物的胚胎干细胞或类胚胎干细胞系。
精原干细胞 (spermatogonial stem cells，SSCs)
是雄性生殖细胞的母细胞，位于曲精细管基膜上。
它一方面可以自我更新生成新的成体干细胞以维持
自身数量的恒定，同时又能在自身基因或外来信号
的调节下增殖分化成各阶段的精原细胞直至精子，
是雄性成体干细胞中唯一与下一代遗传背景密切相
关的细胞 [6]。精原干细胞体积较大，核为圆形或椭
圆形，核内有 2~3个核仁，细胞聚团生长，细胞间
边缘清晰，结构紧密，集落形似葡萄串状。体内自
然状态下，内细胞团 (ICM)分化为原始生殖细胞
(primal germ cells, PGCs)后，PGCs迁移到达生殖嵴。
雄性 PGCs进入有丝分裂休止期，仍保持增殖潜能；
而雌性 PGCs则开始减数分裂形成卵原细胞后进入
减数分裂前期 I，而后进入休止期。出生后性成熟时，
雄性生殖细胞恢复有丝分裂，形成精原干细胞，进
一步通过减数分裂形成成熟精子；卵原细胞恢复减
数分裂波，产生成熟卵子。一般认为 ES细胞的增
殖分化受到内源性因素和外源性因素的共同调节。
内源性因素即不同基因在不同时间和空间的开启和
关闭，涉及到各种转录因子的作用。外源性因素是
指细胞间的相互作用及细胞外物质的介导作用。
2　ES细胞诱导分化为生殖细胞的研究进展
目前 ES细胞向生殖细胞分化的研究已取得一
定进展，主要集中在人、鼠中。这些研究表明了体
外途径获得生殖细胞的可能性。
2003年，Hübner等 [7]构建了 Oct4启动子的
GFP表达载体，将其转入 ES细胞中，将 ES细胞
体外诱导分化为卵母细胞，首次证实了 ES细胞可
以在体外分化为生殖细胞。同年，Toyooka等 [8]将
含 lacZ的 ES细胞和表达 BMP4基因的 M15细胞
共培养，并将诱导后的阳性与生殖细胞共培养后移
入受体睾丸。结果表明，鼠 ES细胞可以体外诱导
分化为雄性配子。
2004年，Geijsen 等 [9]将鼠 ES细胞诱导成胚
胎生殖细胞，并发育为成熟单倍体配子，将其注射
入正常卵母细胞完成受精后，观察到胚泡的形成。
Clark等 [10]将人类 ES细胞诱导分化为生殖细胞，
并阐述了生殖细胞和成熟配子的特异表达基因。
2006年， Nayernia等 [11]将 Stra8基因启动子转
染入小鼠 ES细胞中，经过视黄酸诱导后，获得雄
性配子，并通过受精获得了后代。
2007年，Kerkis等 [12]利用维甲酸 (RA)诱导
ES细胞最终获得单倍体精子及卵子，将获得的精
子和卵子共培养能形成 2个原核结构，最终发育为
桑葚胚样结构。这表明 ES诱导得到的单倍体精子
具有受精能力。
2009年， Yu等 [13]将 Dazl基因转入小鼠 ES细
胞中，在没有 LIF的 DMEM/F12培养基中培养获
得游动的精子和卵子。他们分析是 Dazl的过量表
达抑制了 Nanog的表达，促使 ES细胞向生殖细胞
方向分化。
2010年， Yamano等 [14]通过体外诱导鼠 ES细
胞分化研究了 Akt活性在中胚层的诱导作用。研究
表明，Akt信号可以促进球体 (位于 ES和 PGCs中
间状态 )的自我更新，保持其分化状态。
综上所述，ES诱导分化为雄性生殖细胞的方
法主要有以下几种。(1)改变细胞的培养条件，即
向培养基中添加生长因子、化学诱导剂等；将 ES
细胞与其他细胞一起进行培养；将细胞接种在适当
的底物上。通过改变培养条件，促使 ES细胞中的
特定基因表达的变化，进而引发细胞向特定方向变
化。(2)导入外源性基因，即将特定发育阶段中起
决定作用的基因导入 ES细胞的基因组中从而将 ES
细胞准确地分化为特定类型的细胞。(3)体内诱导，
即将 ES细胞移植到动物体内的不同部位，在不同
的微环境中促使 ES细胞向特定细胞分化。
3　影响ES细胞分化为雄性生殖细胞的内源性
因素
在 ES细胞诱导分化为 SSCs细胞的过程中内
源性因素主要包括：Nanog、Oct-4、Sox2、GDF3、
Stella、Fragilis、Dazl、Stra8、SCP3、VASA、
integrin β1、integrin α6、c-kit等。
Nanog属于 ANTP超家族 NK2型基因，在维
持干细胞未分化状态中表现全能性。最早在桑葚胚
阶段检测到 Nanog mRNA的表达，到早期囊胚后，
Nanog表达于内细胞团，在滋养外胚层没有表达。
胚胎附植后，Nanog出现在上胚体区域表达，进入
原条期后表达量开始迅速降低。Nanog在未分化的
孙　敏，等：胚胎干细胞诱导分化为雄性生殖细胞的研究进展第1期 39
ES细胞中高表达，而敲除 Nanog的 ES细胞将向原
始内胚层分化 [15-16]。在鼠 ES细胞的体外培养体系
中，Nanog能够使 ES细胞不依赖 LIF-Stat3途径而
维持去多能性的存在。过表达 Nanog的鼠 ES细胞
在没有 LIF的培养条件下经长时间培养后，仍能够
具有很强的自我复制能力。
Oct-4 (又称 pou5f1)属于 POU家族，通过结
合八碱基的保守序列“AGTCAAAT”(oxtamer motif)
来激活或者抑制下游基因的表达。Oct4是第一个被
发现只在多能细胞中表达的转录因子，也是控制
ES细胞多能性的主要因子。它在囊胚阶段表达于
内细胞群，而滋养外胚层和原始内胚层中 Oct4基
因表达水平下调。随着胚胎发育的成熟，Oct4在各
种成熟组织中都失去表达，而在具有多能性或全能
性的生殖细胞中还维持一定量的表达。Oct4的表达
直接决定着细胞多能性的有无，敲除 Oct4基因的
小鼠 ES细胞失去自我增殖能力，有分化为内胚层
和滋养层的潜力 [17-18]。当 Oct4过量表达时，ES细
胞向原始内胚层方向分化 [19]。Morrison 和 Brickman[20]
发现，非洲蟾蜍在缺失 Oct4时胎儿易早产，进一
步说明 Oct4在抑制干细胞向内胚层和外胚层的分
化时起作用。
Sox2是 SOX (SRY-related HMG box)基因家族
的一员，SOX基因家族编码结构高度保守、功能与
性别决定基因相关的转录因子。Sox2在胚胎发育早
期表达，常作为 Oct4的辅助转录因子与其调控动
物早期胚胎发育中一些重要基因的表达，对于外胚
层的维持和发育是必需的 [21]，是早期胚胎多能性谱
系细胞和胚胎外胚层具有多能发育潜能的一个标志
物。外源性表达的 Sox2、Oct4、nanog对 ES细胞
转录具有关键性调控作用，可认为是保持 ES细胞
多潜能性和自我更新的中心调控因子。
GDF3 (growth differentiation factor 3)，即生长
分化因子 3，属于转化生长因子 (TGF-β)家族，它
是分泌型蛋白，可进行旁分泌或自分泌而发挥功能。
Chen等 [22]在植入前期和植入后早期的小鼠胚胎中
发现了 GDF3的表达，与前脏内胚层的形成有关。
Levine和 Brivanlou [23]发现 GDF3在小鼠的早期胚
胎发生中表达，GDF3与小鼠的 ES细胞分化有关，
在人类的多能干细胞中，GDF3是细胞保持多能性
的标记。刘湘华 [24]研究表明，GDF3有可能对中枢
神经系统的形成有着重要的功能。
Stella和 Fragilis基因是 PGCs和减数分裂前生
殖细胞的特异基因，在体内 ICM和早期外胚层细
胞中没有表达。Stella编码高度分歧性蛋白，随 ES
细胞分化而表达下调 [25]。Fragilis是一种跨膜蛋白，
也是一种干扰素诱导蛋白，能促进生殖细胞形成和
同型 PGCs聚集。它编码干扰素诱导性跨膜蛋白，
在 BMP4刺激后的上胚层细胞中表达，与胚外外胚
层诱导生殖细胞特化密切相关 [26]。Fragilis在 PGCs
前体的表达可能参与了细胞间的诱导与应答。
Dazl是 DAZ基因家族 (DAZ、BOULE、Dazl)
中的重要一员，在进化上高度保守，是生殖细胞形
成所必需的调控因子。Dazl在生殖细胞发育早期开
始表达，是减数分裂启动的内因，在配子生成的减
数分裂过程中持续存在，对精子发生有重要作用。
Kito等 [27]研究表明，在鸡胚胎生殖嵴和未发育的
睾丸中发现 Dazl蛋白的表达。小鼠 Dazl基因的丢
失会导致 A型精原细胞向 A1型精原细胞的发育停
滞，而敲除 Dazl的小鼠导入人类 Dazl基因后可产
生大量的早期生殖细胞。Dazl基因突变或表达缺乏
可导致减数分裂障碍、雄性不育 [28-29]。
Stra8 (stimulated by retinoic acid gene 8)是哺乳
动物生殖细胞由有丝分裂转变为减数分裂前特异表
达基因 [30]，仅在雄性发育期性腺和成年精子发生
过程减数分裂前的生殖细胞中表达，是雄性生殖细
胞特有的基因，所以在胚胎期 Stra8是否表达及其
表达时间可决定 PGCs发育成为雄性还是雌性生殖
细胞。Stra8基因表达受视黄酸 (retinoic acid，RA)
的调节，是减数分裂启动的外因，生殖细胞在表达
Dazl后就能对 RA起反应引起 Stra8表达而启动减
数分裂。米美玲等 [31]报道，局部较高视黄酸浓度
可诱发 Stra8的表达，胞质 Stra8蛋白增加导致生殖
细胞进入减数分裂前期。
SCP3是联会复合体轴侧成分的一部分，在染
色质环黏附位置，其表达对于第一次减数分裂的启
动具有重要作用，该蛋白是检测哺乳动物发生减数
分裂转变的高度特异性标志 [32]。郭睿等 [33]通过免
疫组织化学法和免疫荧光 FITC/DAP1共染技术得
出结论：SCP3蛋白在雄性小鼠减数分裂各阶段精
母细胞核内的表达与 SC的形成、成熟、解体同步，
参与了同源染色体之间的联会和重组。
VASA是生殖细胞特异的三磷酸腺苷 (ATP)依
赖的 RNA解旋酶，是迁移后期 PGCs的重要标志，
在卵巢和睾丸组织中表达，是生殖细胞的高度特异
性标志。Vasa的同源基因Mvh的表达由生殖嵴的
体细胞诱导产生，Mvh蛋白在雄性和雌性的生殖细
胞发生过程中发挥作用 [8]。
生命科学 第24卷40
Integrin β1和 integrin α6是 SSCs表面层黏连
蛋白受体，是生精上皮基膜处构成细胞外基质的重
要原件。1999年，Shinohara等 [34]通过特异性 α6、
β1整合素抗体和免疫磁珠分选系统技术证实 α6、
β1整合素可作为小鼠SSCs表面标志物。李彦锋等 [35]
通过免疫组化方法对成人及胎儿睾丸 SSCs特异性
表达进行筛选和鉴定。结果表明，α6整合素在生精
小管生殖细胞表面存在较广泛而显著地阳性表达，
β1整合素主要在生精小管基底部细胞存在显著阳性
染色，两者可作为阳性标志用于人 SSCs的分选。
Lee等 [36]研究表明，integrin β1和 integrin α6的沉
默对于鼠 ES细胞保持未分化状态具有重要作用。
当 integrin β1和 integrin α6被激活后，ES细胞开始
分化且分化的方向也受其控制。
c-kit是由原癌基因Wlocus编码的酪氨酸激酶
受体，其配体为干细胞因子 (SCF)。c-kit与其配体
SCF特异性结合，对 PGCs和 SSCs生存、分化具
有重要作用 [37]。c-kit受体在 A1~4型精原细胞中为
高水平表达，在 In型、B型及早期的前细线期精母
细胞中为低水平表达，在后期的精母细胞及精子细
胞中不表达。因此，常把 c-kit受体作为 A型精原
干细胞的标记物。
4　影响ES细胞分化为雄性生殖细胞的外源性
因素
外源性因素是指细胞间的相互作用及细胞外物
质的介导作用，包括细胞外基质和细胞培养过程中
添加的影响因子。
细胞间的相互作用主要来源于其微环境，又称
为小生境 (niches)，由稳定的组织解剖学部位构成。
同时，也是一种相互作用的结构单位，调节发育组
织或器官的自我增殖或分化 [38-39]。Qing等 [40]将鼠
ES细胞形成 EB后与卵巢颗粒层细胞共培养获得卵
母样细胞。米美玲等 [41]通过骨髓间充质干细胞
(BMSCs)与支持细胞共培养可促使 BMSCs向表达
Stra8和 c-kit的雄性生殖细胞方向分化。Tomoike
通过与未分化的生殖嵴细胞共培养和添加生殖嵴提
取液诱导 ES细胞向生殖细胞分化，诱导 10 d后，
Mvh、Dazl基因表达量增加，证明生殖嵴细胞分泌
的生长因子有利于 ES向 PGCs的分化。
小生境内除细胞外，非细胞成分亦具有重要作
用，主要是细胞外基质 (extracellular matrix，ECM)，
它们被分泌并储存在细胞所在的组织网络中，为细
胞黏附提供支架，并通过整合素受体向干细胞传递
细胞外信号，从而调节干细胞增殖、迁移和分化发
育 [42-44]。
ECM主要包括层黏蛋白 (laminin，LN)、纤维
连接蛋白 (fibronectin，FN)、胶原蛋白 (collagens，
Col)、玻连蛋白 (vitronectin，Vn)和血小板反应蛋
白 (thrombospondin，Tsp)等多种糖蛋白、蛋白多糖
和胶原。
在睾丸的曲细精管中，有两种细胞可产生
ECM，它们是曲细精管内的支持细胞 (sertoli cell，
SC)和固有层内的管周肌样细胞 (peritubular myoid
cell，PC)。SC和 PC在产生和形成 ECM时相互作用。
一般认为，SC 产生Ⅳ型胶原、 LN、 entactin 和蛋白
多糖 (包括硫酸乙酰肝素 HS和硫酸软骨素 ) ; PC
合成 FN、Ⅰ型、Ⅳ型胶原和蛋白多糖 (包括硫酸
软骨素 , 但不含 HS)[45]。
小生境中与干细胞分化有关的主要是 LN、FN
和 Col。ES细胞在体内特定小生境中发育，其内各
种基质蛋白与其他细胞相互作用影响 ES细胞向生
殖细胞分化。Zhou等 [46]研究表明，饲养在胶原基
质胶上的胚胎干细胞可形成 EB，它具有分化成三
胚层能力，加入维生素 C可诱导分化为心肌细胞。
郭新等 [47]研究表明，细胞层黏蛋白与 integrin β1
和 integrin α6的相互作用对于诱导人 ES细胞分化
为神经细胞有重要作用。Ma 等 [48]将鼠 EB接种到
LN、FN、COL和人工基底膜 (matrigel)包被的培
养皿中培养，结果显示层黏蛋白和纤维连接蛋白可
以促进 mES来源的 EBs向 PGCs分化过程中减数
分裂的启动，推测基质蛋白受体 -整合素受体是介
导干细胞与细胞外基质黏附的最主要分子。
除细胞外基质外，一些激素也能诱导 ES细胞
的分化。性激素在生殖细胞发育中可促使细胞进入
减数分裂前阶段。Kee等 [49]将化学药物和维生素
混合，成功诱导干细胞变成了精子和卵子。 在培养
小鼠 ES细胞产生卵原细胞的过程中，观察到 12 d
可检测到 E2，而在人 ES细胞诱导为精子过程中有
双氢睾酮的产生 [7,50]。
5　体外诱导ES细胞分化为生殖细胞的应用前景
人类胚胎生殖细胞的研究受到资金及材料的限
制，不容易进行。而 ES细胞易于进行遗传改造，
且已获得其细胞系。因此，体外诱导 ES细胞分化
为生殖细胞的研究为人类生殖细胞的定位及发育研
究提供了新的方法，且易在分子水平上进行遗传改
造。对于鼠和人的生殖细胞系的体外长期培养已经
孙　敏，等：胚胎干细胞诱导分化为雄性生殖细胞的研究进展第1期 41
有报道，但这些研究只能提供一个特定细胞的静态
图片，而不能准确的揭示生殖细胞的形成过程。对
于体外 ES细胞成功诱导为生殖细胞及成熟配子的
研究，可以解释生殖细胞的形成过程并利用其进行
科学及临床治疗上的研究。
在生殖细胞的诱导方面除了关注各种分子信号
水平的变化外，还需要研究生殖细胞小生境的形成
及其对生殖细胞发育的影响。精子的形成需要支持
细胞的支持，卵子的发育则需要滋养层和颗粒细胞
提供生长环境。体外 ES细胞诱导分化成功获得精
子和卵子样细胞的研究有利于研究 ES细胞分化过
程中支持小生境的发育，也有助于了解配子发育过
程中小生境是否是必需的。生殖细胞小生境的识别
或者是从 ES细胞分化过程中增加其形成方法都可
以帮助人们了解生殖细胞的发育过程。
从 ES细胞获得具有功能的精子或卵子更具有
代表意义。获得成熟的卵子过程需要注意避免孤雌
生殖的可能，从而使获得的卵子可以进行人工受精
或者进行核移植。如果获得的卵母细胞可以进行供
体核的程序性重排，并成功发育到胚泡期，则此方
法可以充分利用患者自身的 ES细胞系进行核移植，
实现细胞治疗。而获得成熟的精子的过程可以使人
们了解精子发生过程，为男性不育提供新的治疗方
法。
基于 ES细胞往雄性生殖细胞方向诱导分化的
广阔应用前景，本实验室拟以家鸡作为实验模型，
诱导鸡胚 ES分化为 SSCs，进一步发育为成熟精子。
相对于人的 ES细胞，使用鸡胚 ES细胞可以克服
伦理方面的限制，且取材方便，模拟临床治疗实验
具有十分明显优势。本实验室已确立了明确区分鸡
胚 ES细胞和 SSCs的标记基因及蛋白，下一步将
结合基因转染法、因子诱导法及共培养方法，探索
适宜的诱导体系，期望为后来的研究者或临床需要
提供有价值的参考。
[参　考　文　献]
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