全 文 ：生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
第 20卷 第 4期
2008年 8月
Vol. 20, No. 4
Aug., 2008
线粒体呼吸链膜蛋白复合体的结构
孙　飞1*，周强军1，孙　吉1，翟宇佳1，饶子和2
（1中国科学院生物物理研究所生物大分子国家重点实验室，北京 100101；
2清华大学“清华－南开－生物物理所”结构生物联合实验室，北京 100086）
摘　要：线粒体作为真核细胞的重要“能量工厂”，是细胞进行呼吸作用的场所，呼吸作用包括柠
檬酸循环和氧化磷酸化两个过程，其中氧化磷酸化过程的电子传递链(又称线粒体呼吸链)位于线粒体内
膜上，由四个相对分子质量很大的跨膜蛋白复合体(I、II、III、和 IV)、介于 I/II 与 III之间的泛醌以
及介于 III 与 IV之间的细胞色素 c共同组成。线粒体呼吸链的功能是进行生物氧化，并与称之为复合
物 V的 ATP合成酶(磷酸化过程)相偶联，共同完成氧化磷酸化过程，并生产能量分子 ATP。线粒体呼
吸链的结构生物学研究对于彻底了解电子传递和能量转化的机理是至关重要的，本文分别论述线粒体呼
吸链复合体 I、I I、I I I 和 IV 的结构，并跟踪线粒体呼吸链超复合体的结构研究进展。
关键词：线粒体呼吸链膜蛋白复合体；结构生物学；N A D H 泛醌氧化还原酶；琥珀酸泛醌氧化还原
酶；细胞色素 c 还原酶；细胞色素 c 氧化酶
中图分类号：Q244；Q518.3　　文献标识码：A
Structure of mitochondrial respiratory membrane protein complexes
SUN Fei1*, ZHOU Qiang-jun1, SUN Ji1, ZHAI Yu-jia1, RAO Zi-he2
(1 National Laboratory of Biomacromolecules, Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences,
Beijing 100101, China; 2 Tsinghua-Nankai-IBP Joint Research Group for Structural Biology,
Tsinghua University, Beijing 100086, China)
Abstract: As the important “energy factory” of eukaryotic cells, mitochondrion is the place for cellular
respiration that includes citric acid cycle and oxidative phosphorylation process (OXPHOS). The OXPHOS
electron transfer chain (mitochondrial respiration chain) is located on the inner membrane of mitochondrion and
comprising of four large trans-membrane protein complexes (mitochondrial respiratory Complex I, II, III and IV)
as well as ubiquinone between Complex I/II and III and cytochrome c between Complex III and IV. The function
of mitochondrial respiration chain is biological oxidation which is coupled with phosphorylation by ATP syn-
thesis enzyme (ATPase, called Complex V) and then complete OXPHOS producing energy molecule ATP.
Structural researches on those membrane protein complexes in mitochondrial respiration chain are very impor-
tant for understanding the mechanisms of electron transfer and energy transformation. Here we reviewed the
structural studies of mitochondrial respiratory complexes respectively as well as the structural research progresses
on their respiratory supra complexes.
Key words: mitochondrial respiratory complexes; structural biology; NADH: ubiquinone oxidoreductase;
succinate:ubiquinone oxidoreductase; cytochrome c reductase; cytochrome c oxidase
文章编号 ：1004-0374(2008)04-0566-13
收稿日期：2008-07-01
基金项目：“973”计划(2006CB806506)
*通讯作者：E-mail：feisun@ibp.ac.cn
567第4期 孙　飞，等：线粒体呼吸链膜蛋白复合体的结构
线粒体作为细胞器，是真核细胞活动的主要供
能单位，一般分布在功能旺盛区域的组织细胞内，
像心肌细胞、肾脏细胞、肝脏细胞和肠表皮细胞等
大量耗能细胞中，线粒体的含量非常高。线粒体是
细胞发生呼吸作用的主要场所，包括柠檬酸循环和
氧化磷酸化两个过程。柠檬酸循环又称为三羧酸循
环或 Krebs循环，位于线粒体基质(matrix)中，该
循环将细胞质中糖酵解产物乙酰辅酶A进一步进行
氧化分解变成 CO2，氧化分解能被用来生成 ATP、
NADH和 FADH2(位于琥珀酸脱氢酶上) ；而NADH
和FADH2上的电子则通过线粒体氧化电子传递链传
递给氧分子并生产水分子，最终实现生物氧化，而
电子传递的过程伴随着质子从基质到线粒体膜间隙
(mitochondrial inter-membrane space, IMS)的转移从
而形成线粒体内膜两侧的质子电化学势梯度，质子在
该梯度的作用下通过线粒体内膜上的 ATP合成酶
(ATPase)回到基质，所释放的能量用来驱动ATPase合
成三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)，至此
完成整个氧化磷酸化过程。柠檬酸循环、电子传
递、质子泵流和ADP磷酸化(即ATP合成)等过程彼此
偶合成为一个整体，高效地完成线粒体的呼吸作用。
线粒体氧化磷酸化的电子传递链，又叫线粒体
呼吸链，位于线粒体内膜上，由四个分子量很大的
跨膜蛋白复合体(线粒体呼吸链膜蛋白复合体 I、
II、III、和 IV)、介于 I/II 与 III之间的泛醌以及
介于 III 与 IV之间的细胞色素 c共同组成(图 1)。
在电子传递过程中，存在一系列电子传递载体
(prosthetic group)，包括 NAD+(NADH)、FMN
(FMNH2)、醌 ubiquinone/ Q(氢醌 ubiquinoil/QH2)、
FAD(FADH2)、血红素(heme a、heme a3、heme b、
heme c、heme c1)[注：括号外为氧化态形式，括
号内为还原态形式]和铁硫中心(iron-sulfur center，
FeS)、金属铜离子 Cu等。其中铁硫中心有三种形
式：二铁二硫([2Fe-2S])、四铁四硫([4Fe-4S])、三
铁四硫([3Fe-4S])。它们具有不同的氧化还原电位
(不同的蛋白内部环境会对这些电位产生影响)，这
决定了电子在它们之间传递的方向。此外，量子力
学的隧道效应计算表明，只要电子传递载体电子云
团的边距小于 14Å，电子在它们之间的传递是可以
直接高效发生的，并不需要额外的蛋白质残基的参
与[1]。这些电子传递载体大部分位于线粒体呼吸链
膜蛋白复合体的内部，担负着电子传递中转的作用
(图 2 )。
线粒体呼吸链膜蛋白复合体 I即 NADH 脱氢
酶，含有一个 FMN和至少六个铁硫蛋白，相对分
子质量接近 1M，其作用是催化NADH的 2个电子
传递至辅酶 Q，同时将 4 个质子由线粒体基质
(negative侧)转移至膜间隙(positive侧)。电子传递的
方向为：NADH → FMN → FeS → Q，总的反应结
果为：NADH+H++4H+(N)+Q → NAD++QH2+4H+(P)
线粒体呼吸链膜蛋白复合体Ⅱ即琥珀酸脱氢
酶，含有一个 FAD，一个铁硫蛋白和一个血红素 b
(cyt. b556)，其作用是催化电子从琥珀酸(succinate)
转至辅酶Q，但不转移质子。电子传递的方向为：
图1　线粒体呼吸链组成模式
图中复合物 II-IV的形状大小均根据三维晶体结构得出，而复合物 I只是一个示意图。实线箭头代表电子传递过程，虚线箭
头代表质子跨膜过程，复合物 II通过与三羧酸循环偶联与复合物 I、复合物 III和复合物 IV构成整个呼吸链系统。UQ: 泛
醌Q; cyt. c: 表示细胞色素 c; succinate: 琥珀酸; fumarate: 延胡索酸。
568 生命科学 第20卷
succinate → FAD→ FeS→ Q，总的反应结果为：
succinate+Q → fumarate(延胡索酸)+ QH2
线粒体呼吸链膜蛋白复合体Ⅲ即细胞色素c(cyt.
c)还原酶，包含两个血红素 b(b562、b566)、一个
血红素 c1和一个铁硫蛋白。其作用是催化电子从辅
酶 Q传给细胞色素 c，每转移一对电子，同时将 4
个质子由线粒体基质泵至膜间隙。总的反应结果
为：2cyt.c (氧化态) + QH2+2H+(N) → 2cyt.c (还原
态)+Q+4 H+(P)
线粒体呼吸链膜蛋白复合体Ⅳ即细胞色素 c氧
化酶，包含两个血红素(a1、a3)、一个铜离子(CuB)
和一个双核铜离子(CuA)中心，而血红素 a3和CuB形
成双核 Fe-Cu中心(a3-CuB)，其结构与[2Fe-2S]相
似。其作用是将从细胞色素 c接受的电子传给氧分
子，每转移一对电子，在基质侧消耗 2个质子，同
时将 2个质子从基质中泵至膜间隙中。电子传递的
路线为：cyt c→ CuA→ heme a1→ a3-CuB→ O2，
总的反应结果为：4cyt.c (还原态)+8 H+(N)+O2 → 4cyt.c
(氧化态)+4 H+(P)+2H2O
在线粒体呼吸链的电子传递过程中，电子的化
学位能被复合体 I、III、IV 所利用，将基质中的
质子泵到膜间隙中，从而将能量储存在线粒体内膜
两侧的质子电化学势梯度中，最后质子通过ATPase
回到基质中，其电化学势能被用来合成ATP分子。
当然，并非所有的质子都被ATPase所利用，有一
部分质子通过所谓的解偶联蛋白(uncoupling protein,
UCP)从膜间隙回到基质中，其释放的电化学势能以
热量形式耗散，因此UCP的存在打破了线粒体呼吸
链的紧密偶合。
线粒体呼吸链作为一个具有完整功能的电子传
递和质子泵系统，担负着为细胞各种生理活动提供
能源的功能，其上的膜蛋白复合体又被称为线粒体
呼吸链分子机器，它们相互作用、相互协调、相
互反馈，共同完成能量的转换和能源分子的生产。
最终阐述这些呼吸链分子机器的电子传递机制和跨
膜质子泵的工作原理有待于它们三维精细结构的解
析。下面分别讲述了线粒体呼吸链膜蛋白复合体
I、II、III和 IV的三维结构研究，以及在结构分析
的基础上对电子传递和质子转移机制的研究和解释。
其中，完整的复合体 I的结构目前还停留在低分辨
率的冷冻电镜三维结构上，而 II、III和 IV已经有
了高分辨率的X射线晶体结构。此外，本文还就近
年来关于线粒体呼吸链膜蛋白超复合体(I－ III2、I
－ III2－ IV、III2－ IV2等)的结构研究做了综述。最
后，本文还就解偶联蛋白 UCP进行了介绍。
1　线粒体呼吸链复合体 I(Complex I)——NADH
泛醌氧化还原酶
线粒体呼吸链膜蛋白复合体 I(简称线粒体复合
体 I，EC1.6.5.3)，又称 NADH 泛醌氧化还原酶
(dihydronicotinamide adenine dinucleotide-ubiquinone
oxidoreductase)，也称作NADH脱氢酶，是线粒体
呼吸链电子传递系统的主要入口，是呼吸链四个膜
蛋白复合体中最为复杂，相对分子质量最大，包含
的亚基最多的一个复合体。哺乳动物线粒体复合体
I由 45条不同亚基组成[2,3]，含有 1个黄素单核苷酸
(flavin-mononucleotide, FMN)和 8个铁硫中心，相对
分子质量接近 1M。其中疏水部分的 7个亚基ND1
－ND6和ND4L由线粒体基因编码[4,5]，其他亚基由
核基因组编码。在原核生物能量代谢的电子传递链
中，也存在与线粒体复合体 I功能类似的蛋白复合
体，被称为细菌复合体 I(NDH-1)，该复合体只有
13~14个亚基，相对分子质量约 550k，这些亚基
均能在线粒体复合体 I中找到相应的同源物[6]，并且
都含有相应的电子传递载体[7]，电子传递和质子转
运都在这些进化上保守的亚基中进行，因此细菌复
合体 I是NADH泛醌氧化还原酶的最小版本。经过
电镜观察，线粒体和细菌复合体 I都具有典型的 L
形结构(图 3A)，疏水的下臂嵌在膜中，亲水的上
臂突出在线粒体基质或细菌胞质中[8-10]，细菌复合
图2　电子传递载体的种类和结构
569第4期 孙　飞，等：线粒体呼吸链膜蛋白复合体的结构
体 I中的 13/14个亚基有 3个亚基(peripheral part)位
于亲水的头部，7个亚基(trans-membrane part)分布
在细胞膜内，另外的 3/4个亚基(connection part)连
接前面两个部分；线粒体复合体 I除了以上三个部
分亚基外，其他亚基被称为“附属亚基”
(accessory subunits)。
目前人们对线粒体复合体I或细菌复合体I结构
的认识主要来自电子显微镜的结果。Leonard等[11]
从粗糙脉孢霉Neurospora crassa 线粒体中提取出线
粒体复合体 I并得到二维晶体，通过负染后进行电
子衍射得到复合体 I的投影结构图 ；随后该研究组
完成了该二维晶体的负染三维重构，发现复合体 I
呈现 L形结构[12] ；1997年，该研究组进一步修正
并得到了复合体 I的结构模型，分辨率 35Å[13] ；1998
年，他们完成了大肠杆菌复合体 I的电镜负染三维
重构，分辨率 34Å，发现与粗糙脉孢霉复合体 I形
状类似，也是 L 形，通过这两个结构，发现线粒
体复合体I的附属亚基主要位于亲水部和疏水跨膜部
的连接区域[10] ；同一年，Grigorieff从牛心肌中提
取并纯化了线粒体复合体 I，然后分别做了负染电
镜和冷冻电镜，通过三维重构技术获得了牛心线粒
体复合物 I的 22Å分辨率结构，清楚地表明了线粒
体复合物 I 的“L”字外形[8 ]，与其他模型相比，
牛心线粒体复合物I在亲水臂和疏水部分的连接处非
常窄。至此，人们对线粒体复合体 I的结构外形有
了一个明确的认识——L形。
进一步的结构研究表明，线粒体复合体 I具有多
变的构像。2002年，Friedrich领导的研究组报道称
L形结构只是一种由去污剂造成的失活状态，真正具
有活性的大肠杆菌复合体 I是马蹄形的结构[14]。然而
一年后，Sanzonov等[15]马上提出马蹄形结构可能只
是提取纯化过程造成的假象。2006年，Radermacher
等[16]收集了大量的酵母 Yarrowia lipolytica线粒体复
合体 I的负染单颗粒电镜图像，利用最新的图像处
理分析方法，进行了大量的计算，最终重构出较高
分辨率的线粒体复合体 I三维结构，但最终能得到
的最佳分辨率也只有 16.5Å，离原子分辨率还相差
很远，他们指出分辨率难以提高的原因来自复合体
I的构象多变性。2007年，Baranova等[17]得到大肠杆
菌NDH-1膜内疏水性部分的二维晶体，结合负染投
图3　线粒体复合体 I的结构
A： 复合物 I结构示意图：分为亲水头部(peripheral part)、连接部分(connection part)和跨膜部分(trans-membrane part)；外
围绿色部分表示线粒体复合物 I的其他部分“附属亚基”(accessory subunits)；
B：极端嗜热细菌 Thermus thermophilus复合物 I亲水部分的晶体结构图；
C：电子传递体空间分布图，图中数字表示距离(单位 Å)；
D：能量偶联模型示意图：I为辅酶 Q 循环机制；II为直接偶联机制，X 为质子载体；III为间接偶联机制，通过 X 氧化
还原电势变化导致膜亚基构象变化从而转运质子；IV 为混合机制，即认为同时存在辅酶 Q 循环和间接偶联机制。
570 生命科学 第20卷
影和冷冻电镜而得到NDH-1膜亚基部分 8Å的投影
图，确认了膜亚基的分布并推测辅酶Q的一个可能结
合位点。Radermacher等和Baranova等的结果是目前
利用电镜获得的复合体 I 三维结构中分辨率最高的。
关于复合物 I第一个高分辨率的结果于 2005年
在 Science上发表，Hinchliffe 和 Sazanov获得的极
端嗜热细菌 Thermus thermophilus复合物 I亲水部分
的晶体结构，并给出了 9 个铁硫中心的坐标(图
3C)，这一点与以往认为复合物I有8个铁硫中心的认
识不同[18] ；2006年他们在 Science上公布了分辨率
达 3.3Å的三维精细结构[19](图3B)。根据生理条件下
电子传递的最大距离 14Å和各氧化还原中心之间的
距离，可以推测出电子传递的主要通路为NADH →
FMN → N3 → N1b → N4 → N5 → N6a → N6b→ N2
→ Q(N代表铁硫中心)，Nqo3中的N7距离其他铁
硫中心太远而不能有效地参与到这条电子传递链
中，这点与之前关于(线粒体)复合体 I含有 8个铁硫
中心的认识是完全不同的，此外N1a与 FMN之间
进行电子传递被认为起到抗氧化，抑制活性氧产生
的作用 [ 20 ]。
由于没有完整的线粒体复合体 I的三维精细结
构，线粒体复合物I能量转换机制——电子传递与质
子转移的偶联——还很不清楚；根据线粒体呼吸链
其他复合体的结构功能研究，并结合复合物 I的特
性，人们提出了多种线粒体复合物 I的能量偶联机
制模型(图 3D)，主要分为三类：(1)辅酶 Q循环机
制，这是基于线粒体呼吸链复合体 III的偶联机制提
出来的，辅酶Q起着一个可移动的质子 /电子载体的
作用，通过改变氧化还原状态形成一个复杂的循环
从而完成质子转运的功能[21] ；(2)直接偶联机制，这
是根据线粒体呼吸链复合体 IV的一个偶联模型提出
来的，质子或是通过与 FMN和铁硫中心N2结合[22]
或是通过结合辅酶Q来完成转运过程[23,24] ；(3)间接
偶联机制，这是通过蛋白质复合物构象的变化来偶
联电子传递和质子转运这两个过程，这与F-型ATP
合成酶[25]、Ca2+-ATP酶[26]的构象变化机制类似。
2　线粒体呼吸链复合体 II(Complex II)——琥珀酸
泛醌氧化还原酶
线粒体呼吸链复合体 II(简称线粒体复合体 II，
EC1.3.5.1)又称为琥珀酸泛醌氧化还原酶(succinate :
ubiquinone oxidoreductase，SQR)， 也叫线粒体琥珀
酸脱氢酶，它催化三羧酸循环中琥珀酸(succinate)到
延胡索酸 (fumarate)的氧化，同时，琥珀酸的氧化
与线粒体内膜中辅酶Q的还原通过电子传递所偶合，
电子通过一系列包埋在该复合体中的电子传递体
FAD、[2Fe-2S]、[4Fe-4S]、[3Fe-4S]以及血红素(heme
b)来完成了从琥珀酸到辅酶Q的传递。线粒体呼吸
链复合体II属于琥珀酸泛醌氧化还原酶家族(SQR家
族)，这个家族中的酶通常包含一个水溶性的具有
催化活性的异二聚体(hetero-dimmer)以及一个完整的
跨膜部分。水溶性异二聚体由亚基 A 和亚基 B 组
成，即黄素蛋白(flavoprotein, FP)和铁硫蛋白(Iron-
Sulfur binding protein, IP)。其中，黄素蛋白内含
一个共价结合的FAD辅因子，而铁硫蛋白内含三个
铁硫中心——[2Fe-2S]、[4Fe-4S]和[3Fe-4S] ；跨膜
部分将整个复合物锚定在线粒体内膜上，这个部分
通常由一个或两个疏水的穿膜蛋白组成，有的含有
血红素，有的没有[27]。根据跨膜部分组成蛋白的数
目以及包含血红素的数目，这个家族的酶可以分成
A— E五类；线粒体复合物 II属于 C类型，包含
图4　线粒体复合体II的结构
A: 线粒体复合物 II结构示意图：由黄素蛋白 FP、铁硫蛋
白 IP、大的细胞色素结合蛋白CybL和小的细胞色素结合蛋
白CybS四个亚基组成；其中，黄素蛋白内含一个共价结合
的 FAD辅因子，而铁硫蛋白内含三个铁硫中心——[2Fe-2S]
[4Fe-4S]和[3Fe-4S] ；黄素蛋白 FP 中有琥珀酸结合位点
(FAD附近)，辅酶Q结合位点其中一个位于 CybS顶部，问
号所代表的另一个结合位点是否存在；
B: 猪心线粒体复合物 II三维结构图；
C: 电子传递体空间分布图，图中数字表示距离(单位Å)。
571第4期 孙　飞，等：线粒体呼吸链膜蛋白复合体的结构
一个血红素分子和两条穿膜蛋白[28]。如图 4A所示，
线粒体呼吸链复合体 II由四个亚基组成，依次为黄
素蛋白 FP、铁硫蛋白 IP、大的细胞色素结合蛋白
CybL和小的细胞色素结合蛋白 CybS，总的相对分
子质量大约在 125k左右。
关于SQR的结构研究最先在一些原核生物中取
得了一些进展。Iverson等[29]于 1999年解析大肠杆菌
QFR(这里叫 eQFR，含有四个亚基，不包括血红
素，属于D类型)的3.3Å结构 ；同年11月，Lancaster
等[30]解析了Wolinella succinogenes 中QFR(这里叫
wQFR，含有三个亚基，两个血红素，属于B类型)
的 2.2Å结构 ；2003年，Iwata领导的小组获得了大肠
杆菌SQR的 2.6Å晶体结构[31]。在线粒体复合体 II的
结构解析以前，人们只能用这些原核生物SQR的结
构作为模型来研究线粒体复合体 II，这包括线粒体
复合体 II 的泛醌结合位点、泛醌还原机制、泛醌
在线粒体复合体 II、III之间的转移等问题。但线
粒体复合体 II和原核SQR的跨膜部分其序列同源性
低于 20％，结构差别会较大，另外 2-噻吩甲酰三
氟丙酮 (TTFA)和 5,6-二氢 -2-甲基 -N-苯基 -1,4-氧
硫杂环己烯 -3-甲酰胺(萎锈灵，carboxanilide)等化
合物能很强地抑制线粒体复合体 II的醌还原活性却
对相应的原核复合体表现出弱的抑制能力[32,33]，这
些现象表明线粒体复合体 II具有与原核复合体 II不
同的精细结构。
2005年，由饶子和院士领导的“清华大学－
生物物理所”结构生物学联合研究小组历时三年以
猪心为原材料从中提取线粒体复合体 II，首次解析
了该膜蛋白复合体2.4Å的晶体结构(图4B)以及其与
抑制剂 3-硝基丙酸盐(3-NPA)、TTFA相结合的 3.
5Å结构 [34,35]，通过结构分析确认线粒体复合体 II是
一个穿膜蛋白复合体，而线粒体复合体 II与大肠杆
菌SQR的结构比较证明电子传递体的氧化还原电位
是受其周围的氨基酸环境调制的，比较也说明了用
大肠杆菌SQR结构作为线粒体复合体 II模型的局限
性，此外，该项研究还利用线粒体复合体 II的结构
对已知的与该复合体异常突变相关的人类疾病
(pheochromocytoma、head-and-neck paraganglioma等)
进行了结构上的解释，发现那些突变导致了电子在
该复合体内的传递中断并引起线粒体活性氧的产
生。同年，Berry研究组报道了鸡心线粒体复合体
II的结晶[36]，并解析了该复合体的 2.1Å晶体结构，
通过结构研究和质谱数据发现3-NPA是线粒体复合
体 II的自杀性抑制剂，该化合物与线粒体复合体 II
结合后与黄素蛋白活性位点上的精氨基形成共价
键，永久地抑制了琥珀酸的结合，而在猪心线粒体
复合体 II与 3-NPA 结合的结构中没有发现这一点，
原因在于后者的分辨率(3.5Å)比较低[37]。
关于复合体 II的结构功能研究主要集中在琥珀
酸氧化 /延胡索酸还原的分子机制、醌的结合位点
变化以及醌还原 / 氧化的分子机制上。2 0 0 0 年，
Lancaster等[38]在wQFR结构的基础上，解析了突变
体wQFR-E66Q的 3.1Å结构，活性数据和结构分析
表明跨膜亚基第66位的谷氨酸是醌的结合位点 ；之
后他们于2001年报道了wQFR在另外一种晶型的3.
1Å结构，发现黄素蛋白的 capping结构域在两种晶
型中有构像变化，结合对黄素蛋白 301位精氨酸的
突变体活性研究，他们提出了QFR的延胡索酸还原
分子机制[39] 。2002年，Iverson等[40]研究了已知的
两种醌抑制剂与 eQFR结合的结构，指明 eQFR在
靠近胞质端存在活性的醌结合位点，而且C亚基 29
位的谷氨酸对于醌的结合和反应是必要的。2006
年，Iwata研究组通过抑制剂Atpenin A5与大肠杆
菌 SQR的复合体结构，结合动力学模拟，认为醌
与细菌复合体 II的两种结合模式，并提出了醌还原
的一种机制[41]。而Huang等则在鸡心线粒体复合体
II高分辨率的结构基础上，仔细研究了琥珀酸的结
合位点。关于线粒体复合体 II存在 1个还是 2个醌
结合位点，结论并不一致：徐建兴[42]通过研究 2-
TTFA抑制线粒体复合体II酶活的动力学曲线认为存
在 2个醌结合位点 ；饶子和研究组在解析了猪心线
粒体复合体 II与 TTFA相结合的 3.5Å结构后发现
TTFA分别结合在靠近线粒体基质一端和靠近线粒体
膜间隙一端，表明存在 2个醌结合位点[34]，但由于
该结构分辨率较低，可信性需要验证；Berry研究
组在研究鸡心线粒体复合体 II与 TTFA的复合体结
构时没有发现靠近线粒体膜间隙一端有 TTFA的结
合 [ 3 7 ]。
根据生物化学研究和线粒体复合体 II的三维结
构，其催化琥珀酸氧化和醌还原的反应和电子传递
过程如下：
Succinate + FAD → Fumarate + FADH2
2 NFADH FAD 2H 2
- e+→ + +
− →→−→→e heme)](4S-Fe3[]4SFe4[]Fe2S2[2
−→ e2
572 生命科学 第20卷
N 22 Q 2H QH
-e ++ + →
其中， NH+ 是指线粒体基质一侧的质子。从电
子传递体的空间分布位置来看(图4C)，Q处在 [3Fe-
4S]与 heme之间，而且与[3Fe-4S]的距离更近，电
子可以直接从[3Fe-4S]传递到Q，而不经过 heme，
这就提出了线粒体复合体II中的血红素heme在电子
传递过程中的作用是什么的问题。要回答这个问
题，仅从结构分析入手是不够的，还需要结合酶活
分析和电子顺磁共振(EPR)等研究方法。此外，从
上面的氧化还原反应和电子传递过程来看，线粒体
内膜两侧在反应前后的质子浓度没有发生变化，因
此线粒体复合体 II没有质子转移的功能。但是，如
果线粒体复合体 II 真有两个具有活性的醌结合位
点，那么上面的电子传递过程就必需修改，而且还
可以猜测线粒体复合体 II会具有质子泵的功能。
3　线粒体呼吸链复合体 III(Complex III)——细胞
色素 c还原酶
线粒体呼吸链膜蛋白复合体Ⅲ(简称线粒体复合体
III, EC1.10.2.2)，也叫细胞色素 c还原酶(cytochrome
c reductase)或 bc1 复合体，位于线粒体呼吸电子传
递链的中点，由线粒体复合体 I和线粒体复合体 II
所还原的醌在这里被线粒体复合体 III所氧化，其电
子被用来还原处在线粒体膜间隙内的细胞色素 c，
在每传递一个电子的同时，从线粒体基质中获取一
个质子，并向线粒体膜间隙中释放两个质子。线粒
体复合体 III是一个多亚基的膜蛋白复合体，包括11
个多肽链，总相对分子质量约 240k，在生理状态
下以二体形式存在，每个复合体 III核心包含一个细
胞色素 b(含两个血红素 b562/bH和 b566/bL)、一个细
胞色素 c1(含一个血红素 c1)和一个铁硫蛋白(Rieske
iron sulfur protein, ISP，含一个[2Fe2S])，这三个
核心蛋白亚基负责完成电子的传递、醌的氧化和细
胞色素 c的还原(图 5A, 拓扑结构)。
1997年，Xia等[43]基于 2.9Å的衍射数据，解
析了牛心线粒体复合体 III的部分结构 ；1998年，
Zhang等[44]分别解析了鸡心、牛心和兔心的线粒体
复合体 III的 3.0Å晶体结构，包括存在抑制剂时的
结构，在这些结构中发现 ISP外部结构域有两种位
置，一个位置靠近醌结合位点，另一个位置靠近细
胞色素 c1，由此提出了电子传递是通过 ISP外部结
构域运动所介导的 ；同年七月，Iwata等报告了牛
心线粒体复合体 III的 11个亚单位的完整 2.8Å晶体
结构(图 5B)，电子传递核心区域的电子密度可以清
楚看到，在不同晶型中发现铁硫蛋白有不同的构
象，而且发现了不同于 Zhang等所提出的两种构象
的第三种构象，并认为该构象是 ISP在细胞色素 b
亚基和细胞色素 c1亚基之间运动的中间构象，从而
进一步解释了电子传递的机制。此外在该完整的晶
体结构中，清楚地看到了第 9个亚基(铁硫蛋白前导
肽、Fe-S presequence)和第 11个亚基，而且发现亚
基 9结合在亚基 2上，从而证明了线粒体复合体 III
亚基1和亚基2与线粒体蛋白MPP (mitochondrial pro-
cessing peptidase，线粒体信号前导肽酶)在进化上
的联系[45,46]。2000年，Hunte等[47]利用抗体介导结
晶的方法解析了酵母线粒体复合体III的2.3Å晶体结
构，在醌的还原位点发现了天然结合的醌分子
Q6，他们在高分辨率结构的基础上仔细研究了磷脂
分子与线粒体复合体 III的相互作用，发现心磷脂对
于线粒体复合体 III的功能是重要的[48]。
线粒体复合物Ⅲ的结构解析使得其内部的电子
传递过程有了一个非常清晰的图像(图 5C)。复合体
III有两个醌的功能结合位点：一个是氧化位点Qo
图5　线粒体复合体III的结构
A: 线粒体复合物 III核心结构示意图：每个复合体 III核心包
含一个细胞色素 b(含两个血红素 b562/bH和 b566/bL)、一个
细胞色素 c1(含一个血红素 c1)和一个铁硫蛋白。
B: 牛心线粒体复合物 III(PDB code：1BE3)的 11个亚基的完
整三维结构图；
C: 电子传递体空间分布图(PDB code：1BE3)，图中数字表
示距离(单位Å)，在该结构中，ISP处于中间构象，[2Fe2S]
的位置离血红素 bL和 c1都比较远。
573第4期 孙　飞，等：线粒体呼吸链膜蛋白复合体的结构
位于膜间隙一侧，靠近血红素 bL；一个还原位点Qi
位于基质一侧。电子传递过程描述如下：
-
O 2 P
-
-
P
-
L H i
Q site: QH QH H e
e [2Fe2S](ISP) (movement of
ISP) cyt. c1 cyt. c
QH Q H e
e cyt. b (b ) cyt. b (b ) Q

+
+
→ ⋅ + +
→ →
→ →
⋅ → + +
→ → →
-
i N 2
site
Q site : Q(QH ) e H QH (QH )+⋅ + + → ⋅
可以看出，在氧化位点Qo每次只有一个电子
从氢醌传递给了细胞色素 c，另外一个电子被用来
还原Qi位点的醌；细胞色素 c每获得一个电子，就
有两个质子从内膜进入膜间隙，一个质子从基质中
进入内膜，从而形成了内膜两侧的质子浓度梯度—
—线粒体呼吸链复合体III的质子转移与电子传递的
偶合是直接通过 Q的脱氢和加氢来完成的。
在线粒体复合体 III的结构得到解析之后，与
抑制剂的相互作用结构研究是了解该复合体功能的
重要方式。Xia研究组在 2002－2003年进一步完成
了牛心线粒体复合体 III与底物、抑制剂的结构，讨
论了铁硫蛋白的结构运动，研究了Q循环时氧化位
点Qo和还原位点Qi的结构特点[49,50]，进一步他们
根据 8个与抑制剂结合的结构发现铁硫蛋白在不同
的位置时，细胞色素 b有明显的构象变化，由此提
出了电子传递驱动的构象变化调制了铁硫蛋白的运
动[51]。Hunte研究组发现酵母线粒体复合体 III的氧
化位点Qo能够与抑制剂 5-n-heptyl-6-hydroxy -4,7-
dioxobenzothiazole结合，指出了氧化位点Qo在催
化反应中的构象变化[52]。Berry研究组基于高分辨
率的结构研究了线粒体复合体III的特异抑制剂抗菌
素 A的抑制分子机理[53]。
2002年Langet和Hunte解答了电子是如何从线
粒体复合体 III传递到细胞色素 c的问题，他们通过
抗体介导结晶技术得到了酵母线粒体复合体III与细
胞色素 c的超复合体 2.97Å晶体结构[54]，发现细胞
色素 c主要通过非极性力与复合体 III相互作用，这
种相互作用让细胞色素 c与 c1足够靠近，实现了电
子在两个血红素辅基之间的直接快速传递，而且他
们还发现细胞色素 c只与二聚化的复合物 III中的一
个单体相互作用。
4　线粒体呼吸链复合体 IV(Complex IV)——细胞
色素 c氧化酶
线粒体呼吸链膜蛋白复合体Ⅳ(简称线粒体复合
体 IV，EC1.9.3.1)，也叫细胞色素 c氧化酶，位
于线粒体呼吸电子传递链的终点，来自线粒体复合
体 I、II和 III的电子经过细胞色素 c在这里最终传
递给氧分子，每传递 1个电子的同时，将 1个质子
从线粒体基质转移到线粒体膜间隙，并消耗掉基质
中的 1个质子。线粒体复合体 IV是一个多亚基的膜
蛋白复合体，由 13条多肽链组成，总相对分子质
量约 210k，每个复合体包含两个血红素(heme a1、
heme a3)、一个铜离子(CuB)和一个双核铜离子
(CuA)中心，其中 heme a1、heme a3和 CuB位于
亚基 SU1中，并且 heme a3和 CuB形成双核 Fe-Cu
中心(a3-CuB)，其结构与[2Fe-2S]相似；另外，双
核铜离子中心CuA位于亚基SU2中。亚基SU3中没
有包含电子传递体，它与亚基 SU1和 SU2相互作
用，维持电子传递中心的稳定性。SU1、SU2 和
SU3构成了线粒体复合体 IV的核心结构，负责完成
电子的传递、细胞色素 c的氧化和氧分子的还原(图
图6　线粒体复合体IV的结构
A: 复合物 IV核心结构示意图：三个亚基一共包含两个血红
素(heme a1、heme a3)，一个铜离子(CuB)和一个双核铜离
子(Cu A)中心，细胞色素 C 和氧分子的结合位置由箭头标
识 ；
B: 牛心线粒体复合物 IV的三维结构图；
C: 电子传递体空间分布图，图中数字表示距离(单位Å)。
574 生命科学 第20卷
6A, 拓扑结构)。
线粒体复合体 IV属于醌 /细胞色素 c氧化酶家
族，这个家族中的蛋白大多都是线粒体内膜或细菌
内膜上的电子传递末端氧化酶，它们的功能都是将
醌或细胞色素 c上的电子传递给氧分子，在电子传
递的过程偶合着质子的膜内外转移，它们具有类似
的核心亚基结构，电子传递过程在原核和真核之间
也是保守的。因此，关于细胞色素 c氧化酶的结构
研究分别在原核和真核生物中进行了展开。
1995年，Iwata等[55]利用抗体介导结晶的方法
解析了脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)的细胞色
素 c氧化酶的 2.8Å晶体结构，分别描述了构成该复
合体的四个亚基 SU1、SU2、SU3和 SU4的三维结
构，并给出了这四个亚基的空间组装形式，确定了
电子传递体 CuA、heme a1、heme a3和 CuB的空
间位置。Hartmut Michel研究组随后又利用抗体介
导结晶的方法解析了该复合体亚基SU1与SU2形成
的 2.7Å核心结构，在该结构中新发现了 1个Mg2+
(或Mn2+)结合位点和 1个Ca2+结合位点[56]。2002年，
Iwata研究组解析了球形红细菌的细胞色素 c氧化酶
及其突变体(亚基 I的286位谷氨酸突变为谷氨酰胺)
的 2.3Å/2.8Å(晶体衍射各向异性)晶体结构，与脱氮
副球菌的细胞色素 c氧化酶结构非常相似，发现286
位谷氨酸的质子/脱质子化是该复合体质子转移功能
的一部分。
1995年，Tsukihara等首次获得了牛心线粒体
复合体 IV晶体的高分辨率数据，通过电子密度图，
CuA、heme a1(Fe)、heme a3(Fe)和 CuB的金属中
心被精确测定，此外，在 CuA附近还发现一个Mg
离子，在远离CuB的线粒体基质端还发现了一个Zn
离子[57]，一年后他们基于这套数据报道了牛心线粒
体复合体 IV的完整13个亚基的晶体结构(图6B)，在
该晶体结构中，线粒体复合体 IV以二体形式存在，
一共形成 28个跨膜螺旋，其中 12个螺旋以赝三次
对称(四个一组)排列构成核心亚基 SU1－ heme a 和
heme a3－ CuB的分别被包裹在一个螺旋中，亚基
SU2的2个跨膜螺旋与结合heme a3－CuB的一组SU1
螺旋相互左右，亚基 S U 2 的亲水结构域包含了
CuA；此外，亚基 SU3的 7个跨膜螺旋与 SU1的
第 3组螺旋相互作用。线粒体复合体 IV的其他亚基
都是一些分子量比较小的蛋白，分布在 SU1、SU2
和 SU3的周围，起到稳定复合体结构的功能[58]。线
粒体复合体 IV的亚基 SU1、SU2和 SU3由线粒体
DNA所编码，在序列、结构和功能上与细菌细胞
色素 c氧化酶的三个亚基相同，这也反应了细胞色
素 c 氧化酶在进化上的保守性。
在线粒体复合体 IV的三维结构基础上，其内
部的电子传递路线一目了然(图 6C)，具体过程描述
如下为：
A
3
3
-
2
IMS side: cyt.c (red.) cyt. c (ox.) e
e Cu-Cu (Cu ) heme a heme
a site
heme a site: e [Fe-Cu] center Fe -O-O-Cu
[Fe-Cu] O (coupled pr
−
−
−
→ +
→ → →
→ →
⇒ •
-
2 N 2
N P
oton
translocation)
[Fe-Cu] O H [Fe-Cu] O H
coupled proton translocation: H H
+
+ +
• + → •
→
其中在[Fe-Cu]中心的氧分子需要接受 4个电子
才能完全被还原然后离开[Fe-Cu]中心，每传递 1个
电子到[Fe-Cu]中心，就会有 1个质子从基质中被转
移到膜间隙中，同时消耗掉 1个基质中的质子，关
于[Fe-Cu]中心的氧分子被还原的具体化学键变化机
制牵涉到了氧分子与该中心的配位随着 Fe/Cu氧化
还原状态变化的响应[59,60]。可以看出，在线粒体复
合体 IV中至少需要存在两条质子通道，一条使得线
粒体基质中的质子能够到达[Fe-Cu]中心，与氧分子
结合，另外一条通道使得质子能够从基质中转移到
膜间隙中。关于这样的质子通道，在细菌细胞色素
c氧化酶和线粒体复合体 IV的三维结构的基础上，
根据电子密度图中水分子的有序排列，人们发现所
谓的依赖于天冬氨酸的D通道(D-channel)，依赖于
赖氨酸的K通道(K-channel)[55,61]和依赖于组氨酸的H
通道(H-channel)[59]。
关于电子传递与质子转移的偶合机制存在几种不
同的观点。Iwata等[55]在脱氮副球菌细胞色素 c氧化
酶的结构研究中发现用于结合[Fe-Cu]中心的325位组
氨酸其侧链没有对应的电子密度，他们认为这是因
为该残基的多种构象造成的，由此提出了基于该组
氨酸的质子转移模型——直接偶合“组氨酸循环”。
另外一种观点认为的偶合方式是电子传递引起的构象
变化所介导的间接模式——1998年，Yoshikawa等[59]
分别解析了细胞色素 C氧化酶的氧化态、还原态、
叠氮化钠结合态、一氧化碳结合态的晶体结构，分
辨率分别为 2.3、2.35、2.9和 2.8Å，从结构分析
575第4期 孙　飞，等：线粒体呼吸链膜蛋白复合体的结构
指出了质子转移位点的关键氨基酸Asp51，他们于
2003年通过构建突变残体(Asp51Asn)并获得该突变体
1.8Å高分辨率结构，进一步证明了质子转移与电子
传递的偶合来自氧化还原反应引起的heme a附近区
域的构象变化，并证明构象变化位点Asp51的重要
性[62]。后来Harrenga等[63]测定了脱氮副球菌细胞色
素 c氧化酶在全氧化和全还原状态下的晶体结构，
并没有发现组氨酸 325有明显的构象变化，从而反
驳了 Iwa t a 等的“组氨酸循环”模型，同时他们
也没有观察到线粒体复合体 IV亚基SU1 Asp51附近
的构象变化，因此他们也排除了Yoshikawa等提出
的间接偶合模型，基于结构和电势计算，他们提出
了一种新的偶合机制——认为亚基SU1的Glu278和
两个血红素 heme a，a3的羧基团承担了质子转移的
功能[60]，这也是一种间接偶合的模式。
5　线粒体呼吸链超复合体(respiratory supramolecular
complexes)
线粒体呼吸链在发挥功能时，各个复合体只有
密切配合才能够高效地完成电子传递，仅仅依靠Q
在复合体 I/复合体 II和复合体 III的自由扩散或者cyt. c
在复合体III和复合体IV之间的自由扩散是无法实现
实验所观测到的快速反应，因此不难推测四个线粒
体复合体之间存在着一定的相互作用。关于线粒体
呼吸链复合体的相互关系存在两种假说：流动模型
和固定模型；流动模型认为各个复合体在线粒体内
膜上自由扩散，随机碰撞，电子传递是热力学驱动
的；固定模型认为各个复合体相互之间存在作用形
成超复合体，电子在超复合体内完成动力学驱动的
快速传递；现在有很多证据支持固定模型——在纯
化线粒体复合体时经常出现复合体共纯化的现象，
将各个复合体以一定的比例混合后将出现最高的电
子传递活性，某个复合体的点突变将影响其他复合
体的稳定性，在 Blue-native电泳或蔗糖密度梯度离
心实验中能明显发现超复合体的存在[64]。电子显微
镜单颗粒图像分析技术对于超复合体的三维结构研
究是非常有力的工具，现在已经发现并获得了多种
超复合体的三维结构。
膜蛋白样品制备技术的发展使得我们能够获
取、分离和保存越来越大的膜蛋白超复合体，利用
穿孔素Digitonin处理线粒体膜并结合Blue-native电
泳、蔗糖密度梯度离心，有多种线粒体呼吸链超复
合体被纯化和鉴定出来，这包括从拟南芥(Arabidopsis
thaliana)线粒体中鉴定到的超复合体 I2-III4和 I-III2 [65,66]，
从牛心线粒体复合体中纯化和鉴定到的超复合体I-III2
和 I-III2-IV [67]，从酵母线粒体中纯化和鉴定到的超
复合体 III2-IV2 [68]。2007年，Schafer等[69]首次完
成了牛心线粒体呼吸链超复合体I-III2-IV的电镜负染
三维重构图(图 7)，通过与复合体 III和复合体 IV的
晶体结构，复合体 I 的电镜结构相互比较和拟合，
发现在该超复合体中，I与 III的醌结合位点彼此靠
近，III与 IV的细胞色素 c结构位点彼此靠近，这
说明醌 /细胞色素c在相应复合体间的传递是非常高
效快速的。
线粒体呼吸链超复合体的结构研究将进一步加
深我们对于线粒体呼吸链蛋白机器工作机制的了解。
6　线粒体呼吸链解偶联蛋白(mitochondrial uncoupling
proteins)
与线粒体呼吸链相关的还有一类重要的膜蛋白
——解偶联蛋白(uncoupling proteins, UCPs)。UCPs
位于线粒体的内膜上，它和ATP合成酶一样能够消
耗线粒体内膜两侧的质子电势差，但是它不产生
A T P，而是以热能的形式释放 [ 7 0 ]。U C P s 包含
UCP1、UCP2、UCP3、UCP4、UCP5等类似物。
图7　线粒体超复合体I-III2-IV的结构
牛心线粒体呼吸链超复合体 I-III2-IV 的电镜负染三维重构
图，上下图分别为两个侧面图；蓝色部分为线粒体复合物
I亲水头部，进而延伸至红色尾部为复合物 I跨膜部分，复
合物 III2和复合物 IV结合在跨膜部分上，其中复合物 III以
二聚体形式存在。
576 生命科学 第20卷
关于UCPS蛋白的功能研究，本刊同期的另一
篇文章对此进行了详细的论述“线粒体解偶联蛋白
UCP2的研究进展”，周辉，张旭家，这里不再做
赘述。
UCPs的大量功能研究使得人们认识到其结构的
特别性，希望通过结构研究来彻底了解其质子转移
的机理。 系列分析和结构模拟表明，UCPs结构与
线粒体ATP/ADP 转运蛋白类似[71]。生化研究认为
UCPs的基本结构模型如图 8所示[70,72]——发挥功能
时为同源二聚体，每个单体为一个六次跨膜蛋白，
每个蛋白含有三个类似的重复，每个重复为二次跨
膜结构。
目前还没有关于UCPs的结构研究报道，该项
研究将有重要意义：(1)深入了解其质子转移机理；
(2)UCP2的过量表达与 II型糖尿病相关，开发其抑
制剂可能是Ⅱ型糖尿病治疗途径之一；(3 )UCP2/
UCP3与 ROS相关，其结构研究将有助于我们对线
粒体 ROS调控的认识。
[参　考　文　献]
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端和 C 端都在线粒体的内外膜间隙中。
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