全 文 ：生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
第 20卷 第 4期
2008年 8月
Vol. 20, No. 4
Aug., 2008
文章编号 ：1004-0374(2008)04-0519-09
收稿日期：2008-07-21
基金项目：“973”计划(2007CB507400) ；国家自科学基金(30470837，30270638)
*通讯作者：E-mail: ssliu811@yahoo.com; liuss@ioz.ac.cn
线粒体呼吸链与活性氧
刘树森
（中国科学院动物研究所生物膜与膜生物工程国家重点实验室，北京 100101）
摘　要：已知有氧真核生物细胞吸收的氧分子绝大部分都是在线粒体呼吸链末端细胞色素氧化酶上通过
四步单电子还原生成水。但同时也有 1%－ 2% 的氧可在呼吸链中途接受单电子或双电子被部分还原生
成超氧(O2－·)和过氧化氢(H2O2)作为呼吸作用的正常代谢产物。此种来源于线粒体呼吸链的 O2－·和 H2O2 不
但在多种病理的氧化损伤中起关键作用，同样它们也是正常生理条件下对多种细胞过程具有基本调控意
义的氧还信号。基于Chance实验室约自 20世纪 70到 90年代的早期研究贡献以及 20世纪 90年代后其他
各实验室的研究新进展，我们聚焦于下述四个相关问题的评述和讨论：(1)由于线粒体内膜面积及其含有
的呼吸链复合体酶活力远远高出细胞中所有膜系数量和相关酶活力之总和，因而线粒体呼吸链产生的O2－·和
H2O2构成生物体内最大数量ROS的恒定来源；(2)线粒体呼吸链复合体 III的Q循环中QO位点中半醌自由
基(UQH·)已明确是 O2－·的单电子来源；还原细胞色素 C-P66SHC是生成H2O2的双电子供体。虽然复合体 I
也是产生线粒体基质内 O2－·的主要来源，但由于其确切生成位点尚未明确，在 in vivo条件下能否产生
大量O2－·也尚有争议；(3)线粒体呼吸链产生O2－·后的分配和跨膜转移涉及其生理病理作用机制和作用靶点
等复杂而重要的问题，直到目前尚未意见一致。“质子和 O 2－·循环双回路解偶联模型”整合了目前提出
的几种假说的联系点，指出H+和O2－·相互作用生成HO2·及其跨膜很可能是这一复杂问题的中心环节, 并
与 O2－·对“脂肪酸 shuttling model”或 O2－·对“UCPS激活”模型形成了内在的联系；(4)线粒体呼吸形
成的 ∆P(∆ψ和 ∆pH) 能直接控制呼吸链的ROS生成，并以非线性(非欧姆)相关方式通过影响Q循环中的
QO半醌的氧还态和寿命来调节 O2－·生成的急速变化，这一发现目前已获多家实验室的证实，业已成为线
粒体学界的广泛共识。这样，线粒体呼吸生成的 ∆P，除了在 ATP合成和离子跨膜转运的经典的生物
能量转换中介功能之外，又具有了调控作为细胞氧还信号分子 ROS的新功能。线粒体也已不再单纯是
细胞的“动力站”，业已成为联结线粒体动态结构和功能变化与调节不同细胞事件的多细胞信号级联反
应的整合平台。
关键词：线粒体呼吸链；Q循环 Q0半醌自由基；ROS生成与 ∆P呈非线性相关；∆ψ 和 ∆pH对 ROS的
控制；ROS分配和跨膜；Cyt C-p66Shc氧还蛋白；质子驱动力新功能
中图分类号：Q493.8　　文献标识码：A
Mitochondrial respiratory chain and reactive oxygen species
LIU Shu-sen
(State Key Laboratory of Biomembrane & Membrane Biotechnology, Institute of Zoology,
Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101,China)
Abstract: It has been established that most oxygen consumed by aerobic eukaryotic cells is reduced to water
through 4 steps of single electron reduction by the terminal cytochrome c oxidase of mitochondrial respiratory
chain. Meanwhile, a small proportion (1%-2%) of consumed oxygen can also be reduced partially by one or two
electrons in the mid-pathway of respiratory chain to generate superoxide(O2－·) or hydrogen perioxide(H2O2) as
520 生命科学 第20卷
线粒体是真核生物细胞中特别重要的细胞器，
已有一个多世纪的研究历史[ 1]。在生命进化渊源
上，它来源于“内共生”的好氧古细菌，用自己
的遗传基因(mtDNA)编码线粒体氧化磷酸化酶复合
体的关键亚基以控制ATP合成；在为生命供能供热
的同时，还产生活性氧(ROS)作为细胞氧化还原电
势和 Redox信号的原发因子。ROS对氧化应激、细
胞凋亡、基因表达等重要细胞过程的调控有重要作
用，是生命科学和分子医学当前最活跃的前沿领域
之一[2]。由于线粒体的ATP合成和ROS生成两者的
动态平衡和消长调控对决定生物的生存、发育、衰
老、疾病和死亡有关键意义[3-5]。本文讨论的主要
问题是线粒体 ROS的产生、转移及其代谢调控等。
1　线粒体呼吸链是生物活性氧(ROS)最主要来源
线粒体呼吸产生的ROS主要是指O2的单电子还
原产物，超氧阴离子(O2－·)及其衍生的HO2·、H2O2、
OH·和单线态氧 1O2等。已知，生物体中有多种酶
系可将O2转变为O2－·。除线粒体外，尚包括质膜的
NADPH氧化酶和胞浆细胞色素P450氧还酶， Xan-
thine Oxidase以及其他细胞器中的酶系[6]。最新报
道线粒体内外膜间的氧还蛋白 p66SHc，通过氧化细
胞色素C来利用呼吸链的还原当量产生H2O2，是线
粒体呼吸链 ROS生成的新途径[7]。在线粒体中，除
内膜呼吸链酶系，也包括其外膜中的 cytochrome b5
normal metabolic products of oxygen during respiration. As the primary sources of ROS species derived from
mitochondrial respiratory chain, both O2－· and H2O2 have been shown to be more crucial not only in a variety of
harmful oxidative damage under pathological conditions, but also to be pivotal significant physiologically in
redox signaling for many cellullar events. On the basis of the research achievement from 1970s to 1990s contributed
mainly by Chance’s group and from 1990s to present by several other groups, the following four aspects of this
topic were mainly reviewed and discussed in this article, namely, (1) Mitochondrial respiratory chain derived O2－· and
H2O2 serve quantitatively as the most important source of ROS in living body, mainly due to the largest amount
of the inner mitochondrial membrane surface and of the enzymes activity of respiratory chain complexes among
cellular membrane and enzyme system; (2) O2－· generating sites in components of respiratory chain have been
determined to be ubisemiquinone at Qo site of Q cycle in complex III. Although complex I is another important
O2－· sources of respiratory chain, its precise site(s) has not been established yet. However, the electron sources
from respiratory chain to reduce Cyt c-p66shc system have been shown to make H2O2 directly without formation
of superoxide; (3) The mechanisms of O2－· partitioning and translocation across membranes from its generating sites
in mitochondria are still not elucidated and charctericized. Although several models have been hypothesized,
however, the descriptions for its mode of action are controversial. A very interesting “Uncoupling double-loop
of H+ and O2－· cycling model ” was postulated to combine and integrate different models concerning the mechanisms
of superoxide activation and translocation across mitochondrial membranes indicating the central role of HO2·
fromed from intereaction of both H+ and O2－· cycling in connection with “FFA shuttling model” and “UCPs activation
model”; (4) That ROS production by mitochondrial respiratory chain exhibited a non-linear dependence on ∆ψ
and was also controlled independently by both ∆ψ and ∆pH components of ∆P, was described for first time by
Liu and Huang in 1995-1997, and then experimentally re-confirmed by Skulachev’s group in 1997-1998 and by Brand
later in 2004. Presently, this finding of ∆P (∆ψ and ∆pH) for controlling and regulating mitochondrial ROS
generation in non-ohmic manner through affecting redox state and lifetime of ubisemiquinone at QO site of Q cycle
has been commonly recognized among mitochondrial scientists as novel function of ∆P in addition to its
traditional role in energy transduction for ATP synthesis. Therefore, it is emphasized that mitochondria, more
than just a powerhouse, are an integral part of multiple cell signaling cascades linking mitochondrial function
and dynamics to the regulation of diverse cellular events, including gene regulation, metabolism, development,
cell differentiation, senescence and cell death. Also, the theoretical basis of Mitchell’s Chemiosmotic theory
could be involved not only in energy transduction and ions translocation of energy tranducing membrane
system including mitochondria, as described originally by Mitchell(1961-66), but also spread to affect cellular
redox signaling through its controlling mechanism for mitochondrial ROS production.
Key words：mitochondrial respiratory chain; ubisemiquinone in Q0 site of Q cycle; non-ohmic dependence of
ROS generation on ∆P; control of ROS by ∆ψ and ∆pH; partition and across membranes of ROS; Cyt c-p66Shc redox
protein; novel function of ∆P
521第4期 刘树森：线粒体呼吸链与活性氧
reductase、monoamine oxidases、dihydroorotate
dehydrogenase等。 但所有这些酶活及ROS产生量都
远低于线粒体内膜呼吸链酶系。人体线粒体内膜面
积达 14 000m2，呼吸链酶复合体是其主要组份；一
成年人每天吸氧 400L，通过呼吸链将 O 2还原为
H2O。如果按 in vivo耗氧的 0.1%以呼吸链“电子
漏(electron leak)”的单电子还原生成 O2－·，则日产
量可达 400mL之巨，超出所有其他酶活性之总和[8]。
本文讨论线粒体 ROS 问题也以线粒体呼吸链为
中心。
2　线粒体呼吸链ROS的生成位点问题
生理条件下，生物吸收的O2主要在线粒体呼吸
链末端氧化酶(复合体 IV)的作用下还原成H2O。由
于O2在基态时的三重态构象，分子外层具两未成对
电子，因此O2还原为H2O是通过连续接受 4个单电
子的 4步还原来完成。线粒体的呼吸链电子传递全
程由电子传递链复合体 I、II、III 和 IV的共同作
用完成，泛醌(Q)在复合体 I和 III 或 II和 III之间，
细胞色素C在复合体III和 IV之间传递电子。Boveris
和 Chance (1973)首次报道，离体肝和心脏线粒体呼
吸产生O2－·量相当于耗氧的 1%－ 2%，从线粒体扩
散到细胞浆中的H2O2也是来源于O2－·的氧化，两者
呈化学计量关系。他们早期研究得到多数实验室的
支持[6,9,10]。近来，虽有报到，在生理条件下生物
体内线粒体ROS生成仅为耗氧的0.2%, 或者如Nohl
等坚持认为，线粒体复合体 I不是O2－·和H2O2有效
来源，而是复合体 III[11]。但从离体线粒体研究证
明，呼吸链复合体 I或 III中途的“电子漏”使氧
可直接接受单电子生成O2－· [5]。在呼吸链活性受阻、
机体应激、衰老或疾病造成线粒体呼吸链损伤时，
ROS生成量进一步增加和积聚，引起氧化损伤。在
线粒体基质中 O 2－·最易损伤线粒体顺乌头酸酶
(aconitase)的铁 -硫中心，并进而影响三羧酸循环，
或直接损伤线粒体 m t D N A。脑、肌、心、胰、
肝、肾等线粒体能量代谢旺盛的器官中ROS导致的
病变更为明显[5,9]。敲除线粒体内Mn2+-SOD基因的
小鼠出生后 10天内即死亡[12]，但敲除细胞浆中 Cu-
Ze2+-SOD基因的小鼠则安然无恙，从而提示线粒体
的内源O2－·等的毒害作用和抗氧化系统的重要生理
意义。
我们首先应关注的问题是线粒体呼吸链 O2－·产
生的主要部位及其分子机制。前期的研究主要以
Chance实验室为代表，他们从 1973年以来系列的
工作表明，线粒体 O2－·主要在复合体 I和复合体 III
中生成。实验结果提示线粒体O2－·单电子来源可能是
稳定的自由基或是单电子供体[9]。线粒体中有两个
单电子供体系统可产生 O2－·：
(1)还原醌 /半醌氧还对(UQ / UQH·)中的自氧化
中间体半醌(UQH·)，(如：UQH·+O2=UQ+H++ O2－·) ；
或是(2)NADH 脱氢酶辅酶的核黄素单核苷酸的还原
和氧化型对(FMNH2/FMN·)的 FMN·，(如：FMNH·
+ O2=FMN+H++O2－·)。
但在近年来对复合体 I 产生 O2－·的研究中，倾
向于认为UQH·是还原O2生成O2－·的单电子来源，相
似于复合体 III中QO部位的还原型半醌(UQH·)与O2
相互碰撞生成非酶促反应的O2－·。FMNH·的作用似
已被忽视 [13], 但也没完全排除其他来源(细胞色素 b)
的可能性[5 , 9]。
(一)复合体 I含 42-43亚基，1个带 FMN的黄
素蛋白和 6个 Fe-S氧还中心。电子供体是NADH，
受体是结合在复合体上的半醌。直到目前，复合体
I产生O2－· 的确切位点还不完全清楚，特别是在完整
线粒体或细胞的条件下，意见尚不一致[14]。分离酶
复合体或亚线粒体内膜颗粒的研究证明， ROS产生
可能在 Flavin和 Rotenone结合位点之间。也有认为
是复合体I 的Flavin或者是与之结合的半还原NAD*
自由基。但目前多数研究者倾向于认为是复合体 I
中的N1a或 N2a亚基的 Fe-S氧还中心。外源的泛
醌可促进复合体 I的ROS产生似也表明，这是O2和
Fe-S2+氧还中心之间的氧还 shuttle作用所致。虽然
复合体 I的ROS生成位点在Rotenone抑制位点之前
已为多数研究证明，但上述疑点仍存在[13]。再者
Rotenone对复合体 I产生 ROS的抑制与否，或者起
促进作用都有不同的报道[14]。
复合体 II本身未发现直接产生O2－·位点，但复
合体II的琥珀酸氧化的电子逆流使复合体I还原时生
成 ROS。电子流逆向传递(RET)是呼吸链一组电子
传递反应，电子从还原辅酶Q逆向流到NAD+(抵抗
呼吸链氧化还原电位)，而不经过细胞色素C流向复
合体 IV和分子氧。RET在热力学上不利，需要与
跨膜电位的能量利用相偶联。在此RET反应中辅酶
Q的还原是来自琥珀酸或α-甘油磷酸等FADH2-相关
底物的氧化。用抗霉素A(Antimycin A)处理能量紧
密偶联的亚线粒体颗粒，可证明电子从琥珀酸流向
外加的NAD+，并伴有大量H2O2的生成。因此NAD+
的还原和ROS生成两者都需要ATP水解生成高跨膜
522 生命科学 第20卷
电位的支持，也被解偶联剂所阻止。抑制复合体 I
Rotenone结合位点可制止 ROS产生，从而提示，
RET电子传递顺序是：还原辅酶 Q --> Rotenone-
结合位点 --> ROS-产生位点 --> 线粒体基质内的
NAD+。在完整线粒体中 RET支持的 ROS 产生也
可被 Rotenone抑制[14]。
(二)复合体 III(bc1复合体)含 9－ 10亚基，有
3个 Redox中心，即细胞色素 b566、b562和 细胞色
素c1 以及1个[2Fe-S]和2个分开的半醌结合位点(Qo
和 Qi)。UQH2是复合体 III的Q循环的电子供体，
细胞色素 C 是电子受体。研究表明，在 Q 循环电
子传递中，复合体III中Q0位点的半醌自由基(UQH·)
可能是O2的单电子供体， UQH·通过非酶促反应直
接将电子泄漏给O2生成O2－·。因为UQ / UQH·对的
氧还电位(-240mV)与O2/ O2－·对(-270至 -330 mV)的电
位接近，O2容易从UQH·接受一个电子生成超氧：
UQH·+O2=UQ+O2－· +H+ (反应1)
因此，O2－· 的生成反应速率应与O2和UQH·浓
度呈函数关系[15,16]
如：d[O2－· ]/dt=k[O2]·[UQH·] (反应 2)
完整线粒体氧化琥珀酸时生成还原型泛醌
(UQH2)。Q循环启动时，UQH2结合在复合体 III中
Q0位点上(Myxothiazol阻止结合)，其两步分叉的电
子传递反应是Q循环主要特征：第一步，UQH2电
子先传给Rieske蛋白的Fe-S中心(Stigmatellin阻止第
一步电子传递)，并释放 1个质子(H+)到线粒体内膜
外 C侧, 于是UQH2变成QO位点上的半醌(UQH·) ；
第二步，UQH·的电子传给复合体 III的氧化型细胞
色素 b566(Cyt bL)，同时释放 1个H+到线粒体内膜外
C侧，半醌(UQH·)变成完全氧化型醌(Q)。在正常
条件下，Q循环的第三步反应是电子从 Rieske蛋白
Fe-S中心(从第一步UQH2获得)传给细胞色素C1和细
胞色素 C；第四步是电子从还原型细胞色素 b556传
给氧化型细胞色素 b562(Cyt bh) ；第五步是电子从还
原型细胞色素b562传给氧化型醌(Q)[(Antimycin A)阻
止这一步电子传递]，同时从基质中获得 1个H+而
使Q还原为Qi位点上的半醌(UQH·) ；第六步电子
传递是Qi位点的UQH·从氧化底物获得一个电子，
同时又从线粒体M侧基质中获得1个H+而变为还原
型泛醌(UQH2) ；同时，已完成第三步电子传递的
Rieske蛋白的Fe-S中心又可重新再接受来自UQH2的
电子，从而启动新一轮的 Q 循环。这样，完成两
次Q循环的电子传递， 2个细胞色素 C被还原，线
粒体从基质M侧吸收 2H+，向线粒体外 C侧泵出
4H+，建立起跨膜的质子电化学梯度(∆P)。在Q循
环电子传递与质子转移相偶联而建立的高 ∆P导致
ROS的产生[10,17]，这可能是由于QO位点上的UQH·
不能迅速将电子传给细胞色素b566而易于电子泄漏产
生O2－· 所致[17-19]。但是，如果系统中加入Antimycin
A，从还原型细胞色素 b562到氧化型醌(Q)的电子传
递受阻，还原的细胞色素 b566也就无法接受QO位点
UQH·的电子。这样导致QO位点的UQH·积累而电
子泄漏给氧产生更多的O2－· 。在此条件下产生的O2－·
相当于不抑制时耗氧的 2% － 10 % [10,19]。直接用
myxothiazol或stigmatellin 抑制Q循环第一步UQH2的
氧化，立即可阻止O2－· 产生。但抑制其下游细胞色
素氧化酶(氰化物)，或除去细胞色素 C，使 Rieske
蛋白的Fe-S中心处于还原状态而抑制半醌(UQHo)产
生，因而也使 O2－· 不能产生[5,7,10]。
(三)呼吸链的细胞色素 C是外周蛋白，结合于
线粒体内膜外，从复合体 III的 C1接受电子传给复
合体 IV的 CuA位点。已证明，线粒体中细胞色素
C也可接受复合体 III产生O2－· 的单电子，使O2－· 氧
化为 O2，而自己被还原。还原型细胞色素 C可能
有不同的电子传递方向：(1)传给细胞色素氧化酶并
与其质子泵活性相联系生成 ∆P用于合成 ATP[20] ；
这样，氧化型细胞色素 C也具有清除O2－· 的抗氧化
功能[21] 。(2)传给 p66Shc蛋白产生H2O2。并释放至细
胞质中，从而启动细胞凋亡等信号通路[7]。这样，
细胞色素 C也有相反的促进氧化应激的作用。(3)如
果细胞色素 C离开线粒体内外膜间进入细胞浆，一
方面线粒体呼吸链的电子传递受阻而导致其电子传
递体的还原性增高，从而促进线粒体ROS的产生；
同时，细胞浆中的细胞色素 C与凋亡相关的蛋白作
用正是当前细胞凋亡研究中热点课题之一。
(四)复合体 IV电子传递的氧化还原反应中生成
的ROS中间产物都束缚于其蛋白分子表面而不是释
放到介质中[6]。但早有报道，用 ESR可测量出细胞
色素氧化酶将H2O2转化O2－· 。新近的研究证明，复
合体IV某些亚基的磷酸化位点可调控细胞色素氧化
酶的异位抑制活性(Allosteric ATP inhibition)，从而
影响呼吸链能量偶联，跨膜电位和ROS的产生问题
有关研究正在进展中值得关注[22,23]。
3　线粒体呼吸链 ROS的释放、分配和跨膜转移问
题
O2－· 等 ROS从线粒体呼吸链的生成位点释放到
线粒体基质M侧，或是线粒体内膜外 C侧或细胞
浆，是 ROS释放方向性(sideness)和分配(partition)
523第4期 刘树森：线粒体呼吸链与活性氧
问题。这既与ROS作用机制和生理病理靶向功能有
密切关系，也涉及各种 ROS的化学性质、氧还活
性以及是否和如何跨膜转移机制等机理问题。早期
用离体线粒体研究提示，线粒体产生的O2－· 70%－
80%流向基质，20%－ 30%扩散到线粒体内外膜和
细胞质[5]。在培养的细胞中 in situ 条件下，我们
用 DCDHF和 DHF也观察到线粒体在不同功能时
ROS在线粒体内或线粒体外的释放和分配[24]。虽然
Nohl(2004)持不同意见[11]，但目前多数实验报道仍
支持复合体I产生的O2－· 主要都进入线粒体基质(M侧)
的看法[25-29]。因为：(1)复合体 I的“L型手臂”上
许多与 O2－· 产生的相关位点都面向基质M侧水相，
O2－· 产生位点的氧还中心很容易与水中O2相互作用生
成O2－· ；(2)线粒体基质中的Aconitase在 in vivo条
件下特异性地易于被 O2－· 所抑制，也为鉴定 O2－· 释
向基质M侧提供了证明；(3)用完整线粒体、无外
膜的内膜体(mitoplast)和内膜外翻的内膜颗粒(SMP)
进行比较测定O2－· 的生成也证明其释放方向性和分
配。例如，从我们实验室用MCLA测定鲤鱼肝线
粒体和亚线粒体的呼吸链O2－· 的生成的比较中(图 1、
2) [29,30]，可以看出：复合体 I(图 1，2 中实线系列
—)产生的O2－· 基本上都释向基质(M侧)，这与上述
试验报道和 Lambert及 Brand (2004)[27]对复合体 I的
结论基本相同。 而复合体 III的O2－· 释向内膜两侧(图
1，2中虚线系列 ---)，也和 Muller等[26]对复合体
III报道的结果基本相似。但两个复合体产生O2·都
有明显介质 pH的依赖性，其意义将在下面O2·跨膜
机制中进一步论述。
(一)复合体 I的O2－· 释向线粒体基质后的命运、
作用方式和跨膜转移等已有若干研究。O2－· 是阴离
子自由基，本身不能跨膜。在基质中，虽能对
Aconitase Fe-S中心和mtDNA氧化损伤，但也易被
浓度高好多倍的 Mn-SOD歧化生成H2O2。后者能跨
膜并释放到胞浆中，发挥多种功能的氧还信号分子
作用。H2O2也能在基质或胞浆中被GSH-Px 或Cata-
lase分解为O2和H2O。但O2－· 在基质中与H+相互作
用生成HO2·的比例很小，因为正常呼吸中线粒体基
质内较碱性(pH ≈7.5－8.0), O2·质子化形成HO2·的
份额约 0.1%，但HO2·能进入膜中引起多不饱和脂
肪酸的特异性过氧化作用产生热量[10]。目前比较流
行的一种看法是认为 O2－· 在基质大量存在时，如在
应激情况下，在基质侧可激活内膜中的解偶联蛋白
(UCPs)导致质子跨膜转移和线粒体解偶联，从而降
低 ROS生成[27,28]。但尚未获更多实验室的证实和支
持，需进一步研究[31]。Nedergaard(2003)提出，如
果 Brand的“O2－· 激活 UCPs”模型和HO2·跨膜的
“Q循环 H+循环 ROS循环共转运”模型[10]以及和
Skulachev/Garlid/Jezek 的“UCP1脂肪酸穿梭模型”
结合起来，形成“质子和超氧跨膜解偶联双循环回
图1　鲤鱼肝线粒体的超氧生成
(复合体 I: 实线，复合体 III: 虚线)
图2　鲤鱼肝亚线粒体颗粒的超氧生成
(复合体 I : 实线，复合体 III: 虚线)
图3　UCP被辅酶Q激活还是被超氧自由基激活?[31]
注：质子(H+)和超氧自由基(O2－· )的解偶联双回路循环模型。
假定O2－· 激活UCP效应理解为是与“脂肪酸 shuttling model”
相平行的作用，即根据O2－· 与H+相互作用生成 HO2·，HO2·
很可能跨过线粒体内膜并在基质中分解成为O2－· 和H+。如果
O2又经过UCP作用再跨膜回到线粒体外，则由此而建立起
“质子和超氧跨膜的解偶联双循环回路”模型。CoQH 2：
还原性辅酶 Q；RC：呼吸链；UCP1,2 ,3：解偶联蛋白 1 ,
2 , 3。
524 生命科学 第20卷
路”模型(图 3)，就可能完整地解释 UCPs在线粒
体基质内被O2－· 激活传递脂肪酸和传递O2－· 及H+跨
膜的双解偶联作用[31]。
(二)复合体 III生成O2－· 的释向和分配比较复杂
和重要，特别是O2－· 从线粒体内膜 C侧向基质M侧
转移涉及线粒体的很多生理和病理机制。以往，通
过亚线粒体 SMP测定使人们相信，O2－· 生成后主要
释向线粒体基质M侧。复合体 III晶体结构分析发
表后，由于 QO位点已证明位于近细胞的膜 C侧，
这为QO位点UQH·产生O2·的释向线粒体内膜C侧提
供了新解释和提供了新证明[10,17,26,29-35]。目前，有关
完整线粒体、内膜体和 SMP的研究都证明O2－· 主要
释向线粒体外的细胞质 C侧[25]或释向两侧[26,29]。从
我们图 1图 2的比较中，线粒体内外介质都在中性
偏碱(pH=7.5)范围内，O2－· 在线粒体 C侧和M侧的
衡稳态量(pmole/mg)分配比为M/C =80/30；在线粒
体外C侧介质偏向酸(pH,5.5)和基质内M侧偏碱(pH,
8.0)时(线粒体态4呼吸建立跨膜∆ψ和跨膜∆pH的能
化态)，O2－· C侧和M侧的衡稳态量(pmole/mg)分配
比约为 C/M =30/30。与Muller等[26]报道小鼠骨骼肌
线粒体的测定结果(M/C=50/50)相近。据此可推
论：第一点，QO位点UQH·产生O2－· 的释放方向是
胞质 C侧。因为这与复合体 III晶体结构和 Q循环
的电子传递反应的热力学和动力学数据分析相一
致 [19,36]，也与我们的“ROS循环”模型相符合[10] ；
第二点，因为 Qi位点稳定的 UQH·不能产生 O2－· ，
也没有 O2－· 释放到M侧。因此M侧的 O2－· (如图 2)
是由 C侧跨膜转移的结果[10,26,29,34,35]。
问题是，O2－· 阴离子自由基不溶于脂相，如何
由C侧跨膜转到M侧？目前文献中直接涉及这一重
要理论机制问题的仅有处在假说阶段的两个模型：
(1)我们实验室提出了线粒体内膜表面O2－· 与H+
形成HO2·是其跨膜的主要形式的假说[10,18,34,35 ]。除
了基于自己的实验证明线粒体呼吸(主要是复合体
III)生成的O2－· 与膜表面的能化态H+形成跨膜的HO2·
返回基质，从而降低线粒体态 4呼吸的 ∆ψ，H+/2e
比和膜表面能化态H+等，还根据O2－· 具有酸碱双重
特性，能吸收 H+和又能释放 H+的化学反应：
O2－· +H+←→HO2·，pKa=4.9[37](反应 3) ；
该模型认为靠近线粒体内膜C侧Q0位点UQH·
产生的O2－· ，易于在其 C侧膜表面的酸性环境下(特
别在态 4呼吸能化态时)与能化态H+形成HO2·(反应
3向右)。当HO2·跨膜到基质M侧碱性环境下，又
易于释放H+和O2－· (反应 3向左)。O2－· 转移的份额多
少受形成HO2·反应的 pKa 值所控制。在 pH为 4.9
和反应 3达平衡时HO2·转移份额最大也可达 50%。
这就可解释我们图 1和图 2(M/C=30/30)和 Muller等
报道小鼠骨骼肌线粒体的测定结果 (M/C=50/50)。
已证明线粒体内膜C侧膜表面的pH值在态4呼吸能
化态时可达 pH5－ 6左右[10]。在此态 4能化态条件
下形成的HO2·如同O2及H2O2一样易于跨膜，HO2·
实际就是O2－· 和H+两者彼此的跨膜载体[29,30]。这一
模型也有来自国际的引述或支持[22,23,31,37-39]。
(2) Muller以小鼠骨骼肌线粒体的测定结果发现
O2－· 在两侧的分配大致相当(M/C=50/50)。 他们提出
了两种解释。第一，Q循环形成的中性半醌(UQH·)
从Q0位点大体相等地扩散至两侧，在两侧的膜脂 /
水相界面中性半醌释放出H+时与O2作用生成O2－· 。
该作者推测，Q循环中Q0位点的半醌不稳定结合不
紧密，脱离位点扩散是可能的。第二，在 Q0疏水
位点O2与中性半醌作用生成的HO2·，可沿疏水通道
移到膜脂相中间，再相等地向两侧扩散。作者认为
第二模型与Liu模型不同点在于，形成HO2·的H+很
可能是来源中性半醌，而不是水相(但 Liu & Huang
模型中的H+是来源于膜表面 ∆pH)。支持其模型的
主要证据是改变介质的 pH至碱性，未发现对线粒
体基质中Aconitase的酶活性有任何影响，推想这是
O2－· 未受介质 pH影响的结果[26]。应该说，Muller 模
型的中性半醌或HO2·都“移到膜中间”然后又“相
等”地“向两侧各分配 50%O2－·”等均属推理，未
提供相关实验和事实。再者，上述图 1图 2结果也
证明水相介质 pH明显影响O2－· 生成，不符合Muller
模型。早有文献证明线粒体膜表面的 pH要比水相
介质小 1－ 2个单位 [11,39]。但重要之点是，上述Liu
& Huang和Muller两个模型的共同点都认为HO2·可
能作为 O 2－·的跨膜运动载体，这是重要的。
(三)关于呼吸链 -细胞色素C-p66Shc的电子传递
与H2O2的生成和释放转移
近来发现小鼠等培养细胞中有关线粒体呼吸链
与 ROS产生和释放转移的新途径。从图 4可知，位
于线粒体内外膜间的 p66Shc氧还蛋白，当其从抑制
态(例如在 TOM 和 TIM复合体中)转为活化态(被释
出)，就能从还原的细胞色素 C传递电子给O2使之
还原为H2O2，并通过开启 PTP膜孔，释出H2O2导
致线粒体膨胀和细胞凋亡[7]。这是p66Shc从呼吸链还
原细胞色素 C接受电子生成 ROS的新途径(图 4)。
525第4期 刘树森：线粒体呼吸链与活性氧
SOD、Cu-Ze2+-SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-
Px)或 Catalase等。O2－· 在线粒体内外膜间，可被氧
化型细胞色素C还原[9] ；O2－· 也可与H+反应生成HO2·
进入膜中易与膜脂中多不饱和脂肪酸反应生成H2O2
和产热，但HO2·也容易跨膜再分解为H+和O2－· 再被
线粒体基质内Mn2+-SOD或在线粒体外被 Cu-Ze2+-
SOD清除；O2－· 可与O2互相作用转换成 1O2等。此
外细胞中和线粒体内尚有NADH/NAD+等许多套互相
联系的氧还调控体系。因此，在细胞内的稳态[O2－·]
仅为 10-10－ 10-11 mol/L, [H2O2]为 10-9 mol/L[15]，这
应是生理的安全浓度，是ROS产生体系和代谢清除
体系之间的动态平衡结果。上述线粒体呼吸链以外
“外围”的抗氧化体系，包括对调控呼吸链功能和
ROS代谢关系极为密切的NO体系，因其产生途径
为mtNOS的酶促产物，限于篇幅，本文都将不讨
论，读者可参阅[ 5 ]。
我们主要聚焦线粒体呼吸链机构和功能本身的
那些“内在”的 ROS代谢调控的机制；以线粒体
呼吸代谢建立的质子驱动力(∆P)的作用机制为基
础，探讨 ∆P作为氧化磷酸化能量转换中介和调控
Q 循环正常电子传递功能相关联的新功能——调控
O2－· 等 ROS的生成和代谢。我想以此讨论作为本文
的归结也许是必要和合适的。
虽然 Cadenas和 Boveris(1980)最早曾观察到几
种离子跨膜载体对线粒体的H2O2生成速率产生强烈
影响；从而涉及到膜电位有可能对呼吸链半醌的自
氧化的调节问题[41]。他们也观察到复合体 III Q循
环电子传递被抑制比不抑制时ROS生成增加；但当
时该文作者未明确提出膜电位调控线粒体ROS生成
的论点，因为没有两者直接相关的实验结果[5 ,9 ]。
1995－1997年我们实验室[10,17,34,35]提供了两者直接相
关的实验结果和一些重要结论，包括：
(1)鼠心线粒体在不同能化水平的不同跨膜电位
∆Ψ(120－ 180mV)时比较测定，态 4呼吸、O2－· 和
H2O2生成速率、细胞色素 b566还原速率等 4组系列
曲线都平行地与∆Ψ呈梯度的非线性相关(非欧姆式
相关)。180 mV高 ∆Ψ使O2－· 和H2O2生成量突然大
幅度上升；此时O2－· 小量下降(5－ 10 mV)又迅速导
致O2－· 和H2O2生成量大幅度(约60%－80%)下降[10,17]。
Skulachev(1997-1998 )[38-40]评述这一发现是“O2－· 和
H2O2生成对 ∆Ψ呈阈值现象，是中国生物能力学家
刘和黄的首次报道”。“线粒体 O2－· 和 H2O2的生成
与态 4呼吸速率及其能量偶联产物质子驱动力(∆P)
研究发现，p66Shc- /-小鼠和 p66Sh c-/ -细胞，或
p66Shc蛋白的氧还中心突变的线粒体，其 ROS 产生
都明显下降。另一条件是还原型细胞色素C 的大量
积累才可促进H2O2产生，因为它们之间的氧还反应
的KEQ=0.1：[p66Shc] + [CytC] = [p66Shc]- + [Cyt C]+，
所以还原型细胞色素 C 很难被 p66Shc氧化，除非在
各种条件下造成大量细胞色素 C的还原，如线粒体
呼吸链电子传递受阻，复合体VI活性被NO抑制，
或低氧损伤等。这也是呼吸链大量生成O2－· 、H2O2
等ROS必要条件的共同特点。线粒体外膜尚存在另
一条补充提供还原电子当量的NADH-CytB5还原酶-
细胞色素C的途径，以保证p66Shc产生H2O2的流通，
从而说明细胞色素C还原在呼吸链调控ROS生成中
的重要性。由于 p66Shc产生 H2O2 而不是 O2－· 。显
然，H2O2易跨膜和释放转移主要只受扩散因素的控
制。目前未发现 p66Shc在线粒体内的表达对线粒体
呼吸功能和跨膜电位有任何影响。因此这条产生
H2O2新途径的出现将对线粒体与细胞之间的信号传
递，特别对氧还电势平衡和细胞凋亡的调控有着重
要意义。
4 线粒体呼吸链 ROS的代谢调控问题
O2－· 等 ROS在细胞中代谢调控和被清除是多途
径的和多条件的。目前已知线粒体有 9条抗ROS氧
化损伤的酶系，包括线粒体内外分布的 M n 2 + -
图4　线粒体p66Shc 氧还活性的ROS生成
与其细胞凋亡作用 [7]
注：促凋亡信号诱导 p 6 6 S h c 从假定的被抑制的复合体(与
TOM和 TIM)中释放出来，活化后的 p66Shc能氧化还原型细
胞色素 C (黑色)，并催化O2还原为H2O2，PTP再被H2O2
开启从而导致线粒体膨胀和细胞凋亡。线粒体外膜的
NADH-cyt b5 reductase 是另外一个还原型细胞色素C的假
想来源。
526 生命科学 第20卷
呈函数相关”。
(2)线粒体质子驱动力(∆P)的两个组分(∆Ψ和
∆pH)都控制线粒体O2－· 和H2O2的生成。因为 CCCP
(消除 ∆Ψ和 ∆pH)或尼日利亚霉素Nigiricin(仅消除
∆pH)两者均可单独阻抑大鼠肝脏和心脏线粒体O2－·
和H2O2的生成。首次直接实验证明 ROS生成对线
粒体质子驱动力(∆P)的两个组分(∆Ψ和∆pH)都有同
样的依赖关系[10,17]。
(3)还原型Cytb566的升高曲线也同样与∆Ψ呈非
线性相关。实验验证了高 ∆Ψ(180mV)导致 Cytb566
高还原性(电子传递到Qi位点的UQH·速度减慢)，有
利于Q0的 UQH·易于“电子漏”生成 O2－· 的观点。
并为之提供了有力新证据[9]。
(4)我们提出了“线粒体呼吸链‘ROS循环’
与Q循环和 H+循环共转运”的理论模型，证明线
粒体呼吸(主要是复合体 III)生成的O2－· 与膜表面的能
化态H+形成跨膜的HO2·返回基质，降低线粒体态
4呼吸的 ∆Ψ，H+/2e比和膜表面能化态H+，从而下
调O2－· 的生成利于维持ATP合成(及热生成)与ROS生
成的平衡[10,17,29-35]。
经过十多年的国际广泛引用和不断的实验验
证，上述(1)和(2)两组实验两项结论已成目前普遍
的共识。因为不久即分别被两个实验室直接证实。
Skulachev证实了“线粒体H2O2的生成曲线与ΔΨ
呈非线性相关”这一结论[38-40] ；Brand证实了“线粒
体H2O2的生成对∆pH的依赖性是刘的首次发现”[27]。
后来Boveris也报道线粒体态4 时H2O2生成速率比态
3时高4－5倍，为支持上述结论提供了间接证明[41]。
Forquer等[19](2006)和 Cape(2007)等[36]的最新报
道也与我们上述(3)组试验结论相一致，为证明 Q0
位点UQ·生成O2－· 提供了新支持。他们测量到，线
粒体正常运行的Q循环和被抗霉素A抑制时生成O2－·
的活化能(Ea)接近相等，通过变化[2Fe-S]的氧还性
质来改变QH2 氧化驱动力可导致Q循环和O2－· 生成
两方面的 Ea呈线性相关变化(斜率，slope接近 1.0)
以及 [2Fe-S]的 Ea及中点电位(Em)两者的相似性，
这都说明从 QH2 到 [2Fe2S] 中心的电子传递是Q循
环和O2－· 生成的限速因素,而Q0位点不稳定的低电位
中间物，即 UQ·是还原 O2生 O2－· 的电子来源[19,36]。
这一最新实验结论完全和以往许多作者对我们上述
实验结论的评价相一致。例如 Papa(1997)认为“刘
树森等这一发现解释了高∆Ψ时呼吸减慢和UQH·寿
命延长是复合体 III‘漏电子’产生 O2－· 的主要原
因，线粒体 ∆Ψ 是 O2－· 消长的主要调节者”[38]。本
文引用若干相似评论的文献，主要强调国际同行对
这一问题的认同性已经相当一致和成熟。
关于(4)组试验结果和模型，在上一节有关O2－· 分
配和跨膜转移问题已作讨论。“质子和超氧跨膜的
解偶联双循环回路”模型的提出应是对“ROS循
环”的直接支持 [ 3 1 ]。此外，对“R O S 循环”的
作用机制和线粒体能量代谢的调控意义也有正面的
评述和讨论[3,22,23,37]。
(5)基于上述，本文作者 2007年在ASMRM国
际会议上的“线粒体质子驱动力(∆P)的新功能”报
告中提出，“线粒体呼吸链建立的质子驱动力(∆P)
是氧化磷酸化合成ATP的能量中介；而线粒体 ∆P
控制O2－· 和H2O2信号分子的生成这一发现和证实，
则是扩大了 ∆P作为能量转换中介的功能范围，也
是Mitchell化学渗透学说理论意义的延伸和扩展[29]。
因为线粒体已不再被看成单一的“动力站”，而是
调节多种细胞过程与线粒体动态和功能互相联系的
多信号通路的综合平台 [42 ]”。
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