全 文 ：第25卷 第10期
2013年10月
Vol. 25, No. 10
Oct., 2013
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
文章编号：1004-0374(2013)10-0983-10
合成生物学中的DNA组装技术
赵　鹃，王　霞，李炳志*，程景胜，元英进
(天津大学化工学院系统生物工程教育部重点实验室，天津 300072)
摘　要：合成生物学旨在应用工程学的研究思路及手段去设计或改造生物系统，是一个综合了科学与工程
的拥有发展潜力的新兴学科，在生物医药、农业、能源、环保等方面发挥着巨大作用。DNA 组装技术是合
成生物学中的关键技术，也是合成生物学快速发展的限制性技术。综述了众多 DNA 组装技术的发展及其
在合成生物学研究中的意义和应用。
关键词：合成生物学；DNA 组装；基因合成；生物途径构建；基因组合成
中图分类号：O621.3 ；Q523 ；TB383 文献标志码：A
DNA assembly in synthetic biology
ZHAO Juan, WANG Xia, LI Bing-Zhi*, CHENG Jing-Sheng, YUAN Ying-Jin
(Key Laboratory of System Biological Engineering of the Ministry of Education,
School of Chemical Engineering, Tianjin University, Tianjin 300072, China)
Abstract: Synthetic biology aims to apply the engineering principles to the design of biological system. It is an
emerging fi eld that combines science and engineering, and has great potentials in promoting the development in
biomedical research, agriculture, bio-energy and bioremediation. DNA assembly is a pivotal technique
implementing the vision of synthetic biology, and is also a limiting technology in advancing synthetic biology. This
paper will review the development and current status of DNA assembly, and discuss its applications and signifi cance
in synthetic biology.
Key words: synthetic biology; DNA assembly; gene synthesis; pathway construction; genome synthesis
收稿日期：2013-03-14； 修回日期：2013-04-07
基金项目：国家高技术研究发展计划项目(“863”计
划)(2012AA02A708)
*通信作者：E-mail: bzli@tju.edu.cn
合成生物学是一个综合了科学与工程的新兴研
究领域，在生物、医药、农业、能源及环保等方面
具有巨大的应用潜力。合成生物学旨在应用工程学
的研究思路及手段去设计改造基因、生物元件、生
物途径，甚至整个基因组；而 DNA 组装技术则是实
现合成生物学各种目的的关键技术。由于基因合成
的成本降低，基因组的全合成增加了对人工设计合
成细胞的期望。目前，设计并合成基因组的能力还
远远落后于已掌握的合理设计生物元件的能力。合
成生物学的大部分工作还处在利用模块化的生物组
件组合构建各种网络和代谢途径。很明显，DNA 组
装是合成生物学快速发展的限制性技术。因此，合
理而可靠的组装技术是发展合成生物学所必需的。
1　从寡核苷酸到基因的组装
在阐明基因功能、分析蛋白质与核酸相互作用、
基因异源表达等研究中，DNA 片段的化学合成是
一个高效的技术手段。在多数情况下，如模板
DNA 不可得或是密码子需要优化，化学合成是唯
一的选择。20 世纪 60 年代、70 年代初，一群有机
化学家，尤其是 Khorana 开发了寡核苷酸的合成
技术，为基因的化学合成奠定了基础。1970 年，
Khorana 等 [1] 合成了编码酵母丙氨酸 tRNA 的基因，
这是第一条人工合成基因。随后，一系列蛋白质的
编码基因被合成并在大肠杆菌中表达 [2-4]。这一系
列研究充分证明了化学合成基因的可行性。20 世纪
80 年代中期，大于 100 bp 的寡核苷酸的合成得以
· 技术与应用 ·
生命科学 第25卷984
实现 [5]，大大地推动了基因合成技术的发展。通过
连接酶介导法和 FokI 法等，寡核苷酸被组装成具
有功能的基因 [6-7]。然而，早期的合成技术通常只
能合成小于 1 kb 的 DNA 片段。
自 20 世纪 90 年代，PCR(polymerase chain reaction)
技术被用于基因合成，并在长期的研究发展中日
渐成熟。连接酶链式反应法 (ligase chain reaction,
LCR) 与 PCR 法的结合使用，在基因合成研究中发
挥了重要作用 [8]。该法通过热循环反应，采用嗜热
性 DNA 连接酶将首尾相连、重叠杂交的寡核苷酸
片段连接起来，再以连接产物为模板、首尾寡核苷
酸片段为引物进行 PCR 扩增，从而合成基因片段
( 图 1a)。LCR 法还被用于 microRNAs 的检测 [9] 以
及单核苷酸多态性的检测 [10] 等。1995 年，Stemmer
等 [11] 描述了一种只依赖于 DNA 聚合酶的基因合成
法，将 56 个 40 bp 的寡核苷酸片段通过 PCR 法组
装成 1.1 kb 的 TEM-1 β 内酰胺酶基因。采用同样
的方法，他们还将 134 个 40 bp 的寡核苷酸片段
合成一个 2.7 kb 的质粒 [11]。随后，Withers 等 [12] 对
该法进行优化，合成了 2.1 kb 的恶性疟原虫基因
pfsub-1。
近年来，以 PCR 为基础的基因合成方法得到
了进一步的演变与发展。2003 年，Smith 等 [13] 将
连接酶拼接法 (LCR) 与重叠延伸 PCR 法 (overlap
extension PCR, OE-PCR) 相结合 ( 图 2a)，合成了噬
菌体 φX174 基因组全长序列 (5 386 bp)。2004 年，
Young和Dong[14] 将双重不对称 PCR (dual asymmetrical
PCR, DA-PCR)与OE-PCR相结合，在DA-PCR阶段，
每四个相邻的带有重叠区的寡核苷酸互补结合成
小片段，这些小片段再经过 OE-PCR 合成全长基因
( 图 2b)。
Kodumal等 [15]、Xiong等 [16-17]、Reisinger等 [18]采
用以 PCR 为基础的两步法 DNA 合成方法，将大量
带有重叠区的寡核苷酸合成长基因。在这种方法中，
设计合成的寡核苷酸涵盖基因的两条链，所有寡核
苷酸在一个 PCR 反应体系中经过重叠延伸，再以
首尾寡核苷酸片段为引物扩增合成基因全长 ( 图
1b)。PTDS (PCR-based two-step DNA synthesis) 是
Xiong 等 [16] 描述的另一种以 PCR 为基础的两步法
DNA 合成方法 ( 图 3)，它包含两个关键步骤 ：首
先由寡核苷酸合成几个独立的 DNA 小片段；其次，
通过 OE-PCR 将这些 DNA 小片段组装成全长基因。
图1 LCR-PCR法合成基因(a)及PCA-PCR法合成基因(b)的示意图
图2 LCR+OE-PCR法合成基因(a)及DA-PCR+OE-PCR法合成基因(b)的示意图
赵　鹃，等：合成生物学中的DNA组装技术第10期 985
通过这种方法，他们合成了 657 bp 的水稻转录因子
OsDREB1B[19]、1 230 bp 的 Peniophoralycii 植酸酶基
因 [17]、1 245 bp 的 HBV 表面抗原基因 PRS-S1S2S[20]、
2 382 bp的 vip3aI基因及5 367 bp的CrtEBWY基因 [16]
等。这种方法对于 GC 含量高、重复序列多或二级
结构复杂的基因合成有一定的适用性。
另一种以 PCR 为基础的两步法基因合成法是
由 Gao 等 [21] 建立的热力学平衡由内而外合成法
(thermodynamically balanced inside-out, TBIO)(图4)，
该法包含几个关键的步骤：(1) 引物的设计，正向
引物涵盖基因 N 端的一半序列，反向引物涵盖基因
C 端的一半序列；(2) 将位于中间的 4~6 对引物混
合进行内外双向延伸 PCR 反应，合成一个小片段；
(3) 将合成的小片段进行纯化，并作为模板，与另
几对稍微外侧的引物进行又一次的内外双向延伸
PCR 反应，合成一个较长的片段 ；(4) 片段纯化及
PCR 反应继续进行，直到获得全长基因。这种合
成方法的突变率 (0~0.3%) 低于许多其他方法
(0.1%~1%)。用于基因合成的另一策略是连续延伸
PCR (successive extension PCR)[22-24]，它的引物设计
与 TBIO 相同，然后将所有引物混合进行延伸反应，
获得全长基因。Peng 等 [25] 应用该法将 26 个寡核苷
酸合成 BtcryIA(c) 基因；但对于较长基因 (>1 kb) 的
合成，采用这种方法通常得不到目的片段，且非特
异条带非常明显。因此，Xiong 等 [16] 优化了该法，
采用不等量引物混合及分段合成法进行较长基因的
合成，取得成功。
为了提高基因合成通量并降低成本，研究者们
开始探索基因合成的微型化和自动化技术。2004年，
Tian 等 [26] 和 Zhou 等 [27] 研制出用 DNA 芯片合成大
量寡核苷酸片段进行基因组装的方法。随后的研究
在提高基因组装效率和选择性扩增寡核苷酸库等方
面取得了一定进展，但却没有解决微型化和自动化
的问题。2011 年，Tian 实验室研发出一种新的芯片
基因合成技术，将寡核苷酸合成、扩增和连接组装
等步骤集成到一块塑料芯片上，从而初步解决了这
一难题 [28]。基因芯片在生物、医学、农业等领域得
到广泛应用 [29-30]。
除了体外合成法，在生物体内也可以进行基因
的合成。2009 年，Gibson[31] 将 38 个寡核苷酸片段
和一个线性化的质粒在酿酒酵母体内合成了一个携
带 1 170 bp 基因序列的环形质粒。相邻寡核苷酸片
段之间具有 30 bp 的重叠区，首尾寡核苷酸片段与
线性化质粒具有 20 bp 的重叠区；利用酵母细胞的
同源重组功能，将同时转化进酿酒酵母体内的寡核
苷酸片段和线性化质粒自动修复整合成为一个携带
基因的环状质粒。
2　从元件到功能基因的组装
一个有功能的基因包含带有核糖体结合位点
(RBS) 的启动子、开放阅读框 (ORF) 及终止子。当
然也存在其他元件，诸如上下游调节区、内含子、
RNA 可折叠区等，但这些元件并不是必需的。将
图3 PTDS法合成基因的示意图
图4 TBIO法合成基因的示意图
生命科学 第25卷986
这些独立元件组装成一个有功能的基因需要按顺序
进行，即启动子在 ORF 之前，终止子在 ORF 之后，
Knight[32] 建立的 BioBrickTM 组装法则是一个有效的
方法。在各个独立元件的序列两端加入标准的侧翼
序列，如此则可以通过一个低成本的、简单的、标
准化的酶切连接法将各个元件有序地组装起来 ( 图
5a)。采用 BioBrickTM 法可以构建并储存一系列的生
物模块供大家分享。在这种方法兴起的十年内，合
成生物学中生产了一大批有价值的生物组件和途
径 [33-35]。此方法还可与 PCR 结合使用来合成 DNA
重组片段 [36]。BioBrickTM 最主要的缺点是在元件相
互连接处存在 8 bp 序列痕迹，而这段痕迹在某些情
况下是不可接受的，如某些基因的 RBS 必须紧挨
ORF。又由于这 8 bp 的序列含有一个终止密码子，
因此用于融合蛋白的构建。为了解决这一问题，研
究者们对传统的 BioBrickTM 组装法进行改进，建立
了两种用于构建融合蛋白的方法 ( 图 5b、c)[37-38]。
2010 年，Anderson 等 [39] 创建了一种新的标准化组
装法 BglBricks，这种方法只在连接处留下 6 bp 的
序列痕迹，可用于融合蛋白的构建。此外，该法采
用常见的高效的限制性内切酶，且这些酶的识别序
列不被最常见的 DNA 甲基化酶所阻断。
然而，不管是 BioBrickTM 及其改进方案还是
BglBricks，都不能实现无痕组装，且受酶切位点序
列限制。要实现不受序列限制的无痕组装，重叠延
伸 PCR (OE-PCR) 是一个不错的选择。OE-PCR 由
Horton 等 [40] 建立的，它采用具有互补末端的引物，
使 PCR 产物产生重叠区，从而在随后的扩增反应
中通过重叠区的互补结合，将不同来源的扩增片段
拼接起来 ( 图 6a)。该法操作简单、周期短，适用
于 0.5~5 kb 的 DNA 片段的组装。OE-PCR 由于其
技术优势，广泛应用于基因克隆 [41]、定点突变 [42]、
基因剪接 [43] 等研究中。研究表明，OE-PCR 不仅能
用于基因的组装，也具有组装整个质粒的能力。
2009 年，Quan 和 Tian[44] 描述的聚合酶环形延伸克
隆 (circular polymerase extension cloning, CPEC) 即
是根据 OE-PCR 原理，通过无引物 PCR 将片段连
接进入线性化质粒，形成的环形质粒可直接转化大
图5 BioBrickTM组装法(a)及其改进策略(b、c)
赵　鹃，等：合成生物学中的DNA组装技术第10期 987
肠杆菌感受态细胞 ( 图 6b)。这种方法依赖于片段
与载体之间的同源序列，一般为 20~25 bp。该法简
便高效，既可用于单片段的克隆，也可用于多片段
与载体的组装。2010 年，一个基于 CPEC 的改良技
术 [45] 显示，用于克隆的载体不需要进行线性化，
只需在反应完成后采用限制性内切酶 DpnI 对产物
进行处理。该酶对甲基化敏感，可以将原始的环形
载体消化而只留下经 PCR 组装而成的新的质粒。
这两种技术为 OE-PCR 提供了一个新的强大的视
角，可以快速地完成从元件到基因到整个质粒的组
装而不需要使用连接酶。但是，当序列高度重复或
GC 含量高时，所有的 PCR 法都不能确保组装的精
确性。
2013 年，赵国屏研究组建立了一种新的无序
列依赖性的 DNA 无痕组装法，称之为 MASTER连
接法 (methylation-assisted tailorable ends rational
ligation method)[46]。该法所用的一个关键酶是同时
具有 IIm 型和 IIs 特性的限制性内切酶 MspJI，该酶
只识别甲基化的 4 bp 的位点，mCNNR (R=A or G)，
然后在识别位点的外侧进行切割，留下黏性末端供
连接使用。运用此法，他们组装成了 29 kb 的天蓝
色链霉菌放线紫红素的生物合成基因簇，但是，
MspJI 是一个比较昂贵的酶，在进行大量组装时应
考虑其经济成本。
3　从基因到生物途径的组装
在合成生物学领域，将原件组装成功能基因只
是一个最基本的步骤，大多数研究都致力于将多个
基因重组为具有特定功能的生物途径，如 iGEM 项
目构建的具有独创性的调节网络 [47]、通过代谢工程
实现的生物燃油的工业合成 [48] 等。在生物途径的
构建中，基因之间的序列痕迹对其功能的发挥没有
明显的影响。因此，BioBrickTM、BglBricks 等方法
也适用于将基因组装成生物途径；但由于这些方法
受序列限制，且耗时长，因而只适合构建小型的途
径。OE-PCR，特别是 CPEC 也适用于小型途径的
构建，这些方法自身的特点及缺陷限制了它们进行
更大规模的组装。
IIs 型限制性内切酶的使用让更大规模的组装
得以实现。这些酶在其识别序列的外侧进行切割 [49]，
留下 4 bp 的黏性末端，因而只需在与其进行连接的
另一片段上合理地设计 4 bp 的互补序列，就可以进
行无痕组装 ( 图 7)。Kodumal 等 [50] 利用 IIs 型限制
性内切酶法组装了一个 32 kb 的基因簇。Golden
Gate 组装法就是依据这种酶的特性建立的，它可以
通过一步酶切连接构建得到重组质粒，正确率几乎
100%[51]。这种方法可以有序、并行的进行无痕组装，
在合成生物学领域倍受推崇。从理论上讲，4 bp 的
序列可以组成 256 种不同的互补区，因而该法可用
于多片段的拼接。但研究表明，相似的互补序列容
易形成错配而造成错误的组装，所以该法更适合于
元件到功能基因的组装以及小型生物途径的构建。
2010 年，Blake 等 [52] 描述了一种比较复杂的
IIs 型限制性内切酶克隆法，专用于将 DNA 大片段
图6 OE-PCR(a)和CEPC(b)的原理示意图
图7 IIs型限制性内切酶进行无痕组装的示意图
生命科学 第25卷988
组装成较大的组件或途径。这种方法的主体是两端
带有 65 bp 的标准化标签的片段，以及两种载体，
每种载体携带两个不同的无启动子的抗生素抗性标
记。IIs 型限制性内切酶的识别序列位于标签内，片
段经 IIs 型内切酶处理后，连接到一种载体的特定
位置；在此位置，标签序列恰好可充当抗生素抗性
标记的启动子而使其发挥作用，便于筛选。两个质
粒的插入片段再次经过 IIs 型内切酶消化，并暴露
出 4 bp 的互补区；然后这两个片段被连接进入带有
另两种抗性标记的载体中，组装成一个更大的片段。
重复上述过程，他们将多个 1~2 kb 的片段经过六次
循环组装成了 91 kb 的大片段。
此外，有一系列被称作 overlap 法的组装技术
被用于生物途径的构建中。这些方法不需要使用限
制性内切酶，只要求片段之间具有同一个约 20 bp
的序列。这段同源序列经过酶处理从而使片段
拼接在一起。著名的商业化的质粒构建试剂盒
GatewayTM 就是采用这种方法，带有同源序列的片
段经过一种特殊的重组酶处理而组装在一起 [53]。由
于每个连接处都会留下相同的约 20 bp 的序列，因
而这种方法并不适合于大规模片段的平行组装。相
对而言，In-FusionTM 则是一种更受欢迎的商业化克
隆试剂盒 [54]，它利用专有的酶混合物可以将任何具
有 15 bp 同源序列的片段组装在一起，不遗留连接
痕迹，特别适用于多个 DNA 片段的平行连接 ( 图 8)。
另一种 overlap 法被称作 USER 克隆 [55]，首先
采用含有至少一个尿嘧啶的引物扩增片段，然后利
用尿嘧啶 DNA 糖基酶将尿嘧啶切除，余下一个无
碱基位点。这个位点经 AP 裂解酶处理，则留下一
个与原始引物序列互补的 3 悬挂区。依赖于这种悬
挂区将片段连接起来，而不需要使用连接酶。这种
组装方法在片段之间不留下痕迹，可用于多片段的
平行组装，但该法也存在一个缺点，它要求在片段
末端附近至少存在一个胸腺嘧啶，因而并不是完全
无序列依赖性。
2007 年，Li 和 Elledge[56] 描述的 SLIC 法则是
一种既不需要连接酶也无序列依赖性的组装方法。
该法依赖于T4 DNA聚合酶的3-5核酸外切酶活性，
片段经 30 min 的孵育处理，产生约 30 bp 的序列悬
挂区 ；相邻片段的悬挂区是互补序列，经过退火处
理，结合在一起；加入 RecA 使结合稳固，模拟体
内 DNA 修复机制使片段连接在一起。SLIC 法可进
行多片段的平行组装，是构建生物途径的一个得力
技术。
4　基因组合成
DNA 组装技术的发展使科学家们能够制造完
整的基因，最终合成微生物的基因组。目前，对人
工合成微生物基因组的研究空前活跃，并已经取得
了一些成果。2002 年，Wimmer 小组合成了脊髓灰
质炎病毒的全基因组，全长约 7.7 kb[57]。经实验证明，
这些合成的病毒基因组可以合成与天然病毒完全
相同的蛋白质，而且具有侵染宿主细胞的活力。
2003 年，Venter 研究组采用 LCR-PCR 法在两周内
从头合成了噬菌体 φX174 基因组，全长约 5.3 kb[13]。
2009 年，Venter 研究组又创建了一种恒温的一步法
组装技术，被称作“Gibson 恒温组装法”( 图 9)，
即利用 5 核酸外切酶、DNA 聚合酶及连接酶的协
调作用在体外将多个带有重叠区的 DNA 片段组装
起来 [58]。采用这种方法，Gibson 等 [58] 成功地将 4
个超过 100 kb 的片段组装成了约 580 kb 的生殖道
支原体基因组。通过实验证明，该法对于较小
DNA 片段之间的组装也是有效的，因而同样可用
于生物途径的构建。同时，经过调节几种酶的比例，
Gibson 等 [59] 又将 600 个带有 20 bp 互补序列的 60 bp
的寡核苷酸组装成 16.3 kb 的小鼠线粒体基因。这
种技术具有强大的并行性，可以通过一步反应组装
环形质粒或细菌人工染色体。
在利用“Gibson 恒温组装法”合成生殖道支原
体基因组的同时，Venter 研究组同时采用改进的
TAR (transformation assisted recombination) 法 合 成图8 In-Fusion的原理示意图
赵　鹃，等：合成生物学中的DNA组装技术第10期 989
该基因组 ( 图 10)。TAR 是利用酵母体内同源重组
来操纵 DNA 的普遍手段，主要用于将功能基因或
生物途径整合到酵母染色体的特定位点。Venter 研
究组对其进行了改进，将 25 个约 24 kb 的片段以及
一个线性化的载体组装成一个携带 580 kb 基因组的
环形质粒 [58]。2010 年，Gibson 等 [60] 采用该技术成
功合成了 1.08 Mb 的丝状支原体基因组。将该人工
合成基因组移植入去除基因组的受体细胞内，一段
时间后，该细胞完全由合成的基因组控制，被称之
为“合成细胞”。Shao 等 [61] 采用类似的“DNA
Assembler”法将两个生物合成途径共 8 个基因构建
到一个载体上，并成功地检测到了代谢产物。酵母
体内天然的同源重组酶具有超高的保真性，因而酵
母体内组装具有高度的精确性。
约翰 - 霍普金斯大学的 Jef Boeke 教授发起了
酵母基因组人工合成计划 (Sc. 2.0 计划 )，旨在通过
人工设计、改造并合成酿酒酵母 16 条染色体序列，
且具有功能性。2011 年，Boeke 教授实验室在 Nature
上发表了一篇具有里程碑意义的论文 [62]。该论文
指出，他们成功地人工合成了世界上首个多功能专
门设计的酵母染色体臂，并且展示了其功能性。自
此，许多国际实验室都加入了这项人工合成整个酵
母基因组的研究。本实验室承担第 V 号染色体的
合成，利用 PCA-PCR 法将寡核苷酸合成 942 个约
750 bp 的小片段，再采用 OE-PCR 法、Gibson 恒
温组装法、酵母体内组装法成功将小片段组装成
266 个覆盖 V 号染色体全序列 2.5~3.5 kb 的 DNA
大片段。
在合成基因组的研究中，酵母并不是唯一可用
的底盘细胞。2005 年，Itaya 等 [63] 采用“蠕动延伸
法”(IWe) 将 3.5 Mb 的集胞藻 PCC6803 的基因组
克隆到 4.2 Mb 的枯草芽孢杆菌基因组中，形成一
个 7.7 Mb 的复合基因组。在该方法的基础上，
2007 年，Itaya 等 [64] 又建立了一种新的利用同源重
组的“多米诺法”，用于合成 16.3 kb 的小鼠线粒体
基因组。该方法采用的是一种特殊的枯草芽孢杆菌，
该菌的基因组中整合了 pBR322 序列，被称为芽孢
杆菌基因组宏基因克隆 (BGM)。这种组装是顺序进
行的，需要将待合成的基因组分成带有同源序列的
约 5 kb 的片段，这些片段被交替克隆到带有不同抗
性标记的两个质粒上。首先，将第一个质粒转化到
枯草芽孢杆菌中，第一个片段以及抗性标记则被重
图9 Gibson恒温组装法的原理示意图
图10 酵母体内DNA组装
生命科学 第25卷990
组到基因组的 BGM 载体位点；然后进行第二个质
粒的转化，第二个片段及抗性标记通过同源重组替
换第一个抗性标记 ；重复上述步骤，直至合成整个
基因组。随后，通过在此法中引入更多的抗性标记，
134.5 kb 的水稻叶绿体基因组被成功合成。值得一
提的是，该基因组具有高重复性，采用其他方法几
乎无法合成。然而，无论是“蠕动延伸法”还是“多
米诺法”都不能进行快速的平行组装。
5　展望
综上所述，DNA 组装技术正处于一个快速发
展的阶段；但是，目前并没有一个理想的组装方法
同时满足无序列依赖性、无痕或只留痕于不受痕迹
序列影响的位置、可按预设顺序进行快速平行组装，
并同时适用于基因、途径及基因组的合成。不同的
组装技术有不同的适用性，通常的策略是几项技术
串联使用。
毫无疑问，未来的 DNA 组装将大大受助于计
算机工具。各种计算机软件的发展促进了寡核苷酸
的设计和合成，设计、改写、合成基因将更高效、
更精确、更廉价。目前，对自动化组装的研究相当
活跃，主要包括对策略的理论分析以及计算机辅助
设计软件的开发 [65-66]。不少软件工具已经被应用于
实验研究中，而新的组装方法在必要时则需要受助
于更多更先进的软件工具。美国生命技术公司 (Life
Technologies) 就提供在线的 Gibson 恒温组装法及酵
母组装法的设计软件。下一阶段的设计软件应该针
对于相邻片段之间顺序依赖性的模块化理解，并应
适合于多组装法的混合使用。联合生物能源研究院
(The Joint BioEnergy Institute) 就开发了一个专门针
对此目的的软件包 J5，能够结合软件利用机器人进
行自动化组装。DNA 组装的自动化将大大提高生
产效率，大规模的基因、生物途径、生物网络及基
因组的合成让我们更加容易地阐明广阔而深邃的生
物机制。
另一个值得考虑的发展方向是体内法，利用微
生物体内的甲基化酶和限制性内切酶对 DNA 序列
进行编程。目前已有技术被用于对细胞体内基因组
进行直接编辑，如 MAGE (multiplex-automated genomic
engineering)[67]。随着全基因组测序成本的迅速下降，
验证细胞内 DNA 的多重变化是可以承受的。
相信在可预见的将来，DNA 合成将会更加快
速、高效而廉价。大规模的基因、基因组的合成将
成为现实。DNA 组装技术的应用将越来越广泛，
很有可能取代现有的分子克隆技术而被广泛应用于
生物、医药、农业、能源、材料及环保等各研究领域。
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