全 文 ：生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
第21卷 第5期
2009年10月
Vol. 21, No. 5
Oct., 2009
文章编号 ：1004-0374(2009)05-0669-06
收稿日期：2009-08-21
基金项目：国家重点基础研究发展计划(“973”计划)
(2010CB945403); 华东师范大学“985工程”科技创
新平台; 上海市科委细胞信号传导平台
*通讯作者：E-mail: wangy32@hotmail.com
胚胎干细胞向血液干细胞定向分化的研究进展
张晓丽，晁瑞华，朱小舟，王　媛*
（华东师范大学生命医学研究所，上海2 0 0 2 4 1）
摘　要：骨髓移植是目前治疗恶性白血病以及遗传性血液病最有效的方法之一。但是 HLA 相匹配的骨
髓捐献者严重短缺，骨髓造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSCs)体外培养困难，在体外修复患者骨
髓造血干细胞技术不成熟，这些都大大限制了骨髓移植在临床上的应用。多能性胚胎干细胞(embryonic
stem cells, ESCs)具有自我更新能力，在合适的培养条件下分化形成各种血系细胞，是造血干细胞的另
一来源。在过去的二十多年里，血发生的研究是干细胞生物学中最为活跃的领域之一。小鼠及人的胚
胎干细胞方面的研究最近取得了重大进展。这篇综述总结了近年来从胚胎干细胞获得造血干细胞的成
就，以及在安全和技术上的障碍。胚胎干细胞诱导生成可移植性血干细胞的研究能够使我们更好地了解
正常和异常造血发生的机制，同时也为造血干细胞的临床应用提供理论和实验依据。
关键词：干细胞；胚胎干细胞；血液干细胞；分化
中图分类号：Q813; Q343　　文献标识码：A
Derivation of hematopoietic stem cells from embryonic stem cells
ZHANG Xiao-li, CHAO Rui-hua, ZHU Xiao-zhou, WANG Yuan*
(Institute of Biomedical Sciences, East China Normal University, Shanghai 200241, China)
Abstract: Bone marrow (BM) transplantation is currently the standard treatment for high-risk leukemia and a range
of genetic blood disorders. However, a shortage of HLA-matched BM donors and the inability to culture and
genetically repair BM-derived hematopoietic stem cells (HSCs) in vitro have limited their more widespread
therapeutic applications. Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent cells that can self-renew and differentiate
into hematopoietic lineages under appropriate conditions, which provide an alternative source for HSC
transplantations. Over the last two decades, hematopoietic development from embryonic stem cells has been
one of the most active areas of stem cell biology. Recent studies have progressed from work with mouse to
human embryonic stem cells. This review outlines the current progress, safety and technical obstacles in
derivation of hematopoietic stem cells from embryonic stem cells. Strategies to produce transplantable hemato-
poietic populations can be used to better understand normal and abnormal hematopoiesis, but also facilitate the
future application of hematopoietic cell from “bench to bedside”.
Key words: stem cell; embryonic stem cells; hematopoietic stem cells; differentiation
目前临床上最常用的细胞替代治疗手段是造血
干细胞(hematopoietic stem cells, HSCs)在血液遗传性
疾病(如再生障碍性贫血)及恶性白血病中的应用。
骨髓、被激活的外周血(mobilized peripheral blood)
及脐带血为主要HSCs 的来源。但这些来源的HSCs
数量少，体外扩增能力有限，且异体移植配型困
难，而基因修复技术的不成熟则限制了自体 HSCs
移植在临床中的应用[1]。胚胎干细胞(embryonic
stem cells，ESCs)来源于胚胎发育早期囊胚的内细
670 生命科学：干细胞研究专刊 第21卷
胞团(inner cell mass)，具有自我更新和多向分化的
特性[2-4]，可在体外无限增殖，传代建系，便于进
行基因修复，且能在体外聚合形成胚体(embryoid
body, EB)，在适当条件下进一步分化形成血细胞，
因而有望作为 HSCs 的另一重要来源。本文就近年
来ESCs向 HSCs诱导方面的研究进展及尚存在的问
题等综述如下。
1　造血干细胞的来源及特征
胚胎血发生可分为两个时期。原始胚胎血发生
(primitive hematopoiesis)始于胚胎外卵黄囊 (yolk
sac)。此期造血主要生成表达胚胎珠蛋白的原始有
核红细胞，但缺乏淋系前体细胞，且不能移植成年
小鼠。随之而来的永久造血(definitive hematopoiesis)
形成的血干细胞具有多向分化潜能，可移植并替代
经放射处理的成年小鼠的造血系统。在胚胎出生之
前，肝脏为主要的永久造血器官[5]。最初人们认为
胚肝中的HSCs 来自于胚胎体外的卵黄囊，但事实
上，早在1899年，van der Stricht已提出蝙蝠胚
体内造血区的存在，这一结果在后来的兔、鼠、
鸡，以及人的研究中亦观察到[5]。但最有说服力的
证据来自于鹌鹑早期胚胎/鸡卵黄囊之间的异体移植
实验，鹌鹑胚胎可移植于鸡胚，但鹌鹑胚胎中却检
测不到鸡卵黄囊血细胞[6]，从而证明了早于胚肝的
胚体内造血区的存在。目前研究表明这一区域位于
胚胎的主动脉 - 性腺 - 中肾区(a o r t a - g o n a d -
mesonephros, AGM)，来自于主动脉旁胚脏壁(para-
aortic splanchnopleural)[7,8]。另外，一系列的研究表
明胎盘亦可能参与胚胎造血[9-13]。
胚胎出生后的主要造血器官是骨髓。小鼠骨髓
HSCs的筛选手段主要是通过特异性标志的阴性筛选
及阳性富集相结合的方法，分选c-kit+/Sca1+/thy1-low/
lineage-的细胞(即不表达Mac1、Gr1、CD3、 CD4、
CD8、B220、Ter119 等末端分化的血细胞的表面抗
原)[14]。也可以用Rhodamine123和Hoechst33342染
料染色等手段来分离骨髓HSCs[14]。而胚胎时期的
HSC s 表面抗原的表达非常短暂，且缺乏特异性，
其表型随发育的阶段、细胞周期及所在的位置而改
变。例如，c-kit 不仅仅表达在血细胞表面，亦可
在肝的前体细胞检测到[ 1 5 ] 。在胚胎发育早期，
CD41 在造血前体细胞中表达，而在永久造血细胞
中，CD4 1 表达于巨核细胞[1 6 ]。静默状态的长期
HSCs (long-term HSCs)不表达CD34，而处于活跃
细胞周期的短期HSCs(short-term HSCs)则高度表达
CD34[17,18]。
与之相比，ESC-HSC 的特异性表面抗原更为复
杂，不能用成体血干细胞的富集方法，且其表型受
EB发育阶段及培养条件的影响而改变。最早的研究
表明，来源于PgP-1阳性，B-220/Mac-1/JORO 75/
TER 119阴性的EB细胞可在移植小鼠体内生成多种
血细胞[19]。但此研究并未证明PgP-1阴性的细胞群
不能移植小鼠，因此PgP-1 是否确为血干细胞的特
异性抗原有待探讨。之后的一系列研究曾采用了
flk1+[20]、CD45+/AA4.1+/B220-[21]或CD45+/c-kit+[22]富
集造血前体细胞，但这些研究同样缺乏阴性群体的
对照实验，而且移植细胞在受体造血系统的嵌合率
较低(移植8周后嵌合率<20%)，因而难以确定这些
标志物是否为ESC-HSC 的特异性表面抗原。最近的
报道表明ESC-HSC 为 CD41+/c-kit+/CD150+/CD34-，
在表型上更接近于胚胎时期的造血前体细胞[23]。但
此群体细胞的表型并不完全一致，仅部分表达
CD45 及 CD48，因此，ESC-HSC 特异性表面抗原
的确定仍需进一步的研究。
人成体造血干细胞为CD34+/CD38-[24]。由于人
类胚胎研究的局限性，胚胎时期HSCs 的表型尚不
清楚。目前，人类ESCs 来源的HSCs 多采用CD34+
的富集方法[25,26]，但移植效率极低，且在受体体内
仅能短期存在，故CD34+ 细胞分选的方法是否可行
有待探讨。
2　胚胎干细胞血分化的方法及所存在的问题
2.1　小鼠胚胎干细胞向造血干细胞分化　Doetschman
等[27]最初发现ESCs在体外可形成血细胞。在此研究
中，ESCs 体外分化形成含血红蛋白血岛的EB，在
细胞因子的进一步诱导下形成多种造血前体细胞集
落，其形成的类型及过程与体内卵黄囊的原始造血相
似，且不能形成淋系细胞，或移植成年小鼠，因此
认为ESCs血分化形成的血细胞为原始造血细胞[28-30]。
ESC-HSC的移植实验在后来十多年的研究中被证
明是一个很有挑战性的课题，人们尝试了多种方法促
进ESCs 的永久造血，或采用细胞表面抗原筛选的方
法富集少量可移植性ESC-HSC，均不甚成功[19-22,31]。
Eichmann[19,21]及Palacios[31]实验室尝试改变CO2及O2
的浓度(7.5%CO2/5%O2)以模仿胚胎在母体内的状态,
并采用了细胞因子，如IL-3、IL-6和 IL-7等诱导
ESCs 的血分化。另外，基质细胞也被多个实验室
用来模拟体内造血系统发育的微环境。Palacios等[19]
认为 FLS4.1 胚肝基质细胞可分泌flt3 配体及SCF
671第5期 张晓丽，等：胚胎干细胞向血液干细胞定向分化的研究进展
(stem cell factor, 或steel factor), 与ESCs共培养，
可促进其永久造血。Nakano等[32]的研究表明FLS4.1、
ST2、PA6 等已建立使用的基质细胞分泌大量的
M-CSF，导致共培养的 ESC-HSC 分化形成巨噬细
胞，因而从M-CSF 失活的新生小鼠头颅骨中分离建
立了OP9 基质细胞系，他们的研究表明OP9 细胞可
促进ESCs体外分化形成淋巴及粒系细胞。Daley及
Zandstra的实验室通过对比ESCs血分化的多种培养
诱导体系( 悬液培养、半固体甲基纤维素集落培
养、贴壁培养及悬滴培养)，发现贴壁培养虽对EB
形成数量的影响不大，但却大幅度地降低了造血前
体细胞的形成。相比而言，单个 EB 形成的造血前
体细胞集落数以悬滴培养为最高[33]。
尽管前期的ESCs血分化及移植研究没有取得突
破性的进展，但这些工作给我们提供了许多可借鉴
的方法及应改善的方面。大家普遍认为ESC-HSC 类
似原始造血细胞，缺乏永久造血所必需的转录因子
及归巢因子(homing factors)。Perlingeiro等[34]在
2001年利用致癌基因Bcr/Abl的过度表达诱导ESCs
形成包括粒系、淋系及红细胞等多种血细胞。受此
启发， Kyba等[35]总结了多年来各实验室ESC-HSC的
研究经验，在早期分化的ESCs 中高度表达HoxB4，
首次成功地诱导ESCs 大量生成造血前体细胞，长
期(>6 个月)及二级移植后可重建受体的血液系统，
而不形成白血病。利用同一方法，Rideout 等[36]证
明了Rag2基因缺失的ESCs可通过同源重组得以修
复，再通过HoxB4 的过量表达形成可移植性造血前
体细胞，治疗小鼠由于 Rag2 缺失而导致的免疫性
缺陷。然而，由于HoxB4 不能有效地诱导ESCs 生
成永久造血细胞，且其过量表达导致 HSC 分化偏
斜，形成过多粒系gr1+细胞(>80%, 而正常小鼠粒系
为20% 左右)。同一实验室的Wang 等[37]在 EB 发育
过程中条件诱导Cdx4 基因表达，结合HoxB4，形
成的ESC-HSC 在移植后有较为平衡的血液系统系谱
分布，并通过克隆实验，首次证明了可移植性ESC-
HSC 的存在。如果从ESCs 算起，按这种方法，在
分化的第6天，每1万个ESCs可以形成约250万个
第6 天的EB 细胞，再经过OP9 共培养10 － 14 d，
最终可获得5 亿个血细胞，足够250 只小鼠的移植
实验。
当然目前这种方法仍存在需改善之处。首先，
Cdx4及HoxB4的过量表达是通过基因水平上的直接
改变，在未来的基因治疗中存在潜在的危险，将来
应探索小分子诱导或蛋白转移等非基因修饰的方
法；其次，这种方法得到的 ESC-H S C 移植小鼠，
其造血系统系谱分布与骨髓移植对照仍有一定的差
距，尚需改进；另外，移植实验需100 万－200 万
细胞方能得到较好的效果，证明移植细胞群中
HSCs 比例仍偏低，特异性表面抗原的确定将有助
于ESC-HSC 的富集，且减少未完全分化细胞移植后
形成畸胎瘤的危险性。
2.2　人胚胎干细胞向造血干细胞分化　与小鼠ESCs
血分化系统相比，人类ESC-HSC 的研究远远落后。
Kaufman等[38]在2001年报告人类ESC(hESC)与小鼠骨
髓基质细胞S17或卵黄囊内皮细胞C166共培养17 d，
不需任何生长因子，可自发分化形成CD34+ 造血前
体细胞，诱导效率1% － 2%。在此之后的多个研究
亦使用了不同的基质细胞来促进hESC的血分化，包
括 OP9、M210-B4、FH-B-hTERT、AM20.1B4 人
及鼠骨髓基质细胞等[25,39-42]。研究表明，这些基质
细胞分泌血分化所需的细胞因子。Lako实验室报道
AM20.1B4 分泌TGF-β，与hESC 的共培养可提高造
血细胞的生成[39]。最近亦有报道Wnt 在 hESC 血分
化中亦起重要作用[43]。直接从分化的EB 分离HSC
的方法亦被尝试。尽管hESC 的 EB分化与小鼠有差
别，来自Elefanty及Zandstra实验室的研究强调通
过EB分化的血发生条件较稳定，重复性较高[44-47]。
有多个实验室采用HoxB4过表达的方法来促进hESC
从原始造血细胞成为可移植性血细胞，但收效甚
微，证明了我们对 Hox 家族的功能仍未完全了解，
hESC的血发生机制与小鼠不同[26,48,49]。
hESC 血分化在早期的研究多局限于体外实验，
在2005年才有第一例hESC-HSC 移植裸鼠成功的报
道[26]。在此研究中，从分化10 d的 EB中分离出来
的 CD45-/PFV 细胞(CD45-/PECAM-1+/Flk-1+/
Vecadherin+)为血液及内皮细胞的祖细胞，经成血细
胞因子(SCF、G-CSF、Flt3-配体、IL-3、IL-6等)
诱导后，直接通过髓腔注射移植入经放射处理的
NOD/SCID 小鼠体内，受体小鼠的注射髓腔中在移
植8 周后仍可检测到包括红系、粒系及淋系等血细
胞，但嵌合率< 1 % ( 而人脐带血移植小鼠可达到
10%)，且在其他未注射细胞的骨髓腔无人血细胞的
存在，证明这些hESC 来源的血细胞不能正常地通
过血循环迁移。研究还发现，通过静脉注射移植的
血细胞易凝集，造成肺栓塞。
最近的两个研究均采用hESC 与基质细胞共培
672 生命科学：干细胞研究专刊 第21卷
养的方法[25,39]，这种方法得到的造血前体细胞可通
过静脉注射移植小鼠而未有肺栓塞的发生。而且，
当通过髓腔注射时，造血系统的重建不仅局限于接
受注射的髓腔，对侧骨腔也可检测到人源血细胞，
嵌合率也较前有所提高(2%)，最为重要的是移植后
3 －6 月仍可检测到人源血细胞。Tian 等[41]认为，
与脐带血中CD34+ 细胞相比，hESC 来源的CD34+ 细
胞的MHC-I 的表达较低。而确有报道表明这些小鼠
体内尚存在少量NK细胞。使用asialo GM1 (ASGM1)
的抗血清可以完全消除NK 细胞的存在，提高hESC
来源的血细胞在受体内的存活率。Ledran等[39]将从
小鼠 A G M 和胎肝中分离得到的原代基质细胞与
hESC 共培养，以促进 hESC 的血分化，CD34 + 细
胞在hESC 分化的18 － 21 d 达到高峰，诱导率比
以往报道的方法提高了至少31%。但是同样是这个
区域来源的基质细胞系就不能达到这样高的诱导
率，说明原代的基质细胞具有更强的诱导作用。研
究人员亦改变了移植系统，将未分选的细胞移植到
NOD/SCID/IL2Rag2r c-/- 小鼠体内，移植率比以前
大有提高，可以在末梢血检测到 16 % 的嵌合率。
目前，hESC-HSC 的研究还存在许多需要解决
的问题。人们主要应用 CD34 来富集 hESC-HSC，
但所得移植效果不甚理想。Ledran 等[39]的研究在
CD34表达最高峰的分化时期收集移植未经分选的细
胞，取得了高移植效率，CD34 是否确为hESC-HSC
最理想的表面富集抗原值得进一步探讨。其次，尽
管hESC-HSC 的研究已取得了突破性进展，但其移
植效率仍不理想。移植最长时间仅为 3 － 6 个月，
且嵌合率低，多局限于骨髓，二级移植后嵌合率进
一步下降，如Ledran 等[39]的研究表明，外周血的
嵌合率从一级受体的16% 降至 2.7%，部分原因可
能是由于hESC-HSC 的实验模型为免疫缺陷小鼠的
异种移植，给研究增加了难度。目前亦有一些实验
室尝试其他动物模型，如胚胎羊及鸡卵[50,51]，但尚
无突破性进展。另外，hESC-HSC 在骨髓的嵌合率
大多<1%，可能与这些 hESC- H S C 的原始特性有
关，目前的培养条件还不能使它们完全分化成熟为
可移植性血干细胞，因而优化诱导条件，使用小分
子或基因改变等方法将有助于永久造血细胞的形成。
3　展望
ESCs 的全能性以及无限增殖的能力使它们成
为细胞替代治疗很有前途的资源，可以解决器官捐
献短缺等问题。ESCs 定向分化为HSCs 可以替代骨
髓、脐带血等传统的 HSCs，为基因治疗开辟了新
的领域，而且扩大了HSCs 移植的应用范围。但是
这种方法仍然存在免疫排斥的问题。未分化的
ESCs 不表达 MHC-2，表达少量的 MHC-1，但是随
着在体外或体内的分化，MHC-1 的表达会上调，所
以仅是未分化的ESCs和它早期的分化细胞才具有免
疫赦免的特性，所以形成的 HSCs 还是会引起受体
的免疫排斥。利用体细胞核转移入卵细胞的方法建
立患者特异性的ESCs 系可解决这一问题，但这种
方法尚存在伦理方面的争论，而且没有足够的人卵
细胞做核转移受体。最近研究发现，体细胞可直接
诱导成为多能干细胞(induced pluripotent stem cells,
iPS细胞)，形成患者特异的自体干细胞，避免免疫
排斥的问题。目前iPS细胞在小鼠的疾病模型中已
被证明可分化形成血细胞，治疗血液系统疾病[52]。
尽管iPS 研究中的技术细节有待于进一步的探讨，
毋庸置疑，iPS的建立将为HSCs在血液系统疾病的
治疗研究开拓更为广阔的前景。
[参　考　文　献]
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