全 文 ：第 １４卷第 １期
２０１６年 １月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １４ Ｎｏ􀆰 １
Ｊａｎ􀆰 ２０１６
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１６􀆰 ０１􀆰 ００３
收稿日期：２０１５－０６－０９
基金项目：国家杰出青年科学基金（２１０２５６２５）；国家重点基础研究发展计划（９７３ 计划） （２０１３ＣＢ７３３６０２）； 国家高技术研究发展计划（８６３ 计
划）（２０１２ＡＡ０２１２０３）；国家自然科学基金（２１１０６０７０、２１３７６１１８）
作者简介：童　 鹏（１９９０—），男，江苏南通人，研究方向：分子生物学；应汉杰（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｙｉｎｇｈａｎｊｉｅ＠ ｎｊｔｅｃｈ．ｅｄｕ．ｃｎ
大片段两步同源重组敲除节杆菌肌酐酸脱氢酶
基因质粒的构建
童　 鹏，李　 楠，牛欢青，柳　 东，郭　 亭，应汉杰
（南京工业大学 生物与制药工程学院 材料化学工程国家重点实验室，江苏 南京 ２１０００９）
摘　 要：构建一种新型的含有大片段同源臂的重组质粒用来对节杆菌进行代谢工程的改造。 使用 ＰＣＲ扩增线性化载体
片段，并通过酶切获取同源重组大片段，利用一步克隆技术将上述两片段连接起来；通过 ＰＣＲ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ将目标基因替
换，并利用酶切自连将插入的片段删除，最后成功得到目标质粒 ｐＵＫ ｄＩＭＰ。 构建的质粒通过 ２次同源重组将目的基因
肌酐酸脱氢酶（ＩＭＰＤＨ）成功敲除，且最后菌株不含有任何抗性，开辟了一种针对节杆菌而言新型的基因改造方法。 其中
ＩＭＰＤＨ基因缺失的菌株积累目标产物环磷酸腺苷的能力比对照菌株高 ４９􀆰 ７％，达到了（９􀆰 ０１±０􀆰 ２０） ｇ ／ Ｌ。
关键词：节杆菌；环磷酸腺苷；同源重组；基因敲除
中图分类号：Ｑ７８４　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１６）０１－００１４－０５
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｔｏ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｔｈｅ ｉｎｏｓｉｎｅ ５′⁃ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｂｙ ｔｈｅ ｌａｒｇｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｔｗｏ⁃ｓｔｅｐ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ􀆰
ＴＯＮＧ Ｐｅｎｇ，ＬＩ Ｎａｎ，ＮＩＵ Ｈｕａｎｑｉｎｇ，ＬＩＵ Ｄｏｎｇ，ＧＵＯ Ｔｉｎｇ，ＹＩＮＧ Ｈａｎｊｉｅ
（Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ⁃Ｏｒｉｅｎｔｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１０００９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ｎｅｗ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａ ｌａｒｇｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ａｒｍ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｆｏｒ
ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．． Ａ ｌｉｎｅａｒ ｖｅｃｔｏｒ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ａｎｄ ａ ｌａｒｇｅ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ａｂｏｖｅ ｔｗｏ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ
ｌｉｇａｔｅｄ ｔｏｇｅｔｈｅｒ ｂｙ ｏｎｅ ｓｔｅｐ ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｒｅｐｌａｃｅｄ ｂｙ ＰＣＲ⁃ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ
ｔｈｅ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｗａｓ ｄｅｌｅｔｅｄ ｂｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｌｆ⁃ｌｉｇａｔｉｏｎ． Ｆｉｎａｌｌｙ， ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ
ｐｌａｓｍｉｄ ｐＵＫ⁃ｄＩＭＰ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ． Ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｉｎｏｓｉｎｅ ５′⁃ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＩＭＰＤＨ）ｗａｓ
ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｋｎｏｃｋｏｕｔｅｄ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ ｂｙ ｔｗｏ⁃ｓｔｅｐ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｔｈｅ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｈａｄ ｎｏ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ． Ｗｅ ｃｒｅａｔｅｄ ａ ｎｅｗ ｔｙｐｅ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．． Ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｉｏｎ ｏｆ ＩＭＰＤＨ ｇｅｎｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｓｔｒａｉｎ，ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｔｈｅ ｔａｇｅｔ ｐｒｏｄｕｃｔ ｃＡＭＰ
ｒｅａｃｈｅｄ （９􀆰 ０１±０􀆰 ２０） ｇ ／ Ｌ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ４９􀆰 ７％ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．； ｃｙｃｌｉｃ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ （ ｃＡＭＰ ）； ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ；
ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋ⁃ｏｕｔ
　 　 环磷酸腺苷（ｃｙｃｌｉｃ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ⁃３′，５′⁃ｍｏｎｏｐｈｏｓｐ⁃
ｈａｔｅ，ｃＡＭＰ）是一种具有细胞内信息传递作用的小
分子，被称为第二信使，在生物体内广泛存在［１－２］，
对糖代谢、脂肪代谢、核酸合成、蛋白质合成以及细
胞分化、癌变、逆转等多种生理生化过程具有重要
的调控作用［３－５］。
作为细胞内的第二信使，ｃＡＭＰ 的生物合成受
到严格的代谢调控［６］。 为使其过量积累，只有运用
代谢工程的手段，去除代谢通路中不必要的分支途
径，促使碳流流向目的产物积累的方向；或者切除
产物的分解途径，避免发酵过程中产物的降解［７］。
肌苷酸作为鸟苷酸循环和腺苷酸循环的节点，也是
嘌呤核苷酸合成的核心，起到代谢流分配的作用。
有文献报道，去除鸟苷酸支路可以有效地促进腺苷
酸循环支路的代谢流量［８］。 笔者所在实验室保存
的一株节杆菌（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ􀆰 ＣＧＭＣＣ ３５８４）能够
高产 ｃＡＭＰ，但是到目前为止，对节杆菌的基因操作
报道较少，且代谢改造过程也较为困难。 线性化同
源重组对基因插入失活有效，但重组效率较低，也
是目前对节杆菌敲除改造的唯一方法。 因此，迫切
需要构建一种新型的同源重组敲除质粒对节杆菌
进行代谢工程的改造。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 菌株及质粒
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α、 Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ􀆰 ＣＧＭＣＣ
３５８４（ＡＲ）为笔者所在实验室保藏，ｐＡＲＫ 质粒由本
实验自行设计合成，ＢＷ２５１１３（含 ｐＩＪ７９０ 质粒）菌
株、ｐＩＪ７７３质粒由武汉大学药学院瞿旭东教授惠赠。
１􀆰 ２　 主要试剂
一步克隆试剂盒，南京诺唯赞生物科技有限公
司；细菌基因组提取试剂盒、限制性内切酶等，
ＴａＫａＲａ公司。
１􀆰 ３　 引物设计
本实验所用引物见表 １。
１􀆰 ４　 大片段的获取
按照细菌基因组提取试剂盒的方法，提取节杆
菌基因组 ＤＮＡ。 在目的基因两端选择相应的酶切
位点，使得目的基因尽量处于中间位置。 用选择的
限制性内切酶酶切节杆菌基因组，得到包含目的基
因的大片段（＞１０ ｋｂ），经异丙醇沉淀、浓缩后，用灭
菌的去离子水溶解。
１􀆰 ５　 线性化同源载体的扩增
以 ｐＡＲＫ质粒为模板，使用表 １中引物，扩增不
含节杆菌复制原点 ｐＣ Ｇｏｒｉ 的线性化质粒。 线性化
载体两端各含 ５０ ｂｐ 同源序列，与包含肌酐酸脱氢
酶（ＩＭＰＤＨ）基因的大片段匹配。
表 １　 本实验所用引物
Ｔａｂｌｅ １　 Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ
用途 引物 序列
扩增与包含
ＩＭＰＤＨ基因
的基因组大
片段发生
ｆｕｓｉｏｎ的线性
化载体
ＩＭＰ ｆｕｓｉｏｎ Ｆ
ＧＡＣＡＣＴＣＧＧＡＣＣＴＣＴＣ⁃
ＣＴＴＣＴＴＣＧＴＣＡＧＣＡＡＡ⁃
ＴＴＣＧＴＧＧＡＣＴＧＧＡＡＡ⁃
ＧＣＴＣＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＡＴ⁃
ＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴＧ
ＩＭＰ ｆｕｓｉｏｎ Ｒ
ＣＡＧＧＣＡＡＴＣＣＣＧＧＣＴ⁃
ＡＣＴＧＣＡＡＡＡＡａＴＧＧＧ⁃
ＣＣＧＧＣＣＣＣＧＧＧＧＡＴＧ⁃
ＡＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＧＣＡ⁃
ＣＡＧＴＣＧＴＧＡＴＧＧＣＡ
扩增替换
ＩＭＰＤＨ基因
的片段
ＩＭＰ ｔａｒｇｅｔ Ｆ
ＣＴＣＣＴＧＣＣＴＧＧＡＣＡＣＡ⁃
ＣＣＧＡＧＧＴＣＡＴＣＣＣＧＴＣ⁃
ＧＧＡＧＧＣＴＡＣＴＡＧＴＡＴ⁃
ＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧ⁃
ＡＣＣ
ＩＭＰ ｔａｒｇｅｔ Ｒ
ＧＡＣＧＧＴＣＡＴＣＴＧＧＡＴ⁃
ＡＴＣＧＴＧＣＧＧＧＴＧＣＧＡ⁃
ＴＴＣＣＴＴＣＡＧＡＣＴＡＧＴＴ⁃
ＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣ⁃
ＴＴＣ
１􀆰 ６　 利用一步克隆技术连接线性化载体与大片段
根据一步克隆试剂盒操作，在 ２０ μＬ反应体系中
加入线性化克隆载体约 １００ ｎｇ、同源重组大片段约
３００ ｎｇ。 混匀，３７ ℃反应 ３０ ｍｉｎ后立即置于冰水浴 ５
ｍｉｎ。 取 ２０ μＬ冷却反应液转化大肠杆菌 ＤＨ５α，将培
养菌液 ８ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 １ ｍｉｎ收集菌体，全涂于卡那
抗性平板，３７ ℃培养 １２ ｈ 后，菌落 ＰＣＲ 检验是否含
有目的基因，阳性克隆命名为 ｐＵＫ ｇＩＭＰ。
１􀆰 ７　 ＰＣＲ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ替换目的基因
取 ｐＵＫ ｇＩＭＰ 质粒 １ μＬ，按照钙转法转化
ＢＷ２５１１３ ／ ｐＩＪ７９０感受态细胞。 验证正确后，进一步
制成感受态。
感受态细胞制备：３０ ℃平板活化；挑单菌落至 ５
ｍＬ ＬＢ 培养基（含氯霉素 ２５ μｇ ／ ｍＬ、卡那霉素 ５０
μｇ ／ ｍＬ），３０ ℃过夜（ＯＤ６００约为 ３～４）；转接１００ μＬ～
１０ ｍＬ ＬＢ 培养基（含阿拉伯糖 １０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ、氯霉素
２５ μｇ ／ ｍＬ、卡那霉素 ５０ μｇ ／ ｍＬ），３０ ℃培养３～ ４ ｈ
５１　 第 １期 童　 鹏等：大片段两步同源重组敲除节杆菌肌酐酸脱氢酶基因质粒的构建
左右，至 ＯＤ６００约为 ０􀆰 ４；４ ℃、４ ０００ｇ 离心 ５ ｍｉｎ，收
集菌体；弃上清，加入预冷的 １０％甘油，洗涤菌体；
重复一次；用 １００ μＬ 冰冷的 １０％甘油（体积分数）
重悬菌体，分装成 ２管，作为电转感受态。
以 ｐＩＪ７７３ 质粒为模板，使用表 １ 中引物，ＰＣＲ
扩增带同源序列的安普霉素抗性基因。 经异丙醇
沉淀、浓缩后，用灭菌的去离子水溶解。
ＰＣＲ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ 替换目的基因方法：取 ２ μＬ
ＰＣＲ 回收片段，加入 １００ μＬ 感受态细胞，混匀，
２ ５００ Ｖ （２ ｍｍ），电击；立即加入 １ ｍＬ ＬＢ，３７ ℃复
苏 １ ｈ；离心，涂 ５０ μｇ ／ ｍＬ卡那霉素和 ５０ μｇ ／ ｍＬ 安
普霉素双重抗性平板。 转化子提质粒，ＰＣＲ 验证，
阳性克隆命名为 ｐＵＫ ｇＩＭＰ ＡＰ。
１􀆰 ８　 删除插入片段
用 ＳｐｅＩ酶切阳性克隆质粒 ｐＵＫ ｇＩＭＰ ＡＰ，去
除安普霉素抗性基因；胶回收大片段后，自连环化，
转化 ＤＨ５α感受态。 提质粒验证，阳性克隆命名为
ｐＵＫ ｄＩＭＰ。
１􀆰 ９　 发酵方法及代谢产物分析
本文的发酵方法参照文献［９］的节杆菌发酵条
件，并作 ３组平行。 细胞生长情况是通过紫外分光光
度计测定波长 ６６０ ｎｍ处的吸光值判定的，细胞干质
量（ＤＣＷ，ｇ ／ Ｌ）是由 ＤＣＷ 与 ＯＤ６６０测定的标准曲线
（ＤＣＷ＝０􀆰 ０２０ １＋０􀆰 ５３２ ３×ＯＤ６６０）换算得到的。 培养
基中的产物 ｃＡＭＰ 用高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）检测，
色谱柱为江苏淮阴汉邦科技有限公司的 Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｃ１８
（４􀆰 ６ ｍｍ×２５０ ｍｍ，５ μｍ），流动相为 ｐＨ ６􀆰 ６的磷酸三
乙胺溶液和甲醇混合溶液，体积比 ７５ ∶ ２５，紫外检测
波长为 ２５４ ｎｍ，进样量为 ２０ μＬ，流速为 ０􀆰 ８ ｍＬ ／ ｍｉｎ，
柱温为室温。 发酵液中葡萄糖检测采用 ３，５ 二硝基
水杨酸法（ＤＮＳ 法），ｐＨ 采用ｐＨＳ ３Ｃ 型数显 ｐＨ 计
（美国丹佛仪器有限公司）检测。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 节杆菌基因组的提取
为了从基因组上抓取包含目的基因的大片段，需
要高浓度的基因组 ＤＮＡ，通过基因组提取试剂盒提取
节杆菌基因组电泳结果如图 １所示。 图 １显示所提取
基因组较完整，且浓度高，经测定为 １􀆰 ３４９ ｍｇ ／ ｍＬ。
２􀆰 ２　 线性化载体扩增及基因组酶切结果
对基因组序列分析发现，可用 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ 单酶切
节杆菌基因组 ＤＮＡ，并通过线性化载体扩增得到包
含 ＩＭＰＤＨ基因的 １５􀆰 ７ ｋｂ片段，结果见图 ２。
１—基因组 ＤＮＡ； ２—ＤＬ１０ ０００ Ｍａｒｋｅｒ
图 １　 Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ􀆰 ＣＧＭＣＣ ３５８４基因组 ＤＮＡ提取
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｆｒｏｍ
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ􀆰 ＣＧＭＣＣ ３５８４
１—Ｈｉｎｄ ＩＩＩ酶切基因组 ＤＮＡ； ２—ＩＭＰ ｆｕｓｉｏｎ Ｆ和
ＩＭＰ ｆｕｓｉｏｎ Ｒ扩增线性化载体； Ｍ—ＤＬ１０ ０００ Ｍａｒｋｅｒ
图 ２　 基因组酶切和线性化载体扩增结果
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｎｅａｒ ｖｅｃｔｏｒ
２􀆰 ３　 一步克隆技术连接线性化载体与大片段
　 根据线性化载体上的卡那霉素抗性基因筛
选发生重组的转化子。 提取质粒如图 ３ 所示，根据
质粒大小，初步判断 １ 号和 ３ 号为所需的 ｐＵＫ
ｇＩＭＰ 重组质粒。
将提取质粒进行 ＰＣＲ验证，考察是否为包含目
的基因的大片段重组质粒，结果如图 ４ 所示。 由图
４可知，１号和 ３ 号分别与阳性对照一致，且条带较
亮，为正确克隆。
２􀆰 ４　 ＰＣＲ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ替换目的基因结果
２􀆰 ４􀆰 １　 ＰＣＲ扩增线性化片段
为了便于 ＰＣＲ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ 后的筛选，一般是扩
６１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
１～５—ｐＵＫ ｇＩＭＰ 重组质粒；Ｍ—ＤＬ１０ ０００ Ｍａｒｋｅｒ
图 ３　 重组质粒的初步验证
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ
１～５—ｐＵＫ ｇＩＭＰ 质粒 ＰＣＲ；６—基因组酶切回收片段
ＰＣＲ阳性对照；Ｍ—ＤＬ１０ ０００ Ｍａｒｋｅｒ
图 ４　 重组质粒 ＰＣＲ验证
Ｆｉｇ􀆰 ４　 ＰＣＲ ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ
增出一段与质粒上不同的抗性基因，此处选择的是
来自 ｐＩＪ７７３ 质粒的安普霉素抗性基因。 图 ５ 为
ＰＣＲ扩增安普霉素抗性基因的结果。 由图 ５ 可知：
ＰＣＲ扩增条带大小为 １􀆰 ５ ｋｂ 左右，与目的片段相
符，且特异性较好。
２􀆰 ４􀆰 ２　 ＰＣＲ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ替换目的基因结果
将回收得到的安普霉素抗性基因，电转入已经
包含大片段同源重组质粒的大肠杆菌 ＢＷ２５１１３，替
换质粒上的目的基因序列，命名为 ｐＵＫ ｄＩＭＰ
ＡＰ。 电转化后，在卡那霉素和安普霉素双重抗性平
板上挑选转化子，提质粒进行 ＰＣＲ 验证，结果见图
６。 由图 ６可知，转化子结果均为阳性。
２􀆰 ４􀆰 ３　 去除安普抗性的结果
为了使同源重组敲除目的基因后，不引入外加
１—ＰＣＲ ｆｒａｇｍｅｎｔ； Ｍ—ＤＬ５ ０００ Ｍａｒｋｅｒ
图 ５　 ＰＣＲ扩增安普霉素抗性基因
Ｆｉｇ􀆰 ５　 ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｒａｍｙｃｉｎ
ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ
１—ｐＵＫ ｄＩＭＰ ＡＰ 质粒 ＰＣＲ；Ｍ—ＤＬ５ ０００ Ｍａｒｋｅｒ
图 ６　 质粒 ＰＣＲ验证
Ｆｉｇ􀆰 ６　 ＰＣＲ ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ａｆｔｅｒ
ＰＣＲ⁃ｔａｒｇｅｔｉｎｇ
抗性，需要将同源臂内部的安普霉素抗性基因去
除。 引物设计时，在安普霉素抗性基因两侧加入了
ＳｐｅＩ酶切位点，可以通过酶切、自连的方式，去除质
粒上的抗性基因。 提质粒进一步验证，得到最终所
需的 ｐＵＫ ｄＩＭＰ 新型同源重组质粒，过程如图 ７所
示。 经 ＰＣＲ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ后，目的基因内部部分缺失，
ｐＵＫ ｄＩＭＰ 阳性质粒应扩增出约 ６７０ ｂｐ条带，如图
８所示。 送金唯智公司测序后显示序列正确，表明
敲除质粒 ｐＵＫ ｄＩＭＰ 构建成功。
本文构建的质粒属于无痕敲除质粒的一种，即在
敲除某一基因后，基因组不会残留任何外源片段，不
会影响对该菌株的后续分子实验改造，可以利用该技
术连续进行多个基因敲除。 因此以该敲除质粒为原
７１　 第 １期 童　 鹏等：大片段两步同源重组敲除节杆菌肌酐酸脱氢酶基因质粒的构建
型构建类似重组质粒，尝试对节杆菌进行 ２个或以上 的基因敲除，以期对代谢通路进行系统的改造。
图 ７　 新型同源重组质粒构建流程
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｔｈｅ ｆｌｏｗ ｃｈａｒｔ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ
１～４— ｐＵＫ ｄＩＭＰ 质粒 ＰＣＲ验证；Ｍ—ＤＬ５ ０００ Ｍａｒｋｅｒ
图 ８　 ＰＣＲ验证新型同源重组质粒
Ｆｉｇ􀆰 ８　 ＰＣＲ Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ
２􀆰 ５　 敲除菌株发酵实验
想要得到 ＩＭＰＤＨ 基因缺失的菌株就必须经过
２次同源重组，一般来说，２ 个片段之间同源序列越
长，发生同源重组的几率就越高［１０］。 普通分子操作
一般使用 ５００ ｂｐ左右的同源臂，这对于节杆菌这种
同源重组效率很低的菌株并没有很好的效果。 因
此为了快速、高效的筛选到目的基因敲除的重组
子，需要尽可能延长敲除质粒的同源臂。 然而常
规的构建方法是通过聚合酶链式反应来获得同源
臂，受到 ＤＮＡ 聚合酶保真度和测序长度的限制，
无法获得太长的同源序列。 而按照本文方法，可
以快速、有效的从基因组上抓取包含目的基因的
大片段，将同源臂长度增加至 １０ ｋｂ以上。 将构建
的新型大片段敲除质粒电转节杆菌，只经过 ３ 轮
的松弛就得到了不含抗性的 ＩＭＰＤＨ 基因缺失菌
株 ＡＲ ｄＩＭＰ，大大提高了发生同源重组的效率。
敲除菌株与出发菌株经摇瓶发酵 ７２ ｈ后测定细胞
生物量（ＤＣＷ）、残糖、ｃＡＭＰ 产量，结果如表 ２ 所
示。 由表 ２ 可知，发酵结束时培养基中葡糖糖均
已耗完，敲除菌株 ＡＲ ｄＩＭＰ 发酵液比出发菌株略
显碱性，敲除菌株的 ｃＡＭＰ 积累量达到了（９􀆰 ０１±
０􀆰 ２０） ｇ ／ Ｌ，比出发菌株的（６􀆰 ０８±０􀆰 １５） ｇ ／ Ｌ 提高
了 ４９􀆰 ７％，由此可见敲除节杆菌 ＩＭＰＤＨ 基因对菌
株积累 ｃＡＭＰ 有很大的影响。
表 ２　 发酵实验结果
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
菌株 生物量 ／（ｇ·Ｌ－１） ｐＨ
ρ（残糖） ／
（ｇ·Ｌ－１）
ρ（ｃＡＭＰ） ／
（ｇ·Ｌ－１）
ＡＲ １０􀆰 １９±０􀆰 ６０ ７􀆰 ２２±０􀆰 ０５ ４０±０􀆰 ０１ ６􀆰 ０８±０􀆰 １５
ＡＲ ｄＩＭＰ １０􀆰 ５３±０􀆰 ５０ ８􀆰 ８７±０􀆰 ０５ ４０±０􀆰 ０１ ９􀆰 ０１±０􀆰 ２０
（下转第 ３５页）
８１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
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ｐｒｏｔ５５４５．
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［１５］ 　 易弋，容元平，程谦伟，等．不同破壁方法提取酵母菌总 ＲＮＡ
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［１６］ 　 ＢＲＡＤＦＯＲＤ Ｍ Ｍ． Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ
ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｇｒａｍ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ
ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ⁃ｄｙｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ［ Ｊ］ ． Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ， １９７６， ７２
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Ｐｉｃｈｉａ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ［Ｍ］．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００７：２０３⁃２１８．
（责任编辑　 荀志金）
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３　 结论
本文构建的包含大片段的同源重组质粒 ｐＵＫ
ｄＩＭＰ 通过 ２次同源重组将目的基因肌酐酸脱氢酶
（ＩＭＰＤＨ）成功敲除，由于是无痕敲除技术，所以最
后菌株不含有任何抗性，开辟了一种针对节杆菌而
言新型的基因改造方法。 通过几批发酵实验，其中
ＩＭＰＤＨ基因缺失的菌株积累目标产物 ｃＡＭＰ 的能
力比对照菌株高 ４９􀆰 ７％，达到了（９􀆰 ０１±０􀆰 ２０） ｇ ／ Ｌ，
为国内 ｃＡＭＰ 的工业化生产奠定了基础。
参考文献：
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ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ｃｅｌｌｕａｒ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ， ＡＴＰ， Ｍｇ２＋ ａｎｄ
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ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ ａｎｄ ｇｌｕｃａｇｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｉｎ
ｌｉｖｅｒ ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅｓ［Ｊ］ ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９５７，２２４：４６３⁃４７５．
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ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ：ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ′ｓ
ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］ ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ，２００５，３３：１３３０⁃１３３２．
［ ５ ］ 　 ＭＯＵＴＩＮＨＯ Ａ，ＨＵＳＳＥＹ Ｐ Ｊ，ＴＲＥＷＡＶＡＳ Ａ Ｊ，ｅｔ ａｌ．ｃＡＭＰ ａｃｔｓ
ａｓ ａ ｓｅｃｏｎｄ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ｉｎ ｐｏｌｌｅｎ ｔｕｂｅ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｒｅｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ
［Ｊ］ ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００１，９８：１０４８１⁃１０４８６．
［ ６ ］ 　 ＭＥＹＥＲ Ｅ， ＳＷＩＴＺＥＲ Ｒ Ｌ． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ
ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｍｉｄｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
ｂｙ ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ［Ｊ］ ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９７９，２５４：５３９７⁃５４０２．
［ ７ ］ 　 胡逢雪，丁锐，崔震海，等．大肠杆菌基因无痕敲除技术及策
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［ ８ ］ 　 ＰＡＳＴＡＮ Ｉ， ＡＤＨＹＡ Ｓ． Ｃｙｃｌｉｃ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ５′⁃ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｎ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ［Ｊ］ ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ Ｒｅｖ，１９７６，４０：５２７⁃５５１．
［ ９ ］ 　 ＣＨＥＮ Ｘ Ｃ，ＳＯＮＧ Ｈ，ＦＡＮＧ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｙｃｌｉｃ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ
ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ Ａ３０２ ｔｈｒｏｕｇｈ ｒａｔｉｏｎａｌ
ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｆｌｕｘ［Ｊ］ ．Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ Ｔｅｃｈｎｏｌ，２０１０，１０１：
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［１０］ 　 ＣＨＡＮＥＲＯＣＨＥ Ｍ Ｋ， ＧＨＩＧＯ Ｊ Ｍ， Ｄ′ ＥＮＦＥＲＴ Ｃ． Ａ ｒａｐｉｄ
ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｕｓ
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ ［ Ｊ ］ ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ２０００， ２８
（２２）：ｅ９７．
（责任编辑　 周晓薇）
５３　 第 １期 卢俊文等：玻璃珠破碎毕赤酵母条件的优化