全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 10期
藤黄节杆菌 1, 3葡聚糖酶基因在大肠
杆菌中的克隆及表达
薛伟 1 罗晖 1 常雁红 2 苏厚波 1, 2 孙远兴1, 2
( 1北京科技大学生物科学与技术系,北京 100083; 2北京科技大学环境工程系,北京 100083)
摘 要: 以藤黄节杆菌基因组为模板, 克隆获得 1, 3葡聚糖酶基因, 分别构建至原核表达载体 pET28a ( + )与
pBAD18上,诱导获得高效表达, 粗酶液对酵母多糖的裂解活性达到 161 U /mL。在裂解酵母试验中,粗酶液也表现出较高的活
性。研究中得到一株突变株, 其对于研究 1, 3葡聚糖酶在裂解酵母中多糖结合域的地位和作用有着重要的价值。
关键词: 藤黄节杆菌 1, 3葡聚糖酶 葡聚糖 酿酒酵母 增溶 裂解
Cloning and Expression of the 1, 3Glucanase from
Arthrobacter luteus inEscherichia coli
XueW e i
1 LuoH ui1 Chang Yanhong2 Su Houbo1, 2 Sun Yuanx ing1, 2
(
1
D epartm ent of Biology Science and T echno logy, University of Science and T echno logy, Beijing 100083;
2
D epartment
of Environm entalEngineering, University of Science and T echnology, Beijing 100083)
Abstrac:t The gene cod ing 1, 3g lucanase in A rthrobacter luteus genom e w as c loned into prokaryo tic vec to r pET28a( + ) and
pBAD18, and the he terogeneous pro tein w as successfully expressed in the recom binantE scherich ia co li. The endog lucanase ac tiv ity of
crude ex tract to lyse Zym osan A was about 161 U /mL. A lso, the v iable yeast ce lls cou ld be lysed by the crude extrac t e ffectively. Fur
therm o re, w e obta ined a mutant stra in that would be va luable for study ing the ro les o f1, 3g lucanase s carbohydrate b indingm odules
( CBM 13) in viable yeastlytic by enzym ic m ethod.
Key words: A rthrobacter luteus 1, 3G lucanase G lucan Saccharomyces cerevisiae So lub ilization Lytic
收稿日期: 20100324
基金项目:国家 ! 973∀计划课题 ( 2007CB714304)
作者简介:薛伟,男,硕士,主要从事分子酶学研究; Ema i:l room ofxw@ 163. com
通讯作者:罗晖,男,副教授,主要从事生物化工研究; Em a i:l luohu@i u stb. edu. cn
藤黄节杆菌 (Arthrobacter luteus )是一种可以裂
解活酵母细胞的放线菌, 其中 1, 3葡聚糖酶在裂
解过程中起着关键作用 [ 1]。酵母裂解后产生的酵
母 1, 3葡聚糖具有促免疫、抗肿瘤、抗感染等作
用,是一种活性强、毒副作用低的高效生物应答物。
但其水溶性差,直接使用会产生毒副作用和排异反
应,利用 1, 3葡聚糖酶对其进行酶解增溶,可以极
大地拓展其在医药、食品及化妆品等行业中的应
用 [ 2, 3]。此外 1, 3葡聚糖是酵母以及多数植物病
原真菌细胞壁的主要成分, 本文采用酵母为研究对
象对该葡聚糖酶裂解细胞壁的能力进行初步研究以
发掘该酶在酵母裂解和植物保护等工农业生产中的
应用潜力 [ 4]。
1 材料和方法
11 材料
111 菌种与质粒 大肠杆菌 Top10, DH 5, BL21
( DE3) , Rosetta ( DE3)及 pET28a载体为本实验室
保藏;藤黄节杆菌 ( ATCC 21606; CGMCC 11525 ),
酿酒酵母 ( CGMCC 21882)购自中国普通微生物菌
种保藏管理中心; pBAD18载体为日本 N ational In
stitute of Genetics馈赠。
112 酶和主要试剂 LA Taq, Xba I, H in d III,
BamH I, Nde I, T4连接酶, pMD 18T simp le, DL 2000
DNA M arker, DL 15000 DNA M arker均购自大连
2010年第 10期 薛伟等:藤黄节杆菌 1, 3葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的克隆及表达
TaKaRa公司; Zymosan A, L阿拉伯糖购自上海生
工; PageRuLerTM Prestained Prote in Ladder购自 Fer
mentas公司。
12 方法
121 引物设计和基因扩增 根据 G enB ank(登录
号 M 60826 )中 gl I的基因序列设计引物 P1: 5
cggaatca tatgcctcacgacaggaagaa3 和 P2: 5 cgctcag
ga tccgggcgcggtcagagcg t3 ,分别引入 BamH I和 Nde I
酶切位点 (下划线标出 ), 由三博远志公司合成。该
基因片段 G+ C含量大于 70% ,在扩增时需使用 GC
buffer I。Touch down PCR反应程序: 94# 30 s; 60-
50# 30 s (退火温度每个循环降低 1# ); 72# 2
m in;循环 10次; 94# 30 s; 50# 30 s; 72# 2m in;循
环 20次。使用 LA Taq及 GC bu ffer I进行 DNA扩
增。扩增产物用 0. 7%的琼脂糖凝胶电泳检测。
122 大肠杆菌表达质粒的构建 PCR产物与
pMD18T simp le连接后, 蓝白斑筛选阳性克隆送
TaK aR a测序, BLAST 确认扩增无误, 用 N de I和
BamH I双酶切后构建到 pET28a载体上。然后采
用 X ba I和H in d III将目的基因连同载体上的 RBS
由 pET28agl质粒上切下后, 构建到 pBAD 18载
体上。可以获得分别由 IPTG和阿拉伯糖诱导表
达的 pET28a( + ) g l与 pBAD18g l表达载体,
目的基因 N端融合有 H istag, 可以方便今后研究
和生产中目的蛋白的亲和纯化。质粒构建图谱见
图 1。
图 1 pET28a( + )gl与 pBAD18gl表达载体的质粒图谱
123 外源蛋白的诱导表达及产物鉴定 将
pBAD18g l质粒转化 DH5, 筛选阳性转化子, 培
养至 OD 600到 0. 4左右。取菌液 500 L转接至 15
mL选择性 LB培养基, 37# 下 200 r /m in振荡培养
至 OD600到 0. 6左右, 取 1 mL菌液作为诱导前样本
T0。加入 L阿拉伯糖至终浓度 10 mmo l/L, 30#
200 r /m in振荡培养, 分别于 2 h、4 h和 6 h处取样
本 T2、T4和 T6。离心收集菌体, 超声破碎, 使用
SDSPAGE检测目的蛋白的表达。此外构建的目的
蛋白 N端融合有 H istag, 因此采用W estern B lo tt ing
的方法使用抗 H istag抗体作为一抗,可以进一步鉴
定表达产物并验证 H istag是否融合正确。
124 目的蛋白的活性检测 将 Zymosan A用 50
mmo l /L的 T risHC l缓冲液 ( pH7. 5)进行重悬并使
OD 800在 10左右, 分别加入 50 L DH5/pBAD18
g l粗酶液, 100 L DH5/pBAD18g l粗酶液, 100
L Rosetta /pET28ag l菌粗酶液, 100 L T risHC l
缓冲液使得终体积达到 4 mL, 37# 振荡温育, 分别
于 0、5、15、30、60 和 120 m in 时 刻取样, 检
测 OD800 [ 5 ]。
酶活定义: 在 37# , pH7. 5的条件下, 反应 60
m in, 能使反应混和液吸光度 OD800值减少 50%的酶
量定义为 20个活力单位 ( 20 U nits) [ 6 ]。
125 酵母裂解活性检测 取过夜培养的酿酒酵
母菌液 2mL,离心后用磷酸盐缓冲液 ( 0. 01 mol /L,
pH 7. 5)重悬至 38 mL, 分装至 2个 15 mL离心管
内, ( 1) 19mL酵母 + 100 L DH5 /pBAD18g l粗
酶液 + 1 L巯基乙醇。 ( 2) 19 mL酵母 + 100 mL
PBS+ 1 L巯基乙醇。37# , 200 r/m in振荡温育,
分别于 0、15、30、60和 90 m in时刻取样, 检测
OD800, 做出酵母裂解试验活性曲线 [ 5 ]。
通过检测细胞内容物的释放情况, 进一步检测
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 10期
酿酒酵母裂解效果: 取过夜新鲜培养的酿酒酵母
2 mL,离心后用 PBS重悬至 2 mL, 分装到两个离心
管内, ( 1) 19 mL酵母 + 100 L DH5/pBAD18gl
粗酶液 + 1 L巯基乙醇。 ( 2 ) 19 mL酵母 + 100
L PBS+ 1 L巯基乙醇。 37# 振荡, 分别于 0, 15,
30, 45m in时刻取样,离心后取上清检测 OD280。
2 结果与讨论
21 g l基因的扩增及载体构建
以藤黄节杆菌提取的基因组 DNA为模板, 按照
方法 121扩增所得的 gl I基因全长 1 675 bp,
07%的琼脂糖凝胶电泳分析,特异性条带大小与预
期结果相符合 (图 2)。目的条带回收后与 pMD18T
simple连接测序,测序结果与 GenBank所报道的 gl
I序列一致。
将目的基因构建至 pET28a载体上, 在 N端设
计融合有 H istag, 命名为 pET28ag l。而后将融合
有 H istag的目的基因构建到 pBAD 18载体上命名
为 pBAD18g l。分别采用 Nde I和 BamH I双酶切
验证 pET28ag,l Xba I和 H in d III双酶切验证
pBAD18g l质粒,琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果,
证明 gl I重组质粒构建成功。
M. DL 2 000 DNA M arker; L1PCR产物
图 2 PCR扩增基因片段电泳图
22 目的蛋白诱导表达以及产物鉴定
目的基因片段中 G + C含量超过 70% , 并且含
有大量的脯氨酸稀有密码子 CCC,严重影响基因在
BL21( DE3)中的表达, 通过多次试验, 均无法检测
到目的基因在 BL21( DE3)中发生表达。因此采用
稀有密码子表达宿主 Rosetta( DE3)来表达 pET28a
g ,l并且同时采用 DH5表达 pBAD18g l。通过
SDSPAGE 蛋白电泳分析, 使用 L阿拉伯糖对
pBAD18gl质粒诱导 2 h即可以获得大量的外源
蛋白,而 Rosetta( DE3)表达外源蛋白量较少。电泳
中诱导表达的外源蛋白条带为 57 kD左右, 符合试
验预期。 pBAD18g l诱导表达 SDSPAGE电泳结
果见图 3。
M. PageRuLerTM Prestain ed Protein Ladder: 170、130、95、72、55、43、
34、26 kD; L1. T0样品; L2. T2样品; L3. T4样品; L4. T6样品
图 3 pBAD载体诱导表达外源蛋白
SDSPAGE电泳图
pBAD18g l和 pET28agl表达的目的蛋白 N
端均设计融合有 H istag, 因此采用W estern B lotting
方法利用抗 H istag抗体作为一抗可以进一步对所
表达的外源蛋白进行鉴定。W estern B lo tting结果表
明 (图 4) ,所表达的外源蛋白为本研究的目的蛋白,
并且 H istag融合成功,便于日后研究生产中对目的
蛋白的纯化。
23 重组酶对酵母多糖的降解特性
ZymosanA是由酿酒酵母细胞壁制备而来的
1, 3葡聚糖, 带有少量 1, 6葡聚糖、甘露聚糖以及
细胞壁蛋白质,完整保留了酿酒酵母细胞壁上葡聚
糖的结构,作为底物不但可以检测重组酶的葡聚糖
酶活性,也可以反应重组酶对酵母多糖的降解特性。
按照方法 124试验并绘制了重组酶对底物的反应
曲线 (图 5)。由图 5可知,加入酶液后底物的 OD800
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2010年第 10期 薛伟等:藤黄节杆菌 1, 3葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的克隆及表达
L1. DH 5 /pBAD18gl表达产物; L2. Roset ta /pET28agl
表达产物
图 4 Rose tta/ pET28agl和 DH5/ pBAD18gl
表达蛋白的组氨酸标签的 W estern B lotting检测
∃ 100 L转化 pET28a空载体菌株破碎液 (对照 ) ;
% 100 L T risHC l缓冲液; & 100 L Roset ta /pET
28 agl粗酶液; ∋ 50 L DH 5 /pBAD18g l粗酶液;
( 100 L DH 5 /pBAD18g l粗酶液
图 5 重组酶对 Zym osan A的降解活性
迅速下降, 在 60 m in内反应结束, 长时间反应后添
加新酶液 OD800不再下降, OD 800 = 0. 3为反应体系
的本底吸收,这意味着不溶的 1, 3葡聚糖转化为
水溶性 1, 3葡聚糖,余下的是不溶的蛋白质、甘露
聚糖等其它不溶物。仅加入 T risHC l缓冲液或者
pET28a空载体菌株的诱导破碎液的空白对照
OD 800基本无变化, 说明酵母聚糖不会发生自身降解
作用,所有的增溶效果均来自重组酶。由曲线斜率
也可以看出,加入的酶量增多则底物降解速度加快。
结合 SDSPAGE的结果, 证明 Rosetta /pET28agl
菌株的表达量与 DH5 /pBAD18g l相差较大。估
算 DH 5/pBAD18g l粗酶液的酶活达到 161 U /
mL,远高于环状芽孢杆菌的葡聚糖酶的 746 U /
mL
[ 6 ]。本研究中的重组酶对酵母多糖的高酶活表
明, 该酶在酵母多糖提取、酵母葡聚糖增溶以及细胞
壁破碎等方面有着相当大的应用潜力。
24 重组酶对酿酒酵母的裂解研究
以酿酒酵母为研究对象开展细胞裂解试验以研
究重组酶裂解酵母细胞壁的能力。按照方法 125
绘制重组酶对酵母裂解反应曲线 (图 6)。由图 6可
知, 反应体系中仅有 巯基乙醇存在时酿酒酵母基
若同时加入 1, 3葡聚糖酶则 OD800本不发生裂解,
急剧下降,酿酒酵母细胞发生大量裂解。通过测定
OD280检测酵母细胞内蛋白质的释放情况, 依此进一
步检测酵母的裂解效果。按照方法 125绘制酵母
内容物释放曲线,见图 7。由图 7可知, 对照反应体
系中仅有 巯基乙醇存在时 OD280基本不发生变
化,酵母细胞内的蛋白质没有释放出来。而加入粗
酶液后, OD280急剧上升,证明酵母细胞发生裂解致
使细胞内的蛋白质大量释放出来。此外,在对毕赤
酵母细胞的裂解试验中, 重组酶也表现出明显的裂
解活性。目的蛋白 C端的多糖结合域赋予重组酶
直接裂解活酵母细胞的特性 [ 7]。酵母细胞在发酵
工业上有着广泛的应用, 对于酵母细胞内产物的释
放, 人们通常采用机械破碎法或酵母自溶法进行细
胞裂解,这些方法存在着效率低或产物容易分解的
缺点,如果将该 1, 3葡聚糖酶引入酵母细胞的裂
解体系,将有可能大幅提高酵母细胞的破碎效果并
降低细胞破碎的成本。
& 100 L PBS+巯基乙醇;
∋ 100 L DH 5 /pBAD18g l粗酶液 +巯基乙醇
图 6 酵母细胞裂解反应曲线
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 10期
) 100 L PBS+巯基乙醇; % 100 L
DH 5 /pBAD18gl粗酶液 +巯基乙醇
图 7 酵母细胞内蛋白释放曲线
3 结论
本研究构建的 1, 3葡聚糖酶重组大肠杆菌
Rosetta /pET28ag l和 DH 5/pBAD18g l均可以
通过诱导的方式正确表达目的蛋白。稀有密码子的
存在严重影响目的蛋白在 BL21( DE3)菌株中的表
达,而以 DH5为宿主, L阿拉伯糖诱导 pBAD18
g l质粒则可获得大量的活性蛋白。采用酵母多糖
ZymoscanA作为底物检测酶活, 1%的粗酶液在 60
m in内可使 OD800下降超过 60% ,使反应之初不溶的
葡聚糖转化为水溶性的葡聚糖。本研究采用的
1, 3葡聚糖酶 C端具有独特的多糖结合域 ( carbohy
dra tebinding modu le)赋予其与众不同的酶学特性。
使其对不可溶葡聚糖的 Km大大降低, 甚至低于可
溶的葡聚糖,因此在增溶的同时又能保持葡聚糖的
聚合度,在增加葡聚糖水溶性的同时,尽可能保持它
的生物活性,相较于普通的 1, 3葡聚糖酶有着独
特的优势 [ 7, 8 ]。而在裂解酵母细胞方面, 本研究中
所得到的葡聚糖酶由于含有独特的多糖结合域,可
以直接作用于活酵母, 使其发生裂解并释放出内容
物。相较于其它需要采用复合酶的裂解方法, 不但
裂解速度上有着优势, 而且仅需单一的 1, 3葡聚
糖酶即可产生裂解效果, 不需要再添加诸如 1, 6
葡聚糖酶、甘露聚糖酶等酶, 可以减少操作环节,降
低生产成本。该酶对 1, 3葡聚糖较高的水解活性
以及裂解酵母细胞壁的能力,在植病防护、农作物品
种改良、纤维素降解以及饲料工业等行业都有着极
大的应用潜力 [ 4, 9, 10 ]。此外, 本研究得到一株突变
株, 其葡聚糖酶基因 1 504 bp处的碱基突变,导致酶
分子 C端 501位的苏氨酸突变为甲硫氨酸,致使其
在酵母多糖的降解试验中虽然表现出与野生型蛋白
相同的酶活性质, 但是却丧失了对酵母细胞裂解的
全部能力,这证明了 C端的多糖结合域对于该 1,
3葡聚糖酶的葡聚糖酶活性虽然没有什么影响, 但
是却在该酶对活酵母的裂解活性中起着至关重要的
作用,推测酶分子的一个氨基酸残基的突变导致其
与酵母细胞壁结合的功能产生显著影响,对此进一
步加以研究将有助于揭示该葡聚糖酶分子结构与功
能之间的相互关系。
致谢:感谢国家基础研究发展计划 ! 973∀计划
( NO. 2007CB714304)对本研究的资助, 感谢日本
N IG的 N ational B ioresource Pro ject馈赠的大肠杆菌
载体。
参 考 文 献
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