全 文 ：节杆菌 ! ! "#$%&’$ !"!#"#锰超氧化物
歧化酶基因的克隆和表达
叶艳华，何冰芳，应汉杰!
（南京工业大学 制药与生命科学学院，南京 $%&&&’）
摘 要：利用 (#)技术对自行筛选的高度耐盐节杆菌 !()*(+,#%)&( "#$%&’$ !"!#%$ 中的超氧化物歧化酶基因进行克
隆，获得了节杆菌 ! * "#$%&’$ !"!#%$ 的 +,!新基因（-./01/2收录号为 !344’%5&）。将该基因与原核表达质粒载体
6789$$:（ ;）连接，构建重组质粒 6789 $+-<(，将质粒转化至表达宿主菌 . * %+/0 0=$%（!7>），构建基因工程菌 0=$% ?
6789 $+-<(。用异丙基硫代9!129半乳糖苷（@(8-）诱导重组 +,! 蛋白表达，用酶活和 +!+9(<-7 分析表达产物，表达
产物的相对分子质量为 $ *A B %&A，与 $+-<(推测的长度相同。表达目的蛋白占菌体可溶性蛋白的 $>C，比酶活达
’%5 *&4 @D·EF G %，是对照菌株的 H *4> 倍，具有较高的表达。本研究为进一步进行重组 "/9+,! 的研究和应用奠定了
基础。
关键词：超氧化物歧化酶；"/9+,!；基因与克隆；节杆菌 !"!#%$
中图分类号：34HI 文献标识码：< 文章编号：%I4$ G >I4H（$&&I）&A G &&4& G &A
$%&’(’) *’+ ,-./,00(&’ &1 2*’)*’,0,304.,/&-(+, +(0245*0, ),’,
1/&2 !"#$"%&’(#)" *’+(),+ 676$%$
J7 J1/9KL1，M7 0N/F9O1/F，JN/F M1/9PN.
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超氧化物歧化酶（简称 +&!），是一种广泛存在于 动物、植物及微生物中的重要的抗氧化酶［%］。自 %’I’
! 收稿日期：$&&I9&’9%H
基金项目：国家 ’4> 项目（$&&A#04%’I&&）
作者简介：叶艳华（%’IH9），女，河北深州人，硕士研究生，主要研究方向为应用微生物。
通讯作者：何冰芳，博士，教授，79E1NR：:N/FO1/FK.^ /PLV * .TL* S/
WQX ] $&&I
·4&·
生 物 加 工 过 程
#KN/.Y. _QLU/1R QO 0NQ6UQS.YY 7/FN/..UN/F
第 A 卷第 A 期
$&&I 年 %% 月
万方数据
年首次被 !"#$%&和 ’%(&$)("*从牛血红细胞中发现和
分离提取以来［+］，由于 ,-.具有抗炎、抗辐射、抗肿瘤
和抗衰老［/01］等作用，从而受到了各国学者的极大关
注。目前国内 ,-. 产品大部分来源于动物血液，由
于原材料有限及纯化困难等原因导致制品纯度低，产
量少。随着世界各地疯牛病、口啼疫、禽流感以及动
物传播的严重性呼吸系统综合症（,23,）等人畜共患
传染病不断报道，动物源的血液制品带来较大的风
险，在此形势下，非动物源的同类制品的研发必将具
有广阔的市场前景，利用微生物、特别是基因工程微
生物制取 ,-.的研究日益受到关注［4］。
高度耐盐节杆菌 ! 5 "#$%&’$ .!.#6+ 是自行筛选
的高效 (0苹果酸产生菌，该菌在柠康酸体系中能产
生大量的 ,-.［7］，通过对该菌来源的 ,-.对抑制剂的
敏感性试验证实其为 !80,-.［9］。!80,-. 是生物体
防御氧化损伤的重要酶类，:%;);%&［<］等提出 !80,-.
是潜在的新型肿瘤抑制基因，可用于治疗多种疾
病［6=066］；有研究证实 !80,-. 的过度表达具有显著的
放射性保护作用［6+］；近年来有人认为线粒体内 !80
,-.水平的下降与糖尿病并发症密切相关［6/］。本研
究根据 >末端氨基酸序列和同源性比较结果设计引
物，成功克隆了 ! 5 "#$%&’$ .!.#6+ 中的 !80,-. 基
因序列，并在原核细胞中进行了高效表达，为 !80,-.
的进一步研究和开发奠定了基础。
! 材料和方法
6 56 材 料
6 56 56 菌种和质粒
所用菌株 ! 5 "#$%&’$ .!.#6+ 为自行筛选，大肠
杆菌 :?+6（.@/）、.A1!均由本实验室保存；质粒
B@C0++D（ E）、B!.690C载体购自宝生物工程有限公
司（C;F;3;）；重组质粒 B@C0G$&2H由本研究构建。
6 56 5+ 主要试剂
异丙基硫代0!)(0半乳糖苷（ IHCJ）购自上海生
工生物技术服务有限公司；限制性内切酶 *%+3I、
,-&"、./’&#、*0 1#2 聚合酶、&>CH 、.>2 !;%KL%、
CM.>2 连接酶、小量胶回收试剂盒均购自宝生物工
程有限公司（C;F;3;）；质粒小量抽提试剂盒购于北
京博大泰克生物基因技术有限公司；H#3 引物由宝
生物工程有限公司合成；其余试剂和药品均为进口
或国产分析纯。
6 5+ 方 法
6 5+ 56 ! 5 "#$%&’$ .!.#6+ 基因组 .>2的提取
按文献［6M］记载的培养基配方，接种冻存菌种，
/= N培养 6M O 64 *，以文献［61］方法提取基因组，用
6 5=P琼脂糖凝胶电泳检测。
6 5+ 5+ ,-.基因的克隆
根据 ! 5 "#$%&’$ .!.#6+ 的 > 末端氨基酸测序
结果在 >#:I上进行比对，发现其与 JL8L :;8K 中所
报导的 !3453+6#%4&3 GB 5 ’:+M 中的 Q(44<41<=1 基因推
测 ,-. 的氨基酸序列的 > 末端完全一致［7］。根据
同源性并在 -3’ 外围处设计和合成扩增包含完整
,-. 基因的两个特异引物，即引物 6：1R02##JCJ0
#2#CJJ2J2C##0/R和引物 +：1R0##2C#2#J2CJJC0
J2CJC#0/R。然后进行 H#3扩增，条件为 1=$? 的反
应体系中加入 6= S ?2缓冲液 1 5=$?，&>CH = 5M$? ，
+= BTT$U 的引物各 +$?，约 6= 8Q ! 5 "#$%&’$ .!.#6+
的基因组 .>2，!Q#U+ 4$?，6 V 的 ?2 C;W 酶。扩增
程序为
T(8。H#3反应结束后进行 6 5=P琼脂糖凝胶电泳检
查 H#3 产物，将相应的条带用 C;F;3; 胶回收试剂
盒纯化后连入 B!.690C 载体克隆质粒，经验证后送
I8)(X%$QL8 公司测序。
6 5+ 5/ 重组表达载体的构建
将上述扩增的基因片断进行分析，找出 -3’ 区
域，加入限制性酶切位点 ,-&"、./’-#设计引物 /：
1R0C2C#2C2CJC##2#J2C2CCJJ2JJ2CCCCJCJ0/R和
引物 M：1R0C2C22J#CC#C2#JJJ2JJJCJJ2CJ2J#0
/R，以“6 5+ 5+”阳性质粒为模板进行 H#3 扩增，将纯
化的 H#3产物和质粒 B@C0++D（ E）分别经限制性内
切酶 ,-&"和 ./’&#双酶切，用 CM.>2 连接酶连接
后，转化 * 5 %+7/ .A1!，利用含氨苄的 ?:培养基及菌
落 H#3方法初筛阳性克隆，再用质粒小量抽提试剂
盒提取阳性质粒，用 ,-&"和 ./’-#对此质粒进行
双酶切以确认阳性重组子，此质粒命名为 B@C0G$0
&2H。
6 5+ 5M 重组子 :?+6 Y B@C0G$&2H 的筛选和 ,-. 蛋白
的诱导表达
将重组质粒 B@C0G$&2H 和 B@C0++D（ E ）空质粒
分别转化表达宿主菌 * 5 %+7/ :?+6（.@/）。阳性菌落
鉴定后命名为 :?+6 Y B@C0G$&2H 和 :?+6 Y B@C。挑取
:?+6 Y B@C0G$&2H和 :?+6 Y B@C单菌落接种于 1 T?含
6== TQ·? Z 6氨苄的 ?: 液体培养基中，/7 N ++= %·
T(8 Z 6摇床过夜培养。以 6P的接种量转接至 +1=
T?摇瓶中（其中含 /1 T? 的 ?: 氨苄培养基），振摇
+==4 年 66 月 叶艳华等：节杆菌 ! 5 "#$%&’$ .!.#6+ 锰超氧化物歧化酶基因的克隆和表达 ·76·
万方数据
培养至吸光度（! "##）约为 # $% 时，加入 &#’的 ()*+
（使其终浓度为 , --./·0 1 ,）于 2# 3诱导培养 2 4，
同时做未加 ()*+诱导剂的对照试验，分别取培养物
, -0，离心收集菌体，用 56 % $2 的 *789:6;0 缓冲液
悬浮菌体，超声破碎，测定培养物上清液和菌体超声
上清液的 <=> 酶活及蛋白质浓度，并用 <><:)!+?
电泳检测 <=>蛋白的表达情况。
, $& $@ 酶活力测定方法
用微量连苯三酚自氧化法测 <=>活性［,"］，以抑
制 @# --./·0 1 ,邻苯三酚自氧化速率 @#’时所需酶
量定义为一个酶活力单位。
, $& $" 蛋白质含量测定
参照 A7BCD.7C法［,E］，以牛血清白蛋白为标准蛋白。
! 结果与讨论
& $, ! $ "#$%&’$ >F>;,& 中 FG:9.C!) 基因的克隆
与序列分析
采用引物 , 和引物 & 同所提取的基因组 >H!
进行 );I 扩增，得到的特异扩增片段有 , "2& J5，扩
增产物电泳结果见图 ,。该序列包含 <=> 的完整
=IK和上游启动子序列。用 LMNO.7 H*(
酸，蛋白质亚基相对分子质量预测为 & $2E2Q R ,#Q，
与本研究前期纯化 <=> 的亚基相对分子质量大小
相近［E］。本研究通过 H 末端序列等相关信息成功
克隆了 ! $ "#$%&’$ >F>;,& 的 <=> 基因，己被 +MGM
ABGS收录（收录号为 >TEEU,@#）。用该 <=> 序列在
H;A( 进 行 了 J/B9O 比 对，结 果 表 明 该 序 列 和
!7O47.JBNOM7 95 $ KA&Q 的 <=>序列同源性为 %U $%’。
,，&：);I 57.CPNO；F：-B7SM7
图 , <=>基因片断扩增结果
K8V $, );I 57.CPNO .D ! $ (#$%&’$ >F>;,& <=> VMGM
& $& 重组表达质粒 5?*:9.C!)的酶切鉴定
重组质粒 5?*:9.C!)和 5?*质粒经 )*&!和 +,’C
"双酶切，用 ,$#’凝胶电泳检测，结果见图 &。泳道
&为双酶切的空质粒；泳道 Q 为经双酶切的 5?*:9.:
C!)，在 @ Q## J5和 "@# J5处共出现两条亮带，分别与
5?*:&&J（ W）以及 <=>目的基因大小相符。说明目的
基因己成功克隆于 5?*:&&J（ W）载体上。
& $2 重组工程菌 A0&, X 5?*:9.C!) 中酶活和目的蛋
白的诱导表达
基因工程菌中目的蛋白表达结果见图 2，可见
A0&, X 5?*:9.C!)所表达的蛋白在大约 & $Q R ,#Q 处
有一条明显的亮带，而对照用空质粒没有相应的条
带，说明目的基因在宿主菌中得到了高效表达。用
光密度定量分析法分析目的蛋白含量，5?*:9.C!)表
达的目的蛋白占菌体总蛋白的 &2’。
,：5?*:&&J（ W）；&：5?* X )*&!:+,’C"；2：5?*:9.C!)；
Q：5?*:9.C!) X )*&!:+,’C"；F：>H! FB7SM7
图 & 重组表达质粒的酶切鉴定
K8V $& (CMGO8D8NBO8.G .D O4M 7MN.-J8GBGO 5/B9-8C
JY 7M9O78NO8.G MGZY-M C8VM9O8.G
,：N.GO7./；&：5?*:<=>(( BDOM7 8GCPNO8.G [8O4；()*+F：57.OM8G -B7SM7
图 2 <=>蛋白在 - $ %./,A0&,（>?2）中表达的 <><:)!+?分析
K8V $2 <><:)!+? BGB/Y989 .D <=> M\57M9985G 57.OM8G 8G - $ %./,
A0&,（>?2）
·E&· 生物加工过程 第 Q 卷第 Q 期
万方数据
! "# $%&酶活测定结果
用微量连苯三酚自氧化法测定的重组菌 ’(!) *
+,-./012+中 $%& 的比酶活为 3)4 "56 78·9: ; )，对
照菌 ’(!) * +,- 中 $%& 的比酶活为 )5# "66 78·
9: ; )，重组菌是对照菌的 < "6= 倍。发酵上清液中没
有 $%&酶活。施惠娟等［)<］将人锰超氧化物歧化酶
（>?@.$%&）的 A&B2 ，在大肠杆菌 ’(!)（&,=）表达
比酶活为 =<6 "4 78·9: ; )；黄勇等［)3］将大肠杆菌锰
超氧化物歧化酶基因（ !"#$）在保加利亚乳杆菌
（(C5=!）中表达的比酶活为 435 "4 78·9: ; )。本研究
所表达的 2 D EFAG@/G &?&H)! 中的 ?@.$%& 具有较
高的酶活和表达量。
! 结 论
= ") 成 功 克 隆 了 高 度 耐 盐 节 杆 菌 $ " %&!’()!
&?&H)! 中的 ?@.$%&基因，己被 IG@G ’F@J收录（基
因收录号 &K663)45），该基因含有 C4) 个碱基，编码
!)C个氨基酸，亚基相对分子质量预测为 ! "=6=# L
)5#。
= "! 成功构建了 $%& 基因的原核表达重组质粒，
经 7+-I 诱导实现了 $%& 在大肠杆菌中的高效表
达，比酶活为 3)4 "56 78·9: ; )。
= "= 经 $&$.+2I, 分析表明在 ! "# L )5# 处有明显
的蛋白条带，所表达的目的蛋白占菌体可溶性蛋白
的 !=M。为下一步基因工程菌的工业应用打下了
基础。
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万方数据