全 文 ：第25卷 第9期
2013年9月
Vol. 25, No. 9
Sep., 2013
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
文章编号：1004-0374(2013)09-0853-05
收稿日期：2013-04-07；修回日期：2013-05-09
基金项目：卫生部“重大新药创制”科技重大专项课
题(2011ZX09506-001)
*通信作者：E-mail: ywang@sibs.ac.cn
重链抗体的结构特点及其应用前景分析
蔡家麟1,2，夏立亮2，潘　欣1，王　颖2*
(1 第二军医大学微生物学系，上海 200433；2 上海人类基因组研究中心/上海科
学院，上海市疾病与健康基因组重点实验室，上海 201203)
摘　要： 重链抗体 (heavy chain antibody, HcAb)是存在于骆驼和鲨鱼类动物体内，轻链天然缺失，只有重链
组成的新型抗体分子。重链抗体和普通的抗体相比虽然缺失了轻链，但是依然保留结合抗原的能力。通过
基因工程的改造获得仅有可变区，但保留结合能力的新型工程抗体——单域抗体 (single-domain antibody)，
也被称为纳米抗体 (nanobody)，具有相对分子质量小、稳定性高、易表达等优点；同时，克服了人源抗体
改造后亲和力降低、易聚集等缺点，成为抗体药物研究领域的新型抗体分子。
关键词：重链抗体；纳米抗体；抗体药物
中图分类号：Q789；R392.11　　文献标志码：A
Structure properties of heavy chain antibody and its future application
CAI Jia-Lin1,2, XIA Li-Liang2, PAN Xin1, WANG Ying2*
(1 Department of Microbiology, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China; 2 Shanghai Key
Laboratory of Health and Disease Genomics, Chinese National Human Genome Center at Shanghai/Shanghai Academy of
Science and Technology, Shanghai 200433, China)
Abstract: Heavy-chain antibodies constitute a major fraction of the functional antibodies in the serum of camelids.
They are devoid of light chains and maintain the specificity and affinity to antigens. Through genetic engineering
techniques, single-domain antibody (also called nanobody) exhibits certain advantages such as low molecular
weight, better stability as well as easy expression etc. In addition, through overcoming the limitations of low affinity
and easy-to-aggregation, nanobody becomes one of the prestigious subtypes in the research and development of
therapeutic antibodies.
Key words: heavy chain antibody; nanobody; therapeutic antibody
自从 Kohler和Milstein[1]发明杂交瘤技术制备
单克隆抗体以来的几十年中，抗体已被广泛应用于
临床疾病的诊断和治疗。与传统的小分子药物相比，
虽然抗体药物的研发成本高达 13亿美元左右 (传
统小分子药物平均只有 9亿美元 )，但由于其靶向
性好、副作用小，抗体药物成为生物药物发展最为
迅速的产业之一。自 1986年第一个抗体药物——
抗 CD3抗体 (OKT3)通过美国 FDA的审查用于抑
制移植排斥反应起，到 2012年底，已有 36个抗体
药物正式上市，25个单抗和 5个融合抗体进入临床
III期试验，150种抗体药物正在进行临床前研究阶
段。抗体药物对肿瘤、心血管、自身免疫性疾病等
的治疗有着极其广泛的应用前景。目前，抗体药物
年销售额占整个生物技术类产品的 1/3，显示出该
领域对生物医药产业的重要贡献。据 Reichert[2]统
计，2011年抗体类药物的市值达到 480亿美元，领
跑所有的生物类药物，2012年更将达到 500亿美元
以上。
回顾治疗性抗体的研究历程，抗体的制备一直
是整个产业的核心和瓶颈之一。抗体药物已经从早
生命科学 第25卷854
期鼠源性单克隆抗体进入了基因工程抗体阶段，为
了克服鼠源抗体在临床应用产生人抗鼠抗体 (human
anti-mouse antibody, HA-MA)反应而进行人源化改
造 (humanization)是目前市场上抗体类药物的主要
形式 [3]。但是，传统抗体由于其相对分子质量大，
造成抗体分子在肿瘤组织和血管屏障的穿透性差，
尤其在实体肿瘤中的有效浓度更低，大大限制了抗
体药物的有效性 [4]。在抗体药物的产业化过程中，
常规抗体分子在哺乳动物细胞中表达量低，而在原
核细胞体系中又容易出现聚集和无法糖基化等问
题，从而使得抗体生产成本高，导致研发和使用费
用高，就限制了其进一步的应用。
因此，为了克服上述这些问题，通过基因工程
技术对抗体分子进行多种方式的改造，先后出现了
人 -鼠嵌合抗体、抗体可变区片段 (fragment of anti-
body binding site, Fab)、单链抗体 (single chain variable
fragment, scFv)、微型抗体 (minibody)等不同形式
的基因工程抗体。通过基因工程技术改造的这些抗
体分子，其优点是：可部分降低抗体的异源性，降
低甚至消除长期使用形成的排斥反应；更加有利于
穿透血管壁，进入病灶的核心部位；可根据疾病的
类型和部位制备组织特异性抗体；采用原核细胞、
真核细胞和植物等多种表达方式，大量表达抗体分
子，降低生产成本。但在实际应用中，其缺点是：
反复使用仍然会引起一定的人抗鼠抗体反应，如痤
疮、皮疹；在药理学方面，难以控制抗体的体内分布，
全抗体难以通过毛细血管到达主体肿瘤部位及在肿
瘤组织中渗透性差。因此，抗体人源化、高效化及
小型化均已成为抗体药物研究的主要趋势 [5]。1993
年，Hamers-Casterman等 [6]在骆驼体内发现天然缺
失轻链的重链抗体 (heavy chain antibodies, HcAb)；
同年，Greenberg等 [7]又相继在美洲驼所属的骆驼
科其他动物，如羊驼中发现相同类型的抗体以及银
鳐、护士鲨等软骨鱼体内发现了类似结构的抗原受
体 (new antigen receptor, NAR)。从此，重链抗体成
为制备小型化抗体的天然候选新型分子，并被广泛
应用于基因工程抗体开发 [8]。
1　重链抗体的理化和结构特征
与具有重链和轻链 4条多肽链组成的常规抗体
分子不同，重链抗体由两条同源的重链肽段组成，
重链分子只包含可变区、CH2区和 CH3区，相对
分子质量为90 kDa，远小于常规的 IgG抗体分子 (150
kDa)[9]。虽然研究人员尝试用常规抗体可变区抑制
溶菌酶的活性并获得成功，但是随后的大量研究表
明，如果将常规抗体的分子结构过度改造后，可以
导致亲和力大幅下降、可溶性差等；而重链抗体在
天然状态下就以单链的形式存在，可以克服人源与
鼠源抗体无法解决的制备和相对分子质量过大等问
题而成为抗体研发中的新分子形式 [10]。
X-射线晶体衍射分析发现，重链抗体可变区
和人与小鼠抗体可变区的空间结构相似，都由片层
结构组成 [11]，但是存在两点不同：首先，重链抗体
可变区的互补决定区 3 (complementarity determining
region 3, CDR3)的氨基酸残基数量达 16~18个，而
人或小鼠的CDR3区一般为 6~8个氨基酸残基组成，
虽然在美洲驼中存在 6个氨基酸残基的 CDR3区，
但是总体长度和变化要超过人的 CDR3区 [11]；其次，
重链抗体的 CDR1区和骨架区 (framework region 2,
FR2)存在半胱氨酸残基 (Cys)，可以和 CDR3区中
的 Cys残基形成二硫桥，增加了可变区的稳定性和
结构变化 [12]。
2　重链抗体可变区胚系基因特征
在骆驼体内存在 3种不同相对分子质量的抗体
分子，按照其结合蛋白 G/A能力的不同及相对分子
质量的大小将其分为：传统 IgG1抗体分子和只有
重链组成的 IgG2/IgG3重链抗体，其含量在血液中
各占了一半，骆驼体内的重链抗体在体液免疫中起
着重要的作用 [13]。
目前的研究显示，单峰驼的免疫球蛋白胚系基
因中共有 52个可变区 (variable domain, VH)基因、
42个重链可变区 (heavy chain variable domain, VHH)
基因和 9个恒定区 (constant domain, CH)基因，重
链抗体编码恒定区为 5个，其中有两个和常规抗体
是共用的，此外 D区的基因也通用的 [14]。以上所
有的重链抗体胚系基因序列中都存在 CH1区序列，
但在经过重组后的成熟重链抗体可变区 mRNA中
不存在，因此推测在基因重排的过程中发生 CH1
区的剪切 [15]。由于重链 CH1区的氨基酸序列具有
与内质网的免疫球蛋白结合蛋白 (immunoglobulin-
binding protein, BiP)结合的能力，从而调节抗体从
内质网分泌，所以 CH1区缺失的重链抗体在体内
的分泌速度更快；同时，CH1区的缺失使重链抗体
的可变区和恒定区直接由铰链区连接。
重链抗体的进化来源很长一段时间存在争议。
直到 2002年，Nguyen等 [16]比较单峰驼和美洲驼
VHH的胚系基因，建立相应的进化树，证明重链
蔡家麟，等：重链抗体的结构特点及其应用前景分析第9期 855
抗体是来自于传统抗体基因结构的改变，而非休眠
基因的复苏；同时，通过 V-D-J基因重排和核苷酸
插入 /缺失等方法，使重链抗体 VHH区获得更为
丰富的多样性。进一步比较发现，VH和 VHH的
胚系基因有部分同源，在成熟的可变区基因中包含
有部分相同的胚系基因的 D区基因，这部分同源基
因在成熟抗体分子中均由参与抗原结合的重要氨基
酸残基组成，所以通过建立免疫噬菌体库可筛选获
得更高亲和力的抗体分子 [17]。
3　重链抗体可变区的氨基酸组成特征
普通抗体可变区重链 FR2区中 Val42、Gly49、
Leu50和 Trp52等 4个氨基酸残基可以与轻链相互作
用，起到稳定双链结构的作用。而在重链抗体的胚
系基因序列中最大的特点是，上述氨基酸残基为亲
水性的 Phe/Tyr42、Glx49、Arg/Cys50、Leu/Gly52 [18](在
Kabat数据库中，这几个氨基酸残基的编号相应为
37、44、45、47)[19]。上述 4个氨基酸的改变使得重
链抗体在缺少轻链的情况下，依旧可以保持结构稳
定，并且亲水性得到了一定程度的提高。
Leu50是常规抗体中对重链 CH1结构域与轻链
结合起作用的关键氨基酸残基，由于 CH1结构域
在重链抗体中的缺失，所以该残基即使被 Arg或
Cys替代，也不会影响重链抗体结构的稳定性，还
可能与重链抗体的可溶性增加有关。重链抗体可变
区结构域中 CDR3区的长度为 16~18个氨基酸残
基，明显长于常规 IgG的 6~8个氨基酸残基组成
的 CDR3区，在氨基酸组成中虽然缺少 Arg94和
Asp101间的离子键，但是在 CDR1和 CDR3区中的
多个 Cys残基可形成结构域间的二硫键，从而稳定
可变区的空间构象。氨基酸残基组成分析结果显
示，重链抗体可变区的 CDRs区氨基酸残基具有
更广泛的分布和种类，从而大大丰富了抗原结合能
力，也为重链抗体可变区独特的空间构象提供分子
基础 [17]。
通过对单峰驼与美洲驼 VHH胚系基因序列测
序，发现 VHH胚系基因表现出更为丰富的多样性，
从而使得重链抗体能够形成足够与不同抗原结合的
大量抗原结合部位。同时，通过比较人类 VH3基
因序列与骆驼的 VHH胚系基因序列，发现两者有
高度的同源性 [20]。因此，对人源抗体可变区结构域
FR2的第 42、49、50和 52位点氨基酸残基根据重
链抗体中相对应氨基酸进行骆驼化 (camilization)改
造，所得到的骆驼化人源抗体不仅保持原有抗体的
特异性和亲和力，且溶解性和稳定性都比原来有了
提高 [20]；同样，将重链抗体进行人源化，获得的抗
体也保留了本身的抗原结合能力 [21]。
4　重链抗体来源的纳米抗体的研发优势
重链抗体作为天然缺失轻链的抗体分子，在基
因工程改造中相对于传统 IgG抗体分子具有更大的
优势。由重链抗体改造而来的单域抗体 (single-
domain antibody)在天然状态下具有与抗原结合的
能力，与人源或鼠源的单域抗体相比，其亲和力保
留得更好 [22]，由于其相对分子质量远远小于传统抗
体，又被称为纳米抗体 (nanobody)。纳米抗体更容
易在各种表达系统中进行表达和纯化，如在 E. coil
表达系统中，其表达量在培养基中可以达到 1~10
mg/L，并且在酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞中
的表达效率也非常高 [23]。
相对分子质量的减小使得纳米抗体不仅易于表
达，同时使其组织渗透性优于普通抗体，可以穿过
普通抗体无法通过的物理屏障。例如，Muru-
ganandam等 [24]就在研究中发现，纳米抗体可以在
动物病理模型的脑组织出现，因此推测纳米抗体具
有穿透血脑屏障的能力；同时，纳米抗体也可以结
合普通抗体无法结合的隐蔽表位和特殊表位 [25]。
同时，由于纳米抗体 FR2区中特殊的亲水性
氨基酸残基的改变和 CDR3区二硫键的存在，使得
其稳定性和亲水性也远远优于传统的 IgG抗体。纳
米抗体在 90℃的高温下依旧可以与目标抗原结
合 [23]，其可溶性也更高，并且不容易产生聚集，在
极端环境下保持结构和性能稳定 [9]。
5　纳米抗体的制备和应用
5.1 纳米抗体的抗体库建立和筛选
重链抗体来源的纳米抗体由于结构简单，相对
于 Fab、scFv等片段更容易正确折叠，所以在进行
噬菌体抗体库的构建和筛选方面也更加具有优
势 [23]。目前，纳米抗体的制备和应用日益广泛。
Dolk等 [26]使用洗发水作为固相富集的环境，筛选
获得可以在洗发水中稳定存在并特异性结合头皮真
菌的抗体。Harmsen等 [27]使用唾液和胃酸作为固
相富集的环境，筛选出的纳米抗体表达在乳酸菌的
表面，可用于口服制剂中。此外，有实验室依据纳
米抗体表达稳定、相对分子质量小的特点，结合酵
母双杂交的技术，开发出在酵母细胞内进行胞内抗
体筛选的技术 [28]。
生命科学 第25卷856
5.2 纳米抗体的应用
纳米抗体与传统抗体不同，拥有优于传统抗体
的稳定性、细胞 /血管穿透性和抗原结合能力，可
被应用于许多传统抗体较难到达的特殊领域。
Hmila 等 [29]筛选到了针对蝎子毒素 Aahl的高亲和
力纳米抗体，并证明该纳米抗体针对常规抗体较难
识别的隐藏表位。使用非免疫抗体库获得的针对肉
毒素 β和葡萄球菌肠毒素 β的纳米抗体分子，用以
中和并清除多种细菌毒素 [30-31]。
纳米抗体在实体肿瘤部位的渗透优势，使抗体
药物研发人员针对现有的靶点分子进行纳米抗体的
再开发，如针对表皮生长因子受体 (EGFR)的特异
性纳米抗体可以更为有效地到达实体瘤内部，通过
与 EGF竞争结合 EGFR位点，起到抑制实体肿瘤
细胞生长的目的，并在动物体内得到证实 [32]。同时，
利用纳米抗体易组装和易于在胞内表达的特点，将
其应用到胞内抗病毒的治疗，如抗 HBV胞内抗体
在小鼠模型中都得到了证实 [33]。
此外，利用纳米抗体易于基因工程操作的优势，
根据不同需求开发的功能型纳米抗体也应运而生。
如为了减少成像检测中背景过深的问题，Groeve
等 [34]将可以识别骨髓来源细胞的纳米抗体的 loop
区转移到了一个背景较浅的纳米抗体骨架上，动物
体内试验中在成功降低背景的同时保留了抗原识别
能力；而 Coppieters 等 [35]将筛选到的抗肿瘤坏死因
子 (TNF)抗体改造成为 2价抗体分子后，不仅亲和
力提高 500倍，同时延长抗体分子体内半衰期，并
在动物试验中得到有效性验证，目前已进入临床试
验阶段。
6　纳米抗体的不足与改进
纳米抗体与传统抗体相比，前者虽然拥有众多
优势，但仍存在一些不足，主要是半衰期较短。与
常规抗体相比，纳米抗体具有更快的血清清除速度，
使得其在体内成像方面大展身手的同时，也限制了
其在治疗领域的应用。人们为了能够延长纳米抗体
在血液中的半衰期进行了许多不同的尝试，比较成
功的有 Coppieters 等 [35]通过构建双特异性抗体
(bispecific antibody, BsAb)的方法，将特异性抗肿瘤
坏死因子纳米抗体和抗血清白蛋白纳米抗体偶联，
以延长在血清中的半衰期；Harmsen 等 [36]使用聚
乙二醇化的方法也成功延长了中和手足口病的纳米
抗体的半衰期；此外，Hmila等 [29]则将 VHH片段
和人 Fc段连接在一起，同样有效延长了抗体在体
内的半衰期。
7　小结
重链抗体由于其在结构和理化特征上的独特
性，在抗体药物的研发中具有更多的优势，由此衍
生出的纳米抗体作为新型抗体分子虽然存在体内半
衰期过短，以及亲和力有待于进一步提高等缺点，
但是仍然不失为基因工程抗体药物未来的抗体形式
之一。随着多个重链抗体药物进入临床试验阶段，
人们有理由相信，纳米抗体从实验室走入临床将成
为可能。
[参　考　文　献]
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