全 文 ：第25卷 第7期
2013年7月
Vol. 25, No. 7
Jul., 2013
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
文章编号：1004-0374(2013)07-0735-08
基因组定点编辑技术的研究进展
张智辉，董少忠*，寸　韡*
(中国医学科学院&北京协和医学院医学生物学研究所，云南省重大传染病疫苗研发重点实验室，昆明 650118)
摘　要：基因组编辑是建立在基因靶向修饰的基础上，对生物基因组进行改造的一项新技术。通过利用人
工核酸酶 ZFn、TALEN和细菌获得性免疫系统 CRISPR，可在靶位点制造 DNA 双链切口进而诱导细胞内
源性修复机制，通过同源重组修复或非同源末端连接途径实现基因敲除、替换和纠正。对目前 3个主要的
基因组定点编辑技术的应用和发展作一综述。
关键词：定点基因组编辑；锌指核酸酶；TALEN；CRISPR/Cas9
中图分类号：Q-33；Q78 文献标志码：A
Progress in targeted genome editing technologies
ZHANG Zhi-Hui, DONG Shao-Zhong*, CUN Wei*
(Institute of Medical Biology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Yunnan Key
Laboratory of Vaccine Research & Development on Severe Infectious Disease, Kunming 650118, China)
Abstract: Genome editing is a novel technology based on precise genome-targeting modification to enable
systematic reverse engineering of causal genetic variation. A set of gene editing techniques, zinc finger nucleases,
transcription activator-like effector nucleases and bacterial CRISPR (clustered regularly interspaced short
palindromic repeats)/Cas adaptive immunity system, have been used to cleave the double-strand DNA at specific
site, followed by endogenous DNA repair. These techniques, therefore, make precise changes to the DNA of living
cell by, for example, knocking out a gene, correcting a genetic mutation or replacing DNA fragment at the specific
site. The new progress in targeted genome editing technologies was discussed in this paper.
Key words: targeted genome editing; zinc finger nucleases; TALEN; CRISPR/Cas9
收稿日期：2013-03-13； 修回日期：2013-04-26
基金项目：国家科技重大专项重大新药创制课题(2012-
ZX09105302)；中央高校基本科研业务费专项资金资
助(2012Y08)
*通信作者：董少忠，E-mail: shaozhongdong@gmail.
com；Tel: 0871-68339287；寸韡，E-mail: cunwei@
gmail.com；Tel: 0871-68334579
近几年来，科学家一直在寻求更加精确的方法
对特定的基因进行敲除或者靶向修饰。20世纪 80
年代，研究者们可以利用同源重组的方法来对特定
的基因进行靶向修饰，但由于自然重组的过程非常
罕见，所以，这种方法效率非常低，只能达到 10-6。
之后的研究发现，真核细胞的染色体发生双链断裂
时 [1]，细胞会通过 DNA 同源重组或者非同源末端
连接机制修复双链断裂 [2]，在修复过程中会出现高
几率的基因缺失、插入和改变。所以，利用各种方
法在染色体上的特定位点进行精确切割诱发 DNA
损伤修复，使得对真核生物进行精确的基因操作成
为可能，以此实现特定细胞组织的遗传操作 [3-6]。
通过在基因组水平上进行精确的基因编辑，可以更
加准确、深入地了解疾病发病机理和探究基因功能，
找到遗传性疾病治疗的有效手段，因此，基因组编
辑具有极其广泛的发展前景和应用价值。2011年，
人工核酸酶介导的基因组编辑技术被 Nature
Methods杂志评选为年度最受关注的技术成果。从
当年的技术发展来看，这 3种酶包括有 3个主要的
类型——锌指核酸酶 (zinc finger nucleases, ZFn)、
转录激活因子样效应物核酸酶 (transcription activator-
∙ 技术与应用 ∙
生命科学 第25卷736
like effector nucleases, TALEN)，以及归巢核酸内切
酶 (meganuclease)。目前 ZFn及 TALEN技术已被
广泛应用，而归巢核酸内切酶由于改造难度大、成
本高，使其应用有所局限。近期，细菌获得性免疫
系统 CRISPR在人源细胞染色体修饰上的应用使得
基因组编辑技术进一步简化。目前，研究人员利用
基因组编辑技术，已经对多个物种进行了基因组定
点敲除或修饰 [3,7-14] 。基因组定点编辑技术在未来
的动植物基因组改造、基因功能研究等重大的基因
组学问题的解决中将具有广阔的应用前景。
1　基因组定点编辑技术的初现——锌指核酸
酶 (zinc finger nucleases)
1.1　锌指核酸酶的结构及作用原理
锌指 (zinc finger, ZF)是一种常见的 DNA结合
蛋白结构基元，每个锌指可直接特异识别 DNA双
螺旋中 3 个连续的核苷酸。人工串联 3~6个识别不
同靶位点序列的重组锌指结构，能够与靶序列特异
性结合 [15]。将多个锌指串联形成的 ZFP 结构域与
IIs型限制性内切酶 FokI [16]的切割结构域相连接，
就可构建成锌指核酸酶 (ZFn)，实现对靶序列的切
割。增加串连锌指的数目可识别更长的靶序列 , 同
时也就增加了 DNA 靶向修饰的特异性 [17-18]。
由于 FokI需要二聚化来切割 DNA[16]，所以，
设计好的两个互补的 ZFn 分子同时与靶位点结合，
当两个互补的 ZFn 分子间相距恰当的距离时
(6~8 bp)，FokI结构域将二聚化并切割 DNA(图 1)，
从而可特异性地在基因组特定位点切断 DNA形成
“双链断裂缺口” [19-21]。双链断裂可以启动细胞内的
DNA 损伤修复机制，一方面细胞通过错配率很高
的“非同源重组末端连接”机制修复双链断裂，从
而在 ZFn 靶位点造成随机性的小片段丢失或是插
入，引起基因的靶向敲除；另一方面，由于双链断
裂使得同源重组效率大大提高，如果细胞内同时存
在与靶位点同源的 DNA 片段，则细胞主要通过
DNA 同源重组的机制修复双链断裂，从而实现靶
基因敲除或敲入。
1.2　ZFn的筛选与构建
锌指结构 α 螺旋中的 –1~+6 位的 7 个氨基酸残
基 (+4 位通常固定为亮氨酸残基 )决定了锌指对
DNA 序列识别的特异性。其中，–1、+3、+6 位残
基直接同三联子靶序列中的 3个碱基相互作用，三
个残基中任何一个改变都可能会引起其他两个氨基
酸残基对目标碱基识别的改变。此外，不同的锌指
之间也会相互作用，这种作用被称为 ZF的上下文
依赖效应，所以，目前对 ZF识别的核苷酸序列研
究不是完全明了，而大多数研究者并不公布其 ZF
序列，因此，ZFn在构建和筛选方面存在较大的技
术难度。
模块组装是最早出现、较为简单的构建方法，
将某个特定的 ZF视为一个能够独立识别并结合特
定核苷酸三联子的模块。收集经过实验验证的 ZF
与三联子信息，在两者之间建立一一对应的关系，
构成可供挑选的锌指集。在使用时只要把感兴趣的
序列与 ZF一一对应，将多个锌指偶联即可 [22]。这
种方法没有考虑 ZFn的上下文依赖效应，可能会产
生较高的脱靶切割效应，引起细胞毒性。
OPEN [23]是 ZFn构建中另一个常用的方案，
它利用 OPEN (Oligomerized Pool Engineering)作为
一个共享的锌指资源库，每个锌指库中针对一个特
异的三联碱基包含了大量的不同氨基酸序列的锌指
识别结构域，通过将不同的库组合在一起可以得到
成百上千种 ZFn的组合，其中亲和性高的组合将激
活下游的药物筛选基因，并在选择培养基中获得竞
争优势，最后再通过细菌双杂交，最终筛选获得理
想的 ZFn。
1.3　ZFn的应用
21世纪初期，ZFn技术在基因编辑中逐渐得
到广泛的应用。该方法已经在黑腹果蝇 [24]、斑马
鱼 [25-26]、大鼠 [27]、小鼠 [27]、拟南芥 [28]等模式生物
的中成功实现了靶基因的敲除或定点修饰。2005年，
Urnov等 [29] 首次利用 ZFn技术对培养的人类细胞
进行了基因敲除；2007年，他们又利用 ZFn介导
的同源重组对人类细胞进行了基因定点插入 [30]；
随后，人们相继在多种类型的人类细胞中 [29,31]，利
用 ZFn，采用多种方案实现了多个基因的遗传修饰。
ZFn技术介导的基因突变使得一些遗传疾病的
治疗成为可能。在艾滋病治疗方面，Sangamo公司
图1 锌指核酸酶同靶序列结合实现DNA定点切割的示
意图
张智辉，等：基因组定点编辑技术的研究进展第7期 737
的 Holmes等尝试使用 ZFn技术破坏 CD4+ T细胞
中的内源基因 CCR5，可以使 HIV 病毒失去其重要
的受体位点之一，从而抑制病毒的繁殖与传播 [32]。
目前，Sangamo 公司针对 CCR5 设计的 ZFn 药物已
进入三期临床试验阶段。但是，ZFn在遗传疾病治
疗方面的使用还需谨慎，脱靶切割和试剂安全性方
面的问题是亟需克服的。
1.4　ZFn的优势和局限
ZFn的出现使得基因打靶效率能够达到 30%
左右，比被动的同源重组有了质的提升，并且已经
可以做到针对某些特定的序列来设计 ZFn实现靶基
因的修饰，但也有其发展的局限性，ZFn的识别结
构域中存在上下文依赖效应，使得 ZFn设计和筛选
效率大大降低，所以目前尚无法实现对任意一段序
列均可设计出满足要求的 ZFn，也无法实现在每一
个基因或其他功能性染色体区段都能够顺利找到适
合的 ZFn 作用位点，并且在已经成功运用的 ZFn
的报道中，大多数研究者并不公布其 ZF序列。所以，
在 ZFn的筛选和设计方面还存在较大技术困难，如
何构建高特异性的 ZFn将成为这个技术未来发展的
重点。
另外，由于 ZFn的脱靶切割会导致细胞毒性，
使得其在基因治疗领域的应用出现了一定的局限
性。目前，只能通过特异性的启动子在一定范围内
调控 ZFn的表达时间及表达量以减少脱靶切割，未
来如何筛选更合适的启动子或者调控方式来降低脱
靶切割是 ZFn应用中应当克服的一个难题。
2　基因编辑技术的发展——TALEN
2.1　TALEN的结构及作用原理
ZFn的发明使得精确的基因组编辑成为可能，
但是由于其对 DNA序列识别的不规律性使得自身
的发展受到局限。2009年，研究者在植物病原体黄
单胞菌 (Xanthomonas) 中发现一种转录激活子样效应
因子——TALE，该因子能特异性地结合 DNA[33-34]。
利用该特点，科学家们构建出另一种核酸酶 TALEN，
用于基因编辑。
TALE 核酸酶 (TALEN) 是由 TALE 代替了 ZF
作为DNA 结合域与FokI切割结构域连接成核酸酶。
通过 TALE识别特异的 DNA 序列，FokI二聚化产
生核酸内切酶活性，与 ZFn一样在特异的靶 DNA
序列上产生双链断裂以实现精确的基因编辑 [10,35]。
通过对目前发现的所有 TALE蛋白分析发现，
TALE 蛋白中 DNA 结合域有 1个共同的特点，不
同的 TALE 蛋白的 DNA 结合域是由数目不同的、
高度保守的重复单元组成，每个重复单元含有
33~35个氨基酸残基。这些重复单元的氨基酸组成
相当保守，除了第 12和 13位氨基酸可变外，其他
氨基酸都是相同的，这两个可变氨基酸被称为重复
序列可变的双氨基酸残基 (repeat variable diresidues,
RVD)。TALE特异识别 DNA的机制在于每个重复
序列的 RVD可以特异识别 DNA的 4种碱基中的 1
种，目前发现的 5 种 RVD中，组氨酸 -天冬氨酸
特异识别碱基 C；天冬酰胺 -异亮氨酸识别碱基 A；
天冬酰胺 -天冬酰胺识别碱基 G或 A；天冬酰胺 -
甘氨酸识别碱基 T；天冬酰胺 -丝氨酸可以识别 A、
T、G、C中的任一种。而通过对天然 TALE的研究
发现，TALE蛋白框架固定识别碱基 T，所以靶序
列总是以碱基 T开始 [33-34,36] (图 2)。
因此，理论上可以根据实验目的对 DNA结合
域的重复序列进行设计，得到特异识别任意靶位点
序列的 TALE。
2.2　TALEN的构建
TALEN在使用之前必须用特定方法构建特异
性识别目标序列的 TALE重复片段原件偶联结合结
构域，由于其对于核苷酸的识别是一一对应的，所
以构建和筛选相对于 ZFn简单得多，目前有多种平
台可以用于设计构建 TALEN质粒，不同的构建平
图2 TALE分子结构示意图
生命科学 第25卷738
台使用的方式有所区别，但是其思路是一致的。
TALEN的构建过程中，首先要完成 TALE阵列的
组装，使用 PCR的方法获得每一个带有酶切位点
接头的 TALE分子，酶切连接使得单体的 TALE分
子组成阵列，最后将阵列连接进入含有 TALEN C
末端、N末端及 FokI切割序列的质粒中完成一个
TALEN质粒的构建。近 3年来，TALEN技术飞速
发展，已有很多商业化的 TALEN构建试剂盒，也
有很多生物技术公司提供 TALEN构建的服务，使
得 TALEN的构建筛选更为高效和简便。
2.3　TALEN的应用
TALEN的发明使基因组编辑的效率和可操作
性得到了提高，对于目的片段的切割效率达到了近
40%。目前，TALEN也像 ZFn一样，被应用到了
不同种的细胞及生物的基因组编辑中。
至今为止，研究者们已经应用 TALENs对果
蝇 [11]、蛔虫 [12]、斑马鱼 [13]、青蛙 [14]、大鼠 [37]和
猪 [38]等模式生物进行了基因组定点编辑。而使用
TALEN技术对牛 [38]、蟋蟀 [34]和家蚕 [39]等非模式
生物进行内源基因的定点修饰也有报道。在目前的
研究中，大多数研究者都使用一对 TALENs对目标
基因进行敲除，也有一些报道同时使用了两对
TALEN对同一条染色体上的两个位点进行敲除，
使基因组缺失更大的片段 [40]。同样的，也已经有研
究者利用 TALEN和同源片段的引入实现了在斑马
鱼和人的基因组中进行定点插入 [41-44]。
在各种遗传疾病的治疗方面，TALEN技术的
高精确性使得对这些错误基因的修饰比 ZFn更具潜
力。Mussolino等 [43]利用 TALEN和 ZFn两个技术
对人胚肺 293细胞的 CCR5及 CCR2位点中 19 bp
的靶序列成功进行了定点敲除，且 TALEN的脱靶
切割几率比 ZFn要低得多。Sun等 [44]利用设计的
一对 TALEN和同源性序列成功地对缺陷型 β珠蛋
白基因进行了更改，使其恢复到正常序列。
2.4　TALEN的优势和局限
相比 ZFn技术，TALEN使用了 TALE分子代
替 ZF作为人工核酸酶的识别结构域，极好地解决
了 ZF对于 DNA序列识别特异性低的问题。TALE
蛋白与 DNA碱基是一一对应的，并且对碱基的识
别只由 2个氨基酸残基决定，这相对于 ZFn的设计
要简单得多。但是在构建过程中，TALE分子的模
块组装和筛选过程比较繁杂，需要大量的测序工作，
对于普通实验室的可操作性较低，而商业化公司构
建也需要花费上千美元，使用成本较高；并且，
TALEN的蛋白质相对分子质量要比 ZFn大得多，
过大的蛋白质分子往往会增加分子操作的难度，去
除 TALEN分子的不必要结构或者缩短识别序列的
长度能一定程度地减轻影响，但是却有可能造成识
别特异性降低而导致脱靶切割，引起细胞毒性。
3　基因组编辑技术的新方向——CRISPR/Cas9
3.1　CRISPR/Cas9系统的结构及作用原理
TALEN对于靶序列识别的精确性使得该技术
在近 3年来得以飞速发展，但是其构建复杂，并且
较大的相对分子质量在某些情况下使用困难也制约
了其应用前景。最近，研究者们发现了一种 RNA
介导的 DNA定点切割的方法可以用来进行基因组
编辑。
规律性重复短回文序列簇 (clustered regularly in
terspaced short palindromic repeats, CRISPRs) 是一类
独特的 DNA直接重复序列，广泛存在于原核生物
基因 (大多数的细菌和几乎所有的古细菌 )中 [45]。
自 2002年首次被人们所定义以来 [46]，CRISPR一
直以其奇特的结构与特殊的功能吸引着各国科学家
们的共同关注。它的结构非常稳定，长度约 25~50 bp
的重复序列 (repeats)被间区序列 (spacers)间隔 [47]。
2005年，Cas系统 (CRISPR-associated sequences system,
CASs)被发现在原核生物中表现出某种获得性免疫
功能，能使宿主获得抵抗噬菌体、质粒等外来
DNA入侵的免疫能力 [48-49]。
CRISPR/Cas 系统的作用机制大体可分为 3 个
不同阶段 [49]：在噬菌体侵入的起始阶段， Cas 蛋白
复合物靶向裂解噬菌体基因组中短的原型间隔
序列， 这些原型间隔序列整合到宿主基因组中
CRISPR 位点的 5′端；然后这些短的掺入的间隔序
列被转录成 crRNAs；当宿主再被噬菌体感染时，
crRNAs 作为模板通过 Cas复合物靶向降解噬菌体
DNA。
CRISPR系统大致分为 3类，其中 I型及 III型
CRISPR系统由复杂的 Cas复合物介导 DNA或 RNA
的降解，而在产脓链球菌 (Streptococcus pyogenes)
中发现的 II型 CRISPR系统组分较为简单，只需要
Cas9和两个非编码 RNA ：crRNA与反式激活 crRNA
(tracrRNA)，3个组分即可介导外源 DNA片段的靶
向降解，所以目前针对 CRISPR/Cas9研究较多。在
CRISPR/Cas9系统中，外源的 DNA进入细胞内，
细菌的 RNaseIII催化 crRNA的成熟，成熟的 crRNA
通过碱基配对与 tracrRNA结合，形成双链 RNA结
张智辉，等：基因组定点编辑技术的研究进展第7期 739
构。这一 crRNA: tracrRNA二元复合体指导 Cas9
蛋白在 crRNA引导序列靶标的特定位点剪切双链
DNA，在与 crRNA引导序列互补的位点，Cas9蛋
白的 HNH核酸酶结构域剪切互补链，而 Cas9
RuvCI结构域剪切非互补链 [50]。
3.2　CRISPR/Cas9系统在基因组编辑中的应用
利用 CRISPR/Cas9系统对 DNA分子的靶向切
割特性，使其可以被用于定向的基因修饰。2012年，
来自加州大学伯克利分校的 Doudna研究小组首先
利用人工设计的 crRNAs序列，使用产脓链球菌的
CRISPR/Cas9系统对体外的 DNA靶序列进行了精
确切割，并且把 crRNA:tracrRNA二元复合体改造
为单链 RNA嵌合体，也能同样指导 Cas9蛋白在特
定位点剪切双链 DNA[51] (图 3)；如果对 Cas9蛋白
的 HNH核酸酶结构域及 RuvCI 结构域进行修改，
还能完成对目标单链的切割 [51]。之后，又有报道分
别证明了通过人为设计可以利用产脓链球菌的
CRISPR/Cas9系统在大肠杆菌细胞对外源噬菌体的
双链 DNA及外源质粒进行精确地定点切割 [52-53]。
2013年初，来自MIT的 Zhang Feng研究小组 [54]证
明了经过修饰的产脓链球菌 Cas9蛋白可以在
crRNA:tracrRNA的指导下对 293FT细胞的特定位
点进行精确地切割，他们同时发现对 Cas9蛋白的
RuvC I结构域进行修改之后， Cas9对目标基因进行
单链的切割在人源细胞中同样可以实现。而且，
CRISPR/Cas9系统可以通过设计多段 crRNA来对
同一个细胞的多个位点进行切割。该项研究甚至发
现，把 Cas9、crRNA及 tracrRNA序列构建于同一
个质粒上进行转染即可完成切割，大大降低了操作
的难度。来自哈佛的 Church 研究小组 [55]同期的实
验也利用了 CRISPR方法对 293T、K562以及 iPS
细胞进行了精确的基因编辑。之后又有 3个不同的
研究小组也利用了 CRISPR/Cas9系统对人、小鼠和
斑马鱼细胞同样进行了精确的基因组编辑 [55-58]。
CRISPR对靶位点的切割效率被证明与 ZFn和
TALEN相差无几，但是对不同序列的切割效率却
存在着差别，不过其脱靶切割的几率相比前两种方
法要低的多，然而，并没有任何一个研究小组提供
了脱靶切割机率的具体数据。除了用于定点的基因
编辑，CRISPR/Cas9也可用于干扰目的基因的转录。
Qi 等 [59]为改造构建了没有核酸切割活性的 Cas9蛋
白，通过与指导 RNA转化大肠杆菌可以靶向干扰
目的基因的转录，这一过程被称为 CRISPRi。
CRISPRi具有高度特异性，能够靶向干扰单个或同
时干扰多个基因，而且通过可诱导启动子的加入，
人为地控制干扰过程。他们利用 CRISPRi系统干扰
了大肠杆菌的乳糖调控途径中的不同分子，发现
CRISPRi可以被用于探究信号通路上各个分子间相
互作用。同样，CRISPRi系统在 293细胞中也得以
成功干扰目标基因的转录。
总而言之，CRISPR/Cas9应用于基因组编辑还
处于初期阶段，但它的确为基因组编辑提供了一个
新的思路，在将来的发展中具有极大的潜力。
3.3　CRISPR/Cas9系统的优势和局限
相较于 ZFn和 TALEN两种人工核酸酶技术，
CRISPR/Cas9系统是一个天然存在的原核生物 RNA
干扰系统，其介导的基因组编辑是由 crRNA指导的，
对靶序列的识别是 RNA与 DNA的碱基配对过程，
相比蛋白质对 DNA序列的识别要精确更多，只要
有一个碱基无法配对，就不会实现 Cas9对 DNA的
切割，降低了脱靶切割的几率，减低了细胞毒性。
而且 CRISPR/Cas9的构建仅仅需要设计与靶序列互
补的 RNA即可，过程相对于 TALEN更为简单和廉
价，普通的实验室也可以自行完成构建，这大大提
高了基因操作的效率及简便性。并且，CRISPR/
Cas9系统是由 RNA介导的 DNA切割，若在 RNA
水平上进行分子操作，则可实现精确且瞬时的切割，
在切割时间的调节上相较于 ZFn和 TALEN容易得
图3 CRISPR/Cas9系统介导的靶位点切割
生命科学 第25卷740
多。但是，CRISPR/Cas9系统在真核基因组编辑中
也存在着一些不足。首先，Cas9蛋白对于目标序列
的切割不仅仅依靠 crRNA序列的匹配，在目标序
列 (protospacer)附近必须存在一些小的前间区序列
邻近基序 ( protospacer adjacent motifs, PAM)，如果
目标序列周围不存在 PAM (目前证明 PAM序列为
NGG)或者无法严格配对，则 Cas9蛋白不能行使核
酸酶的功能，这也造成了利用 CRISPR/Cas9不能对
任意序列进行切割。其次，目前 CRISPR/Cas9系统
所靶向的序列仅需十余个碱基对精确配对，这可能
降低 CRISPR/Cas9系统切割的特异性。并且，作为
一个原核的系统，针对真核细胞中染色体的各种修
饰结构是否能够无差别地进行高效切割也需要进一
步探究。最后，和 ZFn及 TALEN技术一样，CRISPR/
Cas9也面临着如何控制双链断裂之后的非同源末端
连接修复可能随机产生细胞毒性的问题，这在将来
的研究和应用中也亟待解决。
4　展望
随着越来越多不同物种的基因组完成测序 , 解
读基因组的功能显得日益重要。基因组靶向修饰是
进行基因组改造与基因功能研究的一个重要手段。
ZFn技术首先为精确的基因打靶打开了大门，但是
其对于 DNA序列的识别特异性较低，容易造成脱
靶切割引起细胞毒性，使得该技术在应用领域的发
展受到限制。TALEN技术使用了转录激活子样效
应物 (TALE)代替了 ZF作为 DNA识别结构域，原
理上能够一一对应不同的碱基而精确识别靶序列，
克服了 ZFn脱靶切割的问题，使得精确地基因组编
辑技术得到一个推进，但是它仍然存在和 ZFn一样
构建复杂及使用成本高的问题。利用细菌和古细菌
的获得性免疫系统 CRISPR进行基因打靶是基因组
编辑的一个新兴技术，该技术巧妙地利用了原核生
物非编码 RNA介导的 DNA干扰来对目的序列进行
精确切割，这种方法具有精确性高、系统构建简单
和使用成本低、能同时对同一细胞多个位点进行切
割等优势，但是这个技术的应用目前还处于细胞水
平。并且，这一原核系统在面对真核系统复杂的染
色体结构时，究竟能否有效切割，现在还不得而知。
目前，以上 3种方法的应用多是借助 DNA的非同
源末端连接，而利用 DNA同源重组修复介导序列
的插入、置换或修饰的成功案例则较少。在将来的
发展中，如果能够提高同源重组的几率以实现高效
率的定向基因修饰，则能够在遗传疾病治疗和动植
物转基因筛选优良品种或构建生物反应器等方面得
到应用。总而言之，以上几种基因组编辑技术目前
还处于研究的初期阶段，但其在基因操作方面已表
现出巨大的潜力和广阔的应用前景，将对医学和生
物学产生深远的影响。
[参　考　文　献]
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