全 文 ：第25卷 第8期
2013年8月
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
Vol. 25, No. 8
Aug., 2013
文章编号：1004-0374(2013)08-0754-08
同步辐射X射线显微成像技术在细胞生物学中的应用
张　一1，张继超1,2，诸　颖1,2，孙艳红1,2，王　坤1,2，樊春海1,2，黄　庆1,2，蔡小青1,2*
(1 中国科学院上海应用物理研究所物理生物学室，上海 201800；
2 中国科学院上海应用物理研究所光源生物成像中心，上海 201800)
摘　要：生命科学研究很大程度上依赖于对细胞这一微观世界的观察与探索。细胞显微成像技术的进步贯
穿着细胞生物学发展的始终，是生命科学领域的主要推动力之一。基于同步辐射光源的 X射线显微成像技
术具有高分辨率、样品制备简单、能在接近自然状态下对细胞的精细结构进行三维展示等优势，从而被认
为是一类与光学成像、电镜成像互补的新型细胞成像技术。扼要介绍同步辐射 X射线显微成像的基本情况，
重点阐述了同步辐射 X射线显微成像技术在细胞形态及结构、细胞内元素分布等研究方面的最新进展，指
出进一步研究应重点发展的方向。
关键词：同步辐射； X射线显微成像技术； 细胞生物学
中图分类号：Q336 文献标志码：A
The applications in cell biology of the synchrotron-based X-ray microscopy
ZHANG Yi1, ZHANG Ji-Chao1,2, ZHU Ying1,2, SUN Yan-Hong1,2,
WANG Kun1,2, FAN Chun-Hai1,2, HUANG Qing1,2, CAI Xiao-Qing1,2*
(1 Laboratory of Physical Biology, Shanghai Institute of Applied Physics, Chinese Academy of Sciences,
Shanghai 201800, China; 2 Center of Bio-imaging, Shanghai Sychrotron Radiation Facility,
Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201800, China)
Abstract: Life science research relies heavily on observation and exploration of the microscopic world of cells.
Microscopic imaging technology has been advancing throughout the development of cell biology, which is one of
the mainsprings of the life sciences field. The X-ray imaging technique based on synchrotron radiation has some
advantages, such as high-resolution, simple sample preparation and three-dimensional display of the fine structure
of the cells closed to the natural state, which is considered to be a class of imaging technology complemented of
optical imaging and electron microscopy imaging. This paper briefly introduces the basic situation of the
synchrotron radiation X-ray microscopy, and focuses on the latest research advances in cell morphology and
structure, intracellular distribution of elements using the synchrotron radiation X-ray microscopy technology. And at
last, the focused direction of development in further studies is pointed out.
Key words: synchrotron radiation; X-ray microscopy; cell biology
收稿日期：2013-04-24
基金项目：国家重点基础研究发展计划(“973”项目)(2012CB825805，2012CB932600)；国家自然科学基金项目
(11275251，U1232113，10905086，10975179，11179004)
*通信作者：E-mail: caixiaoqing@sinap.ac.cn；Tel: 021-39194068
同步辐射是带电粒子的运动速度接近光速
(v ≈ c)在电磁场中偏转时，沿运动的切线方向发出
的一种电磁辐射，最先在电子同步加速器上发现，
故得此名，又称同步加速器辐射。同步辐射光源是
指产生同步辐射的物理装置。第一代同步辐射光源
是寄生于高能物理实验专用的高能对撞机的兼用
机；第二代同步辐射光源是基于同步辐射专用储存
环的专用机；第三代同步辐射光源为性能更高，且
张　一，等：同步辐射X射线显微成像技术在细胞生物学中的应用第8期 755
在储存环直线段可加装插件磁铁组件的专用机；现
在正在研究的自由电子激光器则为第四代同步辐射
光源。同步辐射波段很宽，可以覆盖从远红外到 X
光的宽广范围，同时具备优异的性能，如高亮度、
高准直性、广谱性、高偏振、窄脉冲高纯洁性 [1]。
同步辐射与样品的作用方式有 20多种。同步
辐射作为入射光照射在样品上，与样品作用后发射
的次级射线可以是透射光、散射光、荧光、光电子、
离子等等。同步辐射 X射线成像方法多种多样，主
要分为吸收成像和光谱成像两大类 (图 1)。传统的
X射线成像技术是基于样品对 X射线的不同吸收系
数而产生衬度的投影成像。近十几年来发展起来的
X射线相位衬度成像具有明显优势，可以对轻元素
构成的生物组织获得高衬度的图像 [2]。利用吸收成
像原理进行成像的 X射线显微术常见的有透射 X
射线显微术 (transmission X-ray microscopy, TXM)
和透射全场成像软 X射线显微术等。X射线荧光分
析方法 (XRF)是利用物质的分子或原子受同步辐射
X射线照射后受到激发，当它们退激后发出荧光，
荧光的波长与分子或原子的能级结构有关，因此，
测量荧光的波长和强度可以确定发出该荧光的元素
种类及含量 [3]。基于第三代同步辐射光源的 XRF
是探测元素微区分布以及量化元素含量的强有力工
具，而且是唯一能定量分析亚微米量级细胞元素分
布的技术 [4]。软 X射线谱学显微技术结合了扫描透
射 X射线显微成像技术 (scanning transmission X-ray
microscopy, STXM)的数十纳米的高空间分辨率和
近边吸收精细结构谱学 (near edge X-ray absorption
fine structure spectroscopy, NEXAFS)的高化学态分
辨能力。利用“水窗”波段 (波长 2.3~4.4 nm)的软
X射线对水的高穿透性特点，软 X射线谱学显微镜
不仅可以研究自然状态下细胞结构和功能的关系，
也可以研究具有一定活性的生物样品的结构和元素
空间分布 [5-6]。
借助光学显微镜和电子显微镜等成像技术的发
展，近百年来，生命科学取得了惊人的成就，随之
对细胞显微成像技术也提出了更高的要求。随着同
步辐射技术的发展，基于同步辐射 X射线的成像技
术也愈来愈受到人们的重视。同步辐射与物质的作
用方式主要为散射和吸收，相关实验方法为 X射线
衍射、X射线吸收、X射线散射以及 X射线相衬成
像 (X-ray phase contrast image)等等。同步辐射相关
成像技术也被喻为“超级显微镜”，在解析生物大
分子结构、亚细胞结构、研究细胞中离子的分布以
及细胞与外界金属粒子的相互作用等方面提供了新
的手段 [7-9]。本文将首先对同步辐射 X射线显微成
像技术的基本概况进行简单的叙述，接着对其在细
胞形态及结构、细胞内元素分布等方面研究的最新
进展作了阐述，最后展望了在进一步的研究中应重
点开展的研究方向。
1　同步辐射X射线显微成像技术的优势
细胞成像领域主要用到 3种途径：电子显微镜、
光学显微镜和 X射线显微镜。目前广为使用的透射
式电子显微镜，尽管其具有 2~3 nm的空间分辨率，
但穿透深度只有数百纳米，只能用来观察数百纳米
厚度的薄样品。近年来发展的层析电子显微镜，虽
然通过提高工作电压将电子穿透深度增加到 1~2
μm，通过真空冷冻和切片方式重建亚细胞结构图
像，然而，复杂的样品制备和特殊的实验环境仍然
是这种层析电子显微镜成像的弊端，其电子的穿透
深度仍然有限，无法利用它来获得完整细胞的三维
结构图像，更不可能对完整含水细胞进行成像。具
体来说，为了获得细胞的三维结构图像，需要对特
殊制备的细胞样品进行耗时费力的切片，这不仅限
制了垂直切片方向的分辨率，而且破坏了样品的完
整性。
光学方法可以识别细胞内不同种类的生物分子
及其运动和相互作用过程，实现功能成像，但受衍
射极限的限制，空间分辨率低，只能达到 200 nm
图1 X射线与样品相互作用机制及成像方法
生命科学 第25卷756
左右。如能突破衍射极限，则可利用光学方法以纳
米量级的空间分辨率获取细胞内生物分子类型分布
信息及其运动和相互作用的动态图像信息。目前较
常见的光学方法主要是荧光显微镜方法。为了实现
纳米分辨，荧光显微成像方法主要有两大途径，即
单点扫描法和宽场单分子定位法。前者以受激发射
损 耗 (stimulated emission depletion, STED)[10] 为 代
表，后者以随机光学重构显微术 (stochastic optical
reconstruction microscopy, STORM)[11]和光激活定位
显微术(photo activated localization microscopy, PALM)[12]
为代表，两者均已实现了二维 20~30 nm的空间分
辨。以 2008年 Science 杂志上的一篇论文为例，图
2给出了细胞内微管的三维图像 [13]。一般来说，荧
光显微成像方法基于特异性标记，更适合于特定细
胞器的结构成像研究和特定运动分子的动态成像研
究。但受现有光学系统景深的限制，目前还没有一
个较好的成像方法，能够在细胞内任意位置实现纳
米分辨的结构和多运动分子动态成像。超分辨荧光
显微镜虽然大幅度提高了分辨率，但很难实现多色
荧光标记成像。
与可见光相比，X 射线波长减小 3个数量级，
衍射受限的分辨率可以达到纳米量级；与电子束相
比，X 射线具有大得多的穿透能力，因而具有三维
纳米空间分辨的巨大潜力。不仅如此，先进的 X 射
线光源还可以发射超短脉冲，形成最锐的时空探针。
X 射线与可见光一样，成像机制多样，衬度来源丰
富，如吸收、散射、荧光、相位等信息都可用来观
察分析多种物理变化、化学反应和纳米结构。由于
X射线波长短，实现 X射线显微成像技术，光斑聚
焦是技术关键。事实上，随着波带片 (zone plate)衍
射棱镜技术的发展，X射线显微技术的分辨率有可
能达到几纳米量级，为在纳米尺度上观察细胞内的
生物大分子提供了可能 [14]。波带片实质上就是一个
圆形的衍射光栅，它是由线密度径向增加的明暗相
间的同心圆环带组成的。波带片的空间分辨率取决
于物镜波带片的最外环宽度 (图 3A)[15] 。图 3B是
上海光源软 X射线谱学显微光束线站 (BL08UA)实
验装置图，主要用于开展亚微米及纳米尺度样品的
软 X射线谱学及显微研究，其空间分辨率可达到
30~50 nm，是细胞与亚细胞器结构研究的有力手段。
在 X射线波段的 2.3~4.4 nm区间 (284~534 eV)
内，蛋白质、脂类和其他含碳氮化合物对光子的吸
收比水要高一个数量级，在此窗口内水环境相对于
生物样品透明，能通过自然衬度提供清晰的细胞图
像，该区间也被形象地称作“水窗”[16]。因此，X
射线显微成像技术所用样品通常不必进行脱水处
理，观测时也无需处于高真空的状态，能够更好地
展现生物体的自然状态。水窗内生物样品对 X射线
的吸收遵循 Lambert-Beer定律，X射线显微镜可以
直接给出定量的生物成像信息。通过投影成像和三
维重构技术，X射线显微技术还能够获得细胞内部
的三维精细结构 [17]。 Nature于 2006年发表专题评
论提出，X射线显微成像技术使细胞纳米成像成为
现实 [18]。
2　细胞形态及亚细胞结构研究
在基于软 X射线对细胞三维结构观察方面，
Lawrence-Berkeley国家实验室先进光源 (ALS)的
左图用传统宽场荧光显微镜获得，右图用STORM方法获得
图2 细胞内荧光标记的微管三维图像[13]
张　一，等：同步辐射X射线显微成像技术在细胞生物学中的应用第8期 757
Larabell课题组进行了一系列开创性的工作。早在
2001年，他们在搭建的 X射线显微平台上进行了
细胞成像，使用 144张细胞局部照片拼出了一张较
完整的高分辨细胞成像结果，分辨率达到 50 nm。
同时，经过对微管蛋白进行纳米金粒子标记，他们
也得到了细胞骨架的高分辨空间分布 [19]。2004年，
他们利用 X射线显微技术实现了对酵母细胞的无标
记与冰冻成像，通过对不同角度记录的 45张高分
辨图片的三维重构实现了对细胞的纳米级三维断层
扫描 (细胞 CT)，可以清晰地显示细胞核、液泡及
多种细胞器 (图 4)[20]。该工作尽管只是高分辨 X射
线细胞显微成像技术的一个简单展示，仍然引起了
生物学界的广泛关注，多次被生物学重要杂志评
论 [16,21-22]，Nature也就此发表了专题评述 [18]。
2009年，Uchida等 [23]对一种真菌细胞——
白色念珠菌，在其不同生理状态 (酵母态与菌丝态 )
下进行了高分辨三维成像，尤其是研究了抗真菌药
物进入白色念珠菌后的分布及引起的结构变化，他
们发现主要成分是脂质体的抗真菌药物能够进入白
色念珠菌的细胞核，从而为真菌感染疾病的药物治
疗机理提供了直接生物学证据。2010年，德国 Dessy
光源实现了 5 μm的鼠腺癌细胞的三维重建，局部
重建的分辨率达到 36 nm，可以看清双层细胞核膜、
细胞核、核膜通道、线粒体的嵴和溶酶体 [24] (图 5)。
除了软 X射线能够对细胞形态及结构进行高
分辨率的三维成像，其他的 X射线显微成像手段，
如硬 X射线显微镜 (TXM)和近年发展起来的 X射
线相干衍射显微镜也可对细胞及亚细胞结构进行高
分辨率的二维及三维成像。台湾同步辐射光源的胡
宇光课题组对纳米金标记的大鼠乳腺癌细胞 (EMT-
6 细胞 )进行了硬 X射线透射显微镜 (TXM)二维成
像，可以很好地显示细胞结构，其二维相衬成像图
更为清晰 [25]。合肥光源的田扬超课题组同样利用硬
X射线显微成像技术对裂殖酵母细胞进行了低衬度
和高衬度的三维结构成像，能很好地分辨细胞内液
泡等亚细胞结构 [26]。2010 年，Nishino 等 [27] 在
SPring-8成像线站上，采用 5 keV相干 X射线衍射
可以实现无损的厚样品染色体高分辨成像，能够显
示染色体在未染色条件下的轴向结构，其二维分辨
率达到 38 nm，三维分辨率达到 120 nm。2010年，
Jiang等 [28]利用相干 X射线衍射成像技术 (coherent
X-ray diffraction imaging)对未染色的酵母的结构进
(A)细胞壁透明的三维显示；(B)细胞壁半透明的三维显示；(C)断层厚度为0.5 μm的断层像，空间分辨率为60 nm
图4 直径5 μm的含水酵母细胞三维成像[20]
f=OD·ΔRn/λ，光斑尺寸取决于最外环带宽，效率取决于波带的高宽比
图3 波带片聚焦原理图(A)和实验装置图(SSRF 08U)(B)。
生命科学 第25卷758
行了高分辨 (Z轴分辨率达到 62 nm，横向分辨率为
41 nm)的结构成像图，可以清晰地对细胞核、内质
网、 液泡、 线粒体进行三维结构成像。更详细的图
示和描述参考见该专刊“相干 X射线衍射成像在生
命科学研究中的应用进展”。
3　细胞内金属元素分布研究
研究细胞内金属元素的分布主要用到的同步辐
射 X射线成像技术是基于同步辐射 X射线荧光成像
技术 (SR-XRF)，它是目前唯一能同时定量多元素分
析的亚微米级分辨率的成像技术，广泛应用在生物、
环境、考古、材料等众多前沿领域 [29]。以下主要介
绍 SXRF以及其他像软 X射线谱学显微技术等 X射
线成像技术在细胞内元素分布研究方面的应用。
同步辐射 X射线荧光显微镜的空间分辨率可
以达到 100 nm以下，其穿透深度可达到 1 000 µm
左右，可以分析整个细胞而不需要进行细胞切片，
特别适合分析生物样品 [30-31]。McRae等 [32]利用
SXRF对贴壁的小鼠 NIH3T3成纤维细胞内相关生
物元素进行了成像分析 (图 6)，获得了常见元素 K、
Cl、Cu、Zn、Ca、P、S、Mn等的细胞内分布图 (图
6)。Ortega等 [33]利用大鼠嗜铬细胞瘤 (PC12)细胞
作为多巴胺能细胞的体外模型，研究在神经生长因
子 (NGF)刺激分化的条件下细胞内金属元素的分布
变化。虽然 P、S、Cl、K和 Zn相当均匀地分布在
细胞中，但 Fe却主要分布在多巴胺囊泡中，在分
左图：观察到类肽药物导致核内结构和液泡的变化[23]；右图：局部空间分辨率达到36 nm[24]
图5 念珠菌细胞三维成像(左)和鼠腺癌细胞三维成像(右)图
(a)图为细胞的光学显微镜图；(b)图为生物相关元素细胞内分XRF图
图6 小鼠NIH3T3成纤维细胞的XRF成像图[32]
张　一，等：同步辐射X射线显微成像技术在细胞生物学中的应用第8期 759
化生成的神经元突起中积累了大量的 Cu、Zn。
血管生成是一个生理过程，是指从已有的毛细
血管或毛细血管后静脉发展而形成新的血管。虽然
血管生成对正常的生长发育是至关重要的，但它在
肿瘤的发展过程中也起着重要的作用 [34]。在肿瘤的
形成过程中，原有的血管系统无法供应足够的氧气
和营养物质，就会刺激机体形成新生的血管，因此，
抑制血管生成已演变成一种重要的癌症治疗策略。
在多种肿瘤类型中，铜的消耗已被证明能够抑制血
管生成，但是其作用机制仍然不清楚 [35]。为了深入
了解铜在血管生成中的作用，Finney等 [36]利用同
步辐射 XRF成像技术对微血管内皮细胞内铜离子
分布进行成像实验，实验结果显示大量铜离子在细
胞内重新定位，并且会随着细胞的生长而发生变化，
逐渐向生长点靠近而被排出细胞外。
在阐明无机顺铂药物在一些肿瘤中的耐药性生
理机理研究中，也会常用 SR-XRF成像技术。例如，
利用 SXRF技术研究顺铂或其他含铂抗癌药物在人
类卵巢腺癌细胞中分布时，发现耐药细胞铂的摄取
量比不耐药的细胞摄取量要低 50%[37]。Chen等 [38]
为了阐明黑色素瘤的耐药机制，利用 SR-XRF研究
顺铂在表皮癌细胞内的分布，结果表明耐药性细胞
中的铂主要累积在细胞黑素体内，以有利于增加黑
素小体介导的药物排出，这可能是其产生耐药的主
要原因。Alderen等 [39]首次利用 X射线荧光断层扫
描技术可视化地研究铂类药物在肿瘤细胞多阶段中
的三维空间分布，三维扫描图像显示铂类药物进入
细胞的量很少，而主要聚集在细胞的表面。
上海光源软 X射线双能吸收衬度成像技术也
能对细胞内金属元素的分布进行研究。中科院上海
生命科学院王慧课题组利用上海光源软 X射线双能
吸收衬度成像研究一种铁鏊合剂 (TSC24-Fe)在
Hep3B细胞中的分布，实验结果表明铁鏊合剂在细
胞中的分布较对照组更为集中，这表明铁鏊合剂
(TSC24-Fe)破坏了细胞内铁离子动态平衡，这可能
是铁鏊合剂 (TSC24-Fe)抑制肝癌生长的原因之一 [40]。
诸颖等 [41]对基于纳米金刚石载体的钠、铜等多种
金属离子输运系统的形成及其和细胞相互作用的详
细过程进行了可视化的考察，为纳米金刚石 -离子
输运系统的生物学效应研究提供了关键性证据。陈
楠等 [42]对 CdTe量子点的亚细胞定位进行了软 X
射线双能吸收衬度成像研究，发现 CdTe量子点在
细胞内呈现不均一的分布，主要富集在核膜外围区
域，同步辐射 X射线成像和荧光成像的信号比对完
全一致，这为解释镉系量子点的细胞生物学效应提
供了关键性证据。蔡小青等 [43]利用高分辨的同步
辐射 X射线透射显微镜 (TXM)研究 Tiopronin修饰
的纳米金颗粒在 HeLa细胞内分布，结果显示该颗
粒被细胞大量摄取，并分布在细胞核周围胞质中，
在细胞核内并无分布 (图 7)。
4　单细胞内多蛋白定位的潜在应用
除了形态信息以外，细胞内蛋白质的定位、转
运以及分布信息对于生物学研究非常重要，可以揭
示细胞生理现象的深层次原因。但是，在 X射线显
微技术中，仅有样品的自然吸收衬度或相位衬度是
不够的，因为它们几乎没有生物化学的专一性。这
就需要将 X射线显微技术和生物探针技术相结合，
发展适合 X射线显微成像技术的各种生物探针，实
现对生物大分子的高分辨空间定位。由于第三代同
(A)图为TXM透射图；(B)图为Tiopronin修饰的金纳米颗粒细胞内分布三维成像图
图7 Tiopronin修饰的金纳米颗粒细胞内分布TXM图[43]
生命科学 第25卷760
步辐射光源亮度高且光源能量连续可调，而 X射线
吸收的精细结构 (例如 K和 L边吸收 )对不同元素
具有特征性，因此，可以借助含有金属元素的生物
探针对蛋白质等生物大分子进行标记，从而得到其
高分辨的空间定位信息。
研制适合于 X射线显微技术的新型生物探针
是该领域的关键问题之一。一些纳米材料，如量子
点在生物荧光标记成像等许多方面已经得到深入的
研究和广泛的应用。例如，纳米二氧化钛 (TiO2)粒
子通过生物素 -亲和素偶联系统与微管蛋白 (tubulin)
抗体进行连接后，可以作为软 X射线探针得到体外
聚集的微管蛋白束的成像，这表明了纳米 TiO2粒
子可以作为 X射线显微探针对蛋白质分子进行标
记 [44]。DNA分子在标记纳米 TiO2粒子后也可以作
为分子探针进行 X射线显微成像，清晰展示出其在
细胞内的分布 [45]。
量子点是一种直径在 10 nm以下的荧光纳米晶
体，具有宽激发、窄发射、荧光产率高和发光稳定
等显著优点，已成为细胞成像中的一种重要生物探
针 [46-47]。由于量子点等材料含有在软 X射线区有强
特征吸收谱线 (L或M边 )的金属元素，且这些元
素通常在生物体内不存在，因此，有可能用作软 X
射线成像中的探针。有趣的是，由于 II-IV族量子
点含有镉、硒、碲等高原子序数的元素，Corezzi
等 [48]利用 CdSe量子点上的 Se元素分布，实现了
X射线显微技术对蛋白质细胞分布的观察。他们使
用 CdSe量子点标记了细胞膜上的 HER2蛋白，并
用 X射线显微技术与激光扫描共聚焦显微技术进行
了成像，结果显示，通过 X射线显微技术得到的
Se元素分布信号与激光扫描共聚焦显微镜得到的荧
光信号有很好的重合。
胶体金粒子被广泛应用于电子显微镜的抗体标
记探针。McRae等 [32]探讨了利用市售的 1.4 nm的
FluoroNanogold (FNG)连接抗体作为同时具有光学
荧光和同步辐射 X射线荧光 (SXRF)成像双重功能
的探针的可行性。应用标准免疫荧光实验方法，利
用该探针对细胞内亚细胞器高尔基体、线粒体进行
标记，荧光成像图像和同步 SXRF成像图像显示，
两者具有很好的相关性，都能清楚地显示亚细胞器
的结构，这证明了纳米金作为 X射线显微成像探针
的可行性。
5　结论与展望
X射线的生物显微成像技术在国际上尚处于起
步阶段，但该技术在高分辨率细胞成像和生物大分
子定位方面展现出的独特优势已使其成为生物显微
成像领域的一个发展热点。然而，基于同步辐射的
X射线显微技术仍需要在以下几个方面取得突破：
(1) 由于 X射线的超短波长，该成像技术的分辨率
理论上有很大的上升空间，如果能达到预期的 10
nm分辨率，就有可能对细胞内的生物大分子及其
复合物进行直接成像；(2) 需要设计与发展一系列
适合于 X射线显微成像的生物探针，以对生物大分
子在细胞内的空间分布进行研究。此外，X射线显
微成像技术由于其专业性要求高，且受到必须依托
同步辐射光源的限制，在生物学研究中的实际应用
还比较有限，迫切需要多学科研究团队的配合和参
与，以期在生命科学前沿科学问题的探索中取得
突破。
[参　考　文　献]
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