全 文 ：第23卷 第9期
2011年9月
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
Vol. 23, No. 9
Sep., 2011
文章编号：1004-0374(2011)09-0838-06
微生物基因组简化的研究进展
李　杨1,2，陈　涛1*，赵学明1
(1 天津大学化工学院生物工程系，系统生物工程教育部重点实验室，天津大学-爱丁堡大学系统生物
学与合成生物学联合研究中心，天津 300072；2 石河子大学生命科学学院，石河子 832000)
摘　要：微生物基因组简化是合成生物学研究热点之一。基因组的适度精简可使细胞代谢途径得以优化，
改善细胞对底物、能量的利用效率，大大提高细胞生理性能的预测性和可控性。基因组简化细胞将为生物
技术的应用提供理想的底盘细胞。回顾了构建基因组简化细胞的研究策略、研究方法及一些模式生物相关
研究进展，总结了基因组简化研究所面临的问题及解决办法，对基因组减小化研究发展趋势前景进行了展望。
关键词：简化基因组；必需基因；基因敲除
中图分类号：Q813; O621.33 文献标志码：A
Progress in development of microbial reduced genome
LI Yang1,2, CHEN Tao1*, ZHAO Xue-Ming1
(1 Department of Biochemical Engineering, School of Chemical Engineering & Technology, Tianjin University, Key
Laboratory of Systems Bioengineering Ministry of Education, Edinburgh-Tianjin Joint Research Centre for Systems Biology
and Synthetic Biology, Tianjin 300072, China; 2 College of Life Science, Shihezi University, Shihezi 832000, China)
Abstract: Research on microbial reduced genome is a key focus of synthetic biology. An engineering cell with
reduced genome and robust, predictable, controllable physiological traits could be built by rational design and gene
manipulation, which could serve as a desired chassis cell for biotechnological applications. In this paper, the
research strategies, empirical methods for genome reduction and related research progress of some model
microorganisms were reviewed. The difficult problems and solutions when constructing the reduced genome cell, as
well as application prospects of the reduced genome cell were discussed.
Key words: reduced genome; essential gene; gene knock out
收稿日期：2011-05-16
基金项目：国家重点基础研究发展计划(“973”项目)
(2007CB707802，2011CBA00804)；国家自然科学基
金项目(20536040)
*通信作者：E-mail: chentao@tju.edu.cn; Tel: 022-
27892083
近年来，应用合成生物学概念、理论和分子生
物学实验方法提升菌株生产性能，已成为目前工业
生物技术领域的研究热点之一。它的主要研究内容
是借鉴工程学思想，利用基因组和基因等基本要素，
通过理性设计，改造或重构生物分子、生化反应、
代谢途径乃至具有生命活力的新细胞或生物个体以
实现特定功能 [1]。通过遗传改造，构建一个具有可
预测、可控制表型且生理性状优良的底盘细胞
(chassis cell)，将为合成生物学研究及应用奠定理想
的工作平台 [2-3]。目前关于底盘细胞的研究工作主
要集中于基因组简化方面 [4]。已有相关文章综述了
大肠杆菌简化基因组方面的研究进展 [4-6]。本文从
构建基因组简化细胞的研究历史、研究策略、实验
方法、模式菌相关研究进展进行回顾、总结，并就
面临的问题和解决办法、发展前景等方面作了探讨。
对众多模式生物的基因组测序、功能基因的研
究发现，在长期进化历程中，通过基因水平转移等
途径，微生物摄入外源 DNA序列并将其保留在基
因组上，致使基因组容量增大，结构组成复杂化；
李　杨，等：微生物基因组简化的研究进展第9期 839
另一方面，特定环境条件下，基因组部分序列发生
丢失而致使基因组减小 [7-8]。例如，某些寄生或共
生生物通过染色体重组、突变舍弃部分非必需基因
序列，以更好适应特殊生存环境的变化。由此获得
启示，应用特定技术去除基因组上非必需的 DNA
序列，优化细胞代谢途径，改善细胞生产性能，可
获得具有生产应用潜力的工程菌菌株。
最小基因组 (minimum genome)概念的提出 [9]
是基于一种理想假设，即假设细胞在含有一套最少
的基因集合 (minimal gene set)的情况下足以维持正
常生命功能。最小基因组研究对生命起源、基因组
进化、细胞代谢等理论研究有重要意义，有助于加
深对细胞功能及生命进化规律的研究认识。然而，
由于对必需基因 (essential gene)的鉴别以及技术手
段方面的局限，构建最小基因组细胞难以一步实现，
一般要通过分步操作以剔除染色体上非必需基因序
列，在所获得一系列基因组简化 (reduced genome)
细胞的基础上，循序渐进地改造，最终获得最小基
因组或最小化基因组 (minimized genome)细胞。然
而，从实际角度看，只含有必需基因的最小基因组
细胞，仅能维持细胞基本代谢，并不一定具有生长
快、抗逆性强等有利性状及实际应用潜力。对基因
组简化细胞而言，由于降低了基因组的复杂度，去
除或减小了非必需代谢途径的干扰，优化了细胞生
化代谢网络，提高细胞对底物和能量的利用效率，
细胞遗传稳定性以及生理表型的可控制性、可预测
性、可操作性将大大增加 [2-3]，可作为高效表达外
源基因的理想宿主细胞，而且对简化基因组及最小
基因组的研究也将为系统生物学、基因组尺度代谢
网络建立、验证、修正算法以及计算模拟提供生物
模型基础 [8-9]。
1　研究技术路线
构建简化基因组或最小化基因组细胞，一般可
采用自下而上 (bottom-up)和自上而下 (top-down)
两条技术路线 [10]。
1.1　自下而上路线
自下而上的策略是通过理性设计，采用从头合
成路线，利用标准化元件逐步组装构建遗传线路、
功能基因模块以至合成基因组。由于 DNA合成技
术、测序技术快速发展，截至目前，脊髓灰质炎病毒、
ΦΧ-174噬菌体、生殖道支原体等物种的基因组人
工合成已陆续完成。Venter等 [11-13]将合成、组装的
支原体基因组移植入另一株已剔除基因组的近缘支
原体细胞中，细胞能正常生长，表明人工合成基因
组也能表现生物活性。Gibson等 [14]设计、组装合
成了蕈状支原体基因组 (1.08 Mb)，将其移植至山羊
支原体细胞中，构建了新的蕈状支原体细胞，研究
发现，仅含有合成基因组的细胞能表现连续自我复
制等生理性状。
虽然以从头合成路线构建最小基因组细胞技术
日益成熟，但也面临着许多困难和挑战。目前对基
因必需性、生物系统结构及代谢途径、调控网络复
杂性和功能基因还缺乏足够深入研究和认识。基于
现有研究分析方法和技术，基因组中必需基因的数
目及组成尚难以精准预测和确定 [15-16]。此外，目前
在将大 DNA片段 (全基因组 )转移至细胞群体中
以及正常表达功能也存在困难。例如，移植基因组
及基因活性会受宿主细胞基因组 DNA甲基化及组
蛋白修饰作用的影响。随着对基因组结构、功能基
因以及必需基因的研究认识深入，采用从头合成路
线构建最小基因组细胞将成为可能 [17-18]。
1.2　自上而下路线
自上而下的技术路线是对遗传背景已知的基因
组进行对基因组染色体大片段删减操作，尽可能去
除非必需基因 DNA序列，逐步缩减基因组的规模，
构建简化或最小化基因组细胞。与自下而上路线相
比，此技术路线因大片段序列敲除技术成熟、简单
可行，因而较多的研究工作是采用删减策略构建简
化基因组或最小化基因组工程菌细胞 [4]。下文主要
侧重综述这方面的研究进展。
2　研究方法
2.1　敲除靶点选择和确定
通过基因组删减构建基因组简化细胞，首要面
临确定敲除基因目标区段的问题。在对基因必需性
充分认识的基础上，合理选择非必需基因所在核酸
序列区段作为删除操作的靶点。必需基因及非必需
基因的识别目前主要利用比较基因组学、功能基因
组学和代谢网络计算模拟等方法初步预测、分析确
定，并结合单基因或多基因组合敲除试验加以确证。
结合干试验、湿试验的研究结果，确定细胞含有必
需基因数目及其组成 [2-3,19]。Mushegian 和 Koonin[20]
对生殖道支原体和流感嗜血杆菌基因组序列比较分
析，推断独立生活细胞的基因组至少含 256个必需
基因。Hutchison 等 [21]利用转座子随机诱变的单基
因分步敲除或失活试验，推断生殖道支原体的必需
基因数目约 265~350个。Glass等 [22]通过基因随机
生命科学 第23卷840
敲除实验确定生殖道支原体必需基因由 382个蛋白
基因及 43个 RNA基因构成 ,某些基因的缺失突变
能使菌株加速生长。关于最小基因组必需基因数量
的研究为简化基因组、最小基因组的研究提供基本
信息。Martelli等 [23]利用大肠杆菌代谢网络模型，
采用基于限制的模拟方法进行菌体生长模拟的试
验，模拟结果和实验数据高度一致，研究发现，由
必需基因所编码的酶催化的反应通量通常波动很
小，必需基因与代谢通量波动之间的相关性为基因
必需性的预测提供了一种新思路。
2.2　敲除实验方法
染色体片段敲除有定点敲除和随机敲除两类。
定点敲除是利用自杀性质粒介导、线性 DNA介导
的同源重组对目标区域进行精确敲除 [4-5,24]。而随机
敲除是利用转座子随机插入或切离引发的重组实现
DNA片段的敲除。与随机敲除相比，采用定点敲
除方法，后续的缺失突变体筛选、鉴定等工作量可
大大减少。在基因组必需基因信息认识不够清楚的
情况下，较适合采用随机敲除方法。需要注意的是，
一些敲除操作或多或少会在基因组上遗留某些“外
源核酸”序列，对基因组稳定性、基因功能，以及
后续遗传操作可能产生不利影响。
3　模式菌基因组简化研究
自 20世纪末，日本、美国等先后启动了“最
小基因组工厂”、“从基因组到生命”等研究计划。
截至目前，关于支原体、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、
谷氨酸棒杆菌、酿酒酵母等模式生物最小化基因组
的研究已相继报道。其中，关于大肠杆菌的研究工
作相对较多。
3.1　大肠杆菌
Yu等 [25-26]利用两种携带不同选择标记的 Tn5
转座子分别构建两个独立的转座子突变库，转座子
在突变株基因组中精确定位，通过 P1噬菌体转导
将两个库突变株的不同转座子整合到一个基因组
中，利用 loxP位点重组删除两个转座子之间的
DNA片段，获得一系列基因组简化菌株 (删除
59~117 kb)，在实验室培养条件下，基因组删除了
287个 ORF(总计 313.7 kb)的一菌株能正常生长。
Kolisnychenko等 [27]敲除了包括前噬菌体、转座子
和未知功能基因的 12个 K岛片段，获得菌株
MDS12(基因组减小了 8.1%)。在无机盐培养基上，
菌株生长速率与野生型菌相似。Hashimoto等 [28]构
建了基因组简化菌株 (删除了 2.4%~29.7%)，细胞
形状和类核体组织有明显变化。Posfai等 [29]基于比
较基因组分析，选择 100个候选敲除区域 (包括基
因重组和转移相关及前噬菌体等基因区域 )，以
MDS12菌株为出发菌株，构建多重敲除菌株 (基因
组缩减了 15%)，菌株生长、蛋白质表达特性正常，
其电转化效率、基因复制、质粒稳定性等性状比野
生株好。Mizoguchi等 [30-31]比较分析了大肠杆菌和
Buchnera sp.基因组序列，选择大肠杆菌特有基因
作为敲除区域 (包含 103个基因 )，通过单基因敲
除试验，发现其中 84个基因的敲除不影响细胞生
长速率，继续进行多基因组合敲除，获得菌株
MGF-01(敲除 1.03 Mb)，其生长速率与野生株相同，
且最高菌体浓度为野生株的 1.5倍。利用此菌株表
达生产 L-苏氨酸，L-苏氨酸产量比以野生株为宿
主构建的细胞高 2.4倍。Sharma等 [32-33]利用基因组
简化菌株表达重组蛋白氯霉素乙酰转移酶，菌株生
长速率和重组蛋白产量均与野生菌类似，由于乙酸
积累致使菌体终浓度有所降低。Lee等 [34]在基因组
减小菌株MDS42(基因组删除 14.3%)中导入 L-苏
氨酸高产相关基因，菌株 L-苏氨酸产量比对照菌
株高 83%。与野生型菌株相比，基因组简化菌株生
理特性变化小，遗传稳定，显示出了较好的生产应
用潜力。
值得注意的是，即使针对同一物种的研究工作，
各个研究者选择的敲除目标区段不同，选用的敲除
技术、敲除操作先后次序也有差异，敲除靶点、敲
除方法及敲除操作步骤的差异是否对最终获得的基
因组简化菌株的生理性状有影响，还没有相关研究，
值得关注。
3.2　枯草芽孢杆菌
Kobayashi等 [35]根据前人研究及预测，并结合
单基因敲除试验，最终确定 271个基因是枯草芽
胞杆菌在丰富培养环境生长所必需的，在必需基
因中，功能未知的基因占 4%，为基因组简化的研
究奠定了基础。Westers等 [36]分步敲除了基因组
上前噬菌体区 (SPβ、PBSX)、类前噬菌体区 (skin、
pro1、pro3)及 pks操纵子，获得了基因组删减了
7.7%(包括 332个基因 )的△ 6菌株。与野生株相比，
△ 6菌株在代谢通量、感受态和芽胞形成特性等方
面无显著变化，但蛋白质组、蛋白质分泌及细胞运
动性有明显差异。△ 6 菌株缺少导致转化效率降低
和质粒不稳定的 BsuM 限制修饰系统，对后续的遗
传改造十分有利。Ara等 [37]依次敲除了前噬菌体区
SPβ、PBSX、 pro1-6、skin及编码次生产物的 pks、
李　杨，等：微生物基因组简化的研究进展第9期 841
pps操纵子，构建了基因组简化菌株MGB469，细
胞生长基本正常，外源重组蛋白表达无预期的明显
优势特性。对此菌株进一步敲除操作 , 获得菌株
MG1M(删减 0.99 Mb)，但是菌株继代培养后生长
速率、细胞形态、重组蛋白产量等性状不稳定。研
究表明，基因组过多删除可能对菌株保持某些生理
性状是不利的。Morimoto等 [38]分析确定了不编码
RNA或基本蛋白质的连续序列片段 (大于 10 kb)，
排除了部分涉及初级代谢的基因，以基因组简化菌
株MGB469为出发株，采用 upp选择标记的无痕敲
除操作获得基因组简化菌株MBG874(敲除 20.7%
基因组 )，MBG874菌株生长速率比野生株有所降
低，细胞形态和染色体分布变化小。利用此菌株表
达碱性纤维素酶及碱性蛋白酶活性分别比野生株提
高 1.7和 2.5倍。虽然MBG874菌株基因组删减量
(0.874 Mb)比此前构建的MG1M菌株 (0.99 Mb)少，
但是该菌株生长速率、细胞形态、外源蛋白表达却
相对较为稳定，至于基因组较多删减为何会导致某
些不利生理性状的产生，还有待于进一步研究。
3.3　其他原核生物
Tsuge等 [39]采用转座子和 Cre/loxP重组酶系统
组合敲除 0.2~186 kb，获得了 42株突变株，实验确
定占基因组 11.9%的 393.6 kb的序列片段是实验室
培养条件下非必需的，为基因组删减操作提供了依
据。Suzuki等 [40]利用 Cre/loxP 重组系统删除谷氨
酸棒杆菌包括 188个开放阅读框的 DNA序列片段
(190 kb)，所得基因组简化菌株在实验室培养条件
下能正常生长。
Komatsu等 [41]利用 Cre/loxP重组系统分步删
除了大于 1.4 Mb染色体区段，获得一系列阿维链
霉菌基因组简化菌株 (删除 83.12%~81.46%基因
组 )。将链霉素、头孢霉素 C及大环内酯类抗生素
pladienolide合成相关基因簇基因分别导入突变株细
胞中并检测产物表达，基因组简化菌株链霉素和头
孢霉素 C产量高于天然生产菌株；基因组简化菌株
本身不能合成pladienolide，在导入调控基因pldR后，
菌株能合成 pladienolide，导入的外源基因使某些突
变株能有效生产植物萜类合成中间前体——紫穗
槐 -4,11-二烯。研究表明，与阿维链霉菌野生菌株
相比，基因组简化菌株在抗生素等天然或非天然次
生代谢产物生产方面优势明显。
3.4　真核微生物
关于酿酒酵母、粟酒裂殖酵母基因组简化研究
相对较少。Murakami 等 [42]通过软件分析，排除了
已知必需基因及某些因删除可能致死或有不利性
状的基因，利用 PCR介导染色体分裂技术，经过
多步操作敲除了酿酒酵母染色体目标片段区域，
获得了缺失 5% (531.5 kb) 的基因组简化菌株，与
野生型相比，此菌株乙醇产量增加至 1.8倍，甘油
生产增加至 2倍，在含 7.5%乙醇、1 mol/L NaCl
或 1.5 mol/L山梨醇培养基中，对热、酸、碱、抗
压能力与野生型相似。结果显示，对基因组的删减
操作一定程度上改善了菌株生产乙醇的性能，并且
提高了对环境的适应能力。Kim等 [43]对粟酒裂殖
酵母与芽殖酵母基因组进行了比较分析，研究发现，
在两类酵母基因组中，83%的单拷贝基因同源，涉
及线粒体蛋白翻译、细胞周期调控点等途径的必需
基因有差异，裂殖酵母的必需基因数量比芽殖酵母
多，为基因组简化研究奠定了基础。Hirashima等 [44]
利用染色体和线性 DNA的同源重组对粟酒裂殖酵
母基因组进行大片段 DNA敲除。Giga-Hama等 [45]
对粟酒裂殖酵母基因组序列分析确定必需基因，利
用 Latour改良方法进行逐步敲除操作，获得基因组
删减了 500 kb的突变菌株，继续敲除了菌株蛋白酶
基因，利用最终获得的基因组简化菌株表达生产人
生长激素，结果显示，基因组简化菌株表达的外源
蛋白产量比对照野生株高。通过构建基因组简化菌
株，可获得高效表达外源目的基因的宿主细胞。
目前关于基因组简化的研究主要集中于少数模
式菌株，由于功能基因组研究、遗传转化系统等方
面的欠缺和局限，关于其他微生物的相关研究还很
少见报道。
4　存在问题及展望
从理论上讲，基因组最大程度地简化可以优化
代谢网络，提升细胞生产性能。基因组中非必需基
因比例较大，因此 ,基因组简化还有进一步操作的
可能。然而，研究发现，某些基因组高度精简的突
变株生长速率也无优势，对培养环境的适应能力差，
遗传稳定性差 [38-39]，由此可见，忽视基因组中各基
因之间可能存在的相互作用，片面追求基因组最小
化，对基因组过多地删减操作也可能对菌株生长、
代谢以及后续遗传改造有不利影响。因此，应根据
具体研究目的合理选择敲除靶区域，进行适度删减，
才可能保证菌株在人为控制环境下表现快速生长、
高效生产等优良性状。
研究发现，在特定培养条件下，某些必需基因
是细胞生存所必需的，如果环境条件改变，某些基
生命科学 第23卷842
因可能并不是细胞生存所必需的。因此，为了获得
具有鲁棒性、应用潜力的基因组简化菌株，在选择
敲除目标区域时，需要保留必需基因及条件必需基
因 (conditionaly essential gene，即在特定环境生存
所必需的基因 )[46]，同时，还要结合多样化的环境
加以筛选。通过培养基以及培养条件的进一步优化，
促进基因组简化菌株的生产效能的提高和实际应
用。
必需基因的准确全面预测是构建基因组最小化
菌株的基础。目前关于必需基因的预测方法还存在
某些缺陷 [47]。比较基因组分析所获得预测结果的准
确性与分析选取的参照物种基因组有关，研究发现，
基于近缘物种基因组的比较获得非必需基因信息较
准确 [29]；基因敲除试验的结果不一定准确反映基因
必需性。有关研究发现，某些毒性基因与其对应的
拮抗基因的组合敲除并不会对细胞有致死效应 [28]，
如果只敲除此拮抗基因则可能使细胞致死。此外，
某些非必需基因的组合敲除也可能导致细胞死亡。
基于系统生物学的模拟预测结果也可能由于代谢网
络模型的精度及完善程度等原因而与实际结果有差
异。需要在逐步完善基因组尺度代谢网络模型基础
上，将基于计算系统生物学的模拟预测方法与基因
敲除方法相结合，提高对必需基因的识别和鉴定的
可靠性 [8,48]。综合运用多种方法预测分析基因必需
性将是今后相关研究的重要发展趋势。
为了避免某些基因敲除方法可能导致染色体上
遗留“污染”序列，有学者在大肠杆菌、枯草芽孢
杆菌基因组简化研究中应用无痕敲除方法 [38,49,50]。
然而，适用于其他微生物的无痕敲除技术还有待于
研究探索。
基因组简化细胞有助于构建具有实际用途的精
巧、个性化生物引擎 [3,51]，可为医药、化学品、再
生能源生产以及环境污染治理提供理想的表达宿主
细胞。在基因组简化或最小化菌株平台基础上，根
据具体的研究目的，添加特定功能基因模块，使之
在细胞中稳定表达，用于药物蛋白、基因疫苗、蛋
白酶、维生素、聚羟链烷酸酯等医药产品、大宗化
学品、生物材料和生物能源等生物基化学品的大规
模生产，具有重要而广阔的应用前景。
[参　考　文　献]
[1] Liang J, Luo Y, Zhao H. Synthetic biology: putting
synthesis into biology. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol
Med, 2011, 3(1):7-20
[2] Foley PL, Shuler ML. Considerations for the design and
construction of a synthetic platform cell for biotechnological
applications. Biotechnol Bioeng, 2010, 105: 26-36
[3] Vickers CE, Blank LM, Krömer JO. Grand challenge
commentary: Chassis cells for industrial biochemical
production. Nat Chem Biol, 2010, 6(12): 875-7
[4] Lee SY. Systems biology and biotechnology of
Escherichia coli [M]// Sung BH, Lee JH, Kim SC.
Escherichia coli genome engineering and minimization
for the construction of a bioengine. Germany: Springer,
2009:19-40
[5] 方宏清, 陈惠鹏. 大肠杆菌基因组减小研究进展. 生物
技术通讯, 2009, 20(4): 564-7
[6] Zhang LY, Chang SH, Wang J. Synthetic biology: From
the first synthetic cell to see its current situation and future
development. Chn Sci Bull, 2011, 56(3): 229-37
[7] Zhou JZ, Thompson DK, Xu Y, et al. Microbial functional
genomics[M]// Zhou JZ, Thompson DK. Microbial
evolution from a genomics perspective. New Jersey: John
Wiley & Sons, Inc., 2004 : 67-111
[8] Pál C, Papp B, Lercher MJ, et al. Chance and necessity in
the evolution of minimal metabolic networks. Nature,
2006, 440(7084): 667-70
[9] Klasson L, Andersson SG. Research on small genomes:
implications for synthetic biology. Bioessays, 2010, 32(4):
288-95
[10] Szathmáry E. Life: In search of the simplest cell. Nature,
2005, 433: 469-70
[11] Gibson DG, Benders GA, Andrews-Pfannkoch C, et al.
Complete chemical synthesis, assembly, and cloning of a
Mycoplasma genitalium genome. Science, 2008, 319:
1215-20
[12] Gibson DG, Benders GA, Axelrod KC, et al. One-step
assembly in yeast of 25 overlapping DNA fragments to
form a complete synthetic Mycoplasma genitalium
genome. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105: 20404-9
[13] Lartigue C, Glass JI, Alperovich N, et al. Genome
transplantation in bacteria: changing one species to
another. Science, 2007, 317 (5838): 632-8
[14] Gibson DG, Glass JI, Lartigue C, et al. Creation of a
bacterial cell controlled by a chemically synthesized
genome. Science, 2010, 329: 52-6
[15] Moya A, Gil R, Latorre A, et al. Toward minimal bacterial
cells: evolution vs design. FEMS Microbiol Rev, 2009,
33(1): 225-35
[16] Forster AC, Church GM. Towards synthesis of a minimal
cell. Mol Syst Biol, 2006, 2: 45
[17] Zhang LY, Chang SH, Wang J. How to make a minimal
genome for synthetic minimal cell. Protein Cell, 2010,
1(5): 427-34
[18] Wang HH. Synthetic genomes for synthetic biology. J Mol
Cell Biol, 2010, 2: 178-9
[19] Gil R, Silva FJ, Peretó J, et al. Determination of the core
of a minimal bacterial gene set. Microbiol Mol Biol Rev,
2004, 68(3): 518-37
[20] Mushegian AR, Koonin EV. A minimal gene set for
cellular life derived by comparison of complete bacterial
李　杨，等：微生物基因组简化的研究进展第9期 843
genomes. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93(19): 10268-
73
[21] Hutchison CA, Peterson SN, Gill SR, et al. Global
transposon mutagenesis and a minimal Mycoplasma
genome. Science, 1999, 286: 2165-9
[22] Glass JI, Assad-Garcia N, Alperovich N, et al. Essential
genes of a minimal bacterium. Proc Natl Acad Sci USA,
2006,103: 425-30
[23] Martelli C, De Martino A, Marinari E, et al. Identifying
essential genes in Escherichia coli from a metabolic
optimization principle. Proc Natl Acad Sci USA, 2009,
106(8): 2607-11
[24] 谢承佳, 何冰芳, 李霜. 基因敲除技术及其在微生物代
谢工程方面的应用. 生物加工过程, 2007, 5(3): 10-4
[25] Yu BJ, Sung BH, Koob MD, et al. Minimization of the
Escherichia coli genome using a Tn5-targeted Cre/loxP
excision system. Nat Biotechnol, 2002, 20(10): 1018-23
[26] Yu BJ, Kim C. Minimization of the Escherichia coli
genome using the Tn5-targeted Cre/loxP excision system.
Methods Mol Biol, 2008, 416: 261-77
[27] Kolisnychenko V, Plunkett G 3rd, Herring CD, et al.
Engineering a reduced Escherichia coli genome. Genome
Res, 2002, 12(4): 640-7
[28] Hashimoto M, Ichimura T, Mizoguchi H, et al. Cell size
and nucleoid organization of engineered Escherichia coli
cells with a reduced genome. Mol Microbiol, 2005, 55(1):
137-49
[29] Pósfai G, Plunkett G 3rd, Fehér T, et al. Emergent
properties of reduced-genome Escherichia coli. Science,
2006, 312(5776): 1044-6
[30] Mizoguchi H, Mori H, Fujio T. Escherichia coli minimum
genome factory. Biotechnol Appl Biochem, 2007, 46(3):
157-67
[31] Mizoguchi H, Sawano Y, Kato J, et al. Superpositioning of
deletions promotes growth of Escherichia coli with a
reduced genome. DNA Res, 2008, 15(5): 277-84
[32] Sharma SS, Campbell JW, Blattner FR, et al. Expression
of two recombinant chloramphenicol acetyltransferase
variants in highly reduced genome Escherichia coli
strains. Biotechnol Bioeng, 2007, 98(5): 1056-70
[33] Sharma SS, Blattner FR, Harcumc SW. Recombinant
protein production in an Escherichia coli reduced genome
strain. Metab Eng, 2007, 9(2): 133-41
[34] Lee JH, Sung BH, Kim MS, et al. Metabolic engineering
of a reduced-genome strain of Escherichia coli for
L-threonine production. Microb Cell Fact, 2009, 8: 2
[35] Kobayashi K, Ehrlich SD, Albertini A, et al. Essential Ba-
cillus subtilis genes. Proc Natl Acad Sci USA, 2003,
100(8): 4678-83
[36] Westers H, Dorenbos R, van Dijl JM, et al. Genome
engineering reveals large dispensable regions in Bacillus
subtilis. Mol Biol Evol, 2003, 20(12): 2076-90
[37] Ara K, Ozaki K, Nakamura K. Bacillus minimum genome
factory: effective utilization of microbial genome
information. Biotechnol Appl Biochem, 2007, 46: 169-78
[38] Morimoto T, Kadoya R, Endo K, et al. Enhanced
recombinant protein productivity by genome reduction in
Bacillus subtilis. DNA Res, 2008, 15(2): 73-81
[39] Tsuge Y, Suzuki N, Inui M, et al. Random segment
deletion based on IS31831 and Cre/loxP excision system
in Corynebacterium glutamicum. Appl Microbiol Bio-
technol, 2007, 74(6): 1333-41
[40] Suzuki N, Tsuge Y, Inui M, et al. Cre/loxP-mediated
deletion system for large genome rearrangements in
Corinebacterium glutamicum. Appl Microbiol Biotechnol,
2005, 67(2): 225-33
[41] Komatsu M, Uchiyama T, Omura S, et al. Genome-
minimized Streptomyces host for the heterologous
expression of secondary metabolism. Proc Natl Acad Sci
USA, 2010, 107: 2646-51
[42] Murakami K, Tao E, Ito Y, et al. Large scale deletions in
the Saccharomyces cerevisiae genome create strains with
altered regulation of carbon metabolism. Appl Microbiol
Biotechnol, 2007, 75(3): 589-97
[43] Kim DU, Hayles J, Kim D, et al. Analysis of a genome-
wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosacc-
haromyces pombe. Nat Biotechnol, 2010, 28(6): 617-25
[44] Hirashima K, Iwaki T, Takegawa K, et al. A simple and
effective chromosome modification method for large-scale
deletion of genome sequences and identification of
essential genes in fission yeast. Nucleic Acid Res, 2006,
34(2):11
[45] Giga-Hama Y, Tohda H, Takegawa K, et al. Schizosacc-
haromyces pombe minimum genome factory. Biotechnol
Appl Biochem, 2007, 46(3):147-55
[46] Joyce AR, Reed JL, White A, et al. Experimental and
computational assessment of conditionally essential genes
in Escherichia coli. J Bacteriol, 2006, 188(23): 8259-71
[47] Fehér T, Papp B, Pal C, et al. Systematic genome reductions:
theoretical and experimental approaches. Chem Rev, 2007,
107(8): 3498-513
[48] Koonin EV. Comparative genomics, minimal gene-sets
and the last universal common ancestor. Nat Rev
Microbiol, 2003,1(2): 127-36
[49] Morimoto T, Ara K, Ozaki K, et al. A new simple method
to introduce marker-free deletions in the Bacillus subtilis
genome. Genes Genet Syst, 2009, 84(4): 315-8
[50] Zakataeva NP, Nikitina OV, Gronskiy SV, et al. A simple
method to introduce marker-free genetic modifications
into the chromosome of naturally nontransformable
Bacillus amyloliquefaciens strains. Appl Microbiol
Biotechnol, 2010, 85(4):1201-9
[51] Gao H, Zhuo Y, Ashforth E, et al. Engineering of a
genome-reduced host: practical application of synthetic
biology in the overproduction of desired secondary
metabolites. Protein Cell, 2010, 1(7): 621-6