全 文 ：第 １３卷第 ３期
２０１５年 ５月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ３
Ｍａｙ ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０３􀆰 ００８
收稿日期：２０１４－０２－１６
基金项目：国家自然科学基金（３１０７０７１１）
作者简介：张　 君（１９８９—），女，湖南益阳人，硕士研究生，研究方向：酶工程；周哲敏（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｚｈｍｚｈｏｕ＠ ｊｉａｎｇｎａｎ．ｅｄｕ􀆰 ｃｎ
恶臭假单胞菌腈水合酶 βＡｌａ９７影响催化
己二腈的区域选择性
张　 君，崔文璟，刘　 义，崔幼恬，周哲敏
（江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 ２１４１２２）
摘　 要：对恶臭假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）腈水合酶（ＰｐＮＨａｓｅ）催化己二腈进行研究，发现 ＰｐＮＨａｓｅ 只能催化
己二腈中 １个氰基生成单酰胺产物 ５ 氰基戊酰胺，具有区域选择性；睾丸酮丛毛单胞菌（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）腈
水合酶（ＣｔＮＨａｓｅ）能催化己二腈直接生成己二酰二胺，不具有催化区域选择性。 为了阐明这一区域选择性差异的
机制，对 ＣｔＮＨａｓｅ和 ＰｐＮＨａｓｅ β亚基的氨基酸序列进行比对，结果显示同源性为 ９４􀆰 １％，ＣｔＮＨａｓｅ 存在 βＡｌａ９７ 缺
失。 基于此分析，构建了 ＰｐＮＨａｓｅ β９７位 Ａｌａ的缺失突变体（ΔＡｌａ９７）。 利用高效液相色谱检测 ΔＡｌａ９７催化己二腈
的产物，发现 ΔＡｌａ９７能将底物完全催化为己二酰二胺，表明 βＡｌａ９７是影响催化己二腈由 ５ 氰基戊酰胺向己二酰
二胺转化的关键氨基酸。
关键词：腈水合酶；己二腈；生物催化；区域选择性
中图分类号：Ｑ８１４；Ｑ７８　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０３－００４１－０６
βＡｌａ９７ ｏｆ ｎｉｔｒｉｌｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ａｆｆｅｃｔｓ
ｒｅｇｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏｗａｒｄｓ ａｄｉｐｏｎｉｔｒｉｌｅ
ＺＨＡＮＧ Ｊｕｎ，ＣＵＩ Ｗｅｎｊｉｎｇ，ＬＩＵ Ｙｉ，ＣＵＩ Ｙｏｕｔｉａｎ，ＺＨＯＵ Ｚｈｅｍｉｎ
（Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｎｉｔｒｉｌｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅ （ＮＨａｓｅ） ｆｒｏｍ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ （ＰｐＮＨａｓｅ） ｔｏ ｃａｔａｌｙｚｅｓ ａｄｉｐｏｎｉｔｒｉｌｅ （ａ
ｋｉｎｄ ｏｆ ｄｉｎｉｔｒｉｌｅｓ） ｏｎｌｙ ｔｏ ５⁃ｃｙａｎｏｐｅｎｔａｎａｍｉｄｅ （ｍｏｎｏａｍｉｄｅ），ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｏｎｌｙ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙａｎｏ ｇｒｏｕｐ
ｗａｓ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｔｏ ａｍｉｄｅ ｗｈｅｒｅａｓ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒｓ ｎｏｔ􀆰 Ｔｈｉｓ ｆｉｎｄｉｎｇ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ ｔｈａｔ ＰｐＮＨａｓｅ ｅｘｈｉｂｉｔｓ ｃａｔａｌｙｚｉｎｇ
ｒｅｇｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ􀆰 Ｏｎ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｈａｎｄ，ＮＨａｓｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ （ＣｔＮＨａｓｅ） ｃａｔａｌｙｚｅｓ
ａｄｉｐｏｎｉｔｒｉｌｅ ｄｉｒｅｃｔｅｌｙ ｔｏ ａｄｉｐａｍｉｄｅ （ｄｉａｍｉｄｅ），ｗｉｔｈｏｕｔ ｃａｔａｌｙｚｉｎｇ ｒｅｇｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏｗａｒｄｓ ａｄｉｐｏｎｉｔｒｉｌｅ􀆰 Ｉｎ
ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｒｅｇｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＰｐＮＨａｓｅ ｔｏｗａｒｄｓ ａｄｉｐｏｎｉｔｒｉｌｅ，ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ β ｓｕｂｕｎｉｔ ｂｅｔｗｅｅｎ ＰｐＮＨａｓｅ ａｎｄ ＣｔＮＨａｓｅ ｗａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ􀆰 Ｔｈｏｕｇｈ ｔｈｅｙ ｓｈｏｗｓ ｈｉｇｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ
（ ９４􀆰 １％）， ｔｈｅ β ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ＰｐＮＨａｓｅ ｈａｓ ａｎ ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ９７ ａｌａｎｉｎｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ
ＣｔＮＨａｓｅ􀆰 Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ， ａ ｍｕｔａｎｔ ＰｐＮＨａｓｅ ｗｉｔｈ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌａ９７ （ ΔＡｌａ９７ ） ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ􀆰 Ｈｉｇｈ⁃
ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ （ ＨＰＬＣ ） ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔ ΔＡｌａ９７ ｃｏｎｖｅｒｔｅｄ
ａｄｉｐｏｎｉｔｒｉｌｅ ｔｏ ａｄｉｐａｍｉｄｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ Ａｌａ９７ ｌｏｃａｔｉｎｇ ａｔ ｔｈｅ β⁃ｓｕｂｕｎｉｔ ｉｓ ｔｈｅ ｐｉｖｏｔａｌ ａｍｉｎｏ⁃
ａｃｉｄ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ５⁃ｃｙａｎｏｐｅｎｔａｎａｍｉｄｅ ｔｏ ａｄｉｐａｍｉｄｅ􀆰 Ｔｈｏｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｉｌｌ ｂｅ ｈｅｌｐｆｕｌ ｔｏ ｅｌｕｃｉｄａｔｅ
ｔｈｅ ｒｅｇｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ􀆰
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｎｉｔｒｉｌｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅ；ａｄｉｐｏｎｉｔｒｉｌｅ：ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ；ｒｅｇｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ
　 　 腈 水 合 酶 （ ＥＣ ４􀆰 ２􀆰 １􀆰 ８４， ｎｉｔｒｉｌｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅ，
ＮＨａｓｅ），是一种用来催化腈类物质生成酰胺类物质
的金属酶［１］，在自然界中分布广泛，大多产腈水合酶
的微生物为革兰氏阳性菌属，如诺卡氏菌属
（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、红球菌属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、假棒状杆菌属
（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、假诺卡氏菌属（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）、
短杆菌属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、产碱杆菌属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、
假单 胞 菌 属 （ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ） 和 丛 毛 单 胞 菌 属
（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）等。 腈水合酶根据活性中心所需辅因
子的不同，一般可以分为钴型腈水合酶［２］ （Ｃｏ
ＮＨａｓｅ）和铁型腈水合酶［３］（Ｆｅ ＮＨａｓｅ）。 恶臭假单
胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）来源的 ＮＨａｓｅ 为钴型腈水
合酶，成熟酶由 ２个 α亚基和 ２个 β 亚基构成［４］，一
般以 α２β２四聚体形式存在，α亚基和 β亚基的相对分
子质量分别为 ２􀆰 ３×１０４和 ２􀆰 ４１×１０４ ［５］，其活性中心
Ｃｏ２＋的摄取依赖编码 β、α 亚基基因（ｂａ）下游 ｐ 基因
的翻译产物 Ｐ 亚基，通过自身交换机制来完成［２］。
腈水合酶在工业上主要用来生产烟酰胺［６］及丙烯酰
胺［７］，与化学催化相比，利用腈水合酶进行生物转化
有高选择性、无副产物、反应条件温和、反应速度快及
环境污染较小等诸多优势［８－１２］。
腈水合酶根据催化底物类型的不同，还可以分
为芳香型腈水合酶（包括杂环型）和脂肪型腈水合
酶两类［４］。 现有研究仅发现腈水合酶能催化己二
腈以及多聚物如聚丙烯腈［１３－１６］，而对其催化过程和
机制尚不明确。 Ｍｏｒｅａｕ 等［１７］研究发现腈水合酶催
化己二腈可生成中间产物 ５ 氰基戊酰胺和终产物
己二酰二胺，具有催化的区域选择性。 与此不同，
Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ腈水合酶能将底物己二腈全
部转化为己二酰二胺，不生成中间产物 ５ 氰基戊酰
胺。 ５ 氰基戊酰胺是一种农药中间体，可以用来生
产三唑啉酮类除草剂［１８］，也可以作生产己内酰胺和
碱性红 ２９的前体。 终产物己二酰二胺，是重要的精
细化工原料、医药中间体，价格较昂贵。 因此，阐明腈
水合酶催化己二腈的区域选择性机制对利用酶法制
备 ５ 氰基戊酰胺和己二酰二胺具有重要意义。
本研究中，笔者在 Ｐ􀆰 ｐｕｔｉｄａ 来源的 ＮＨａｓｅ 催化
己二腈具有区域选择性的基础上，通过序列比对、
缺失突变鉴定影响 Ｐ􀆰 ｐｕｔｉｄａ 腈水合酶催化己二腈
区域选择性的热点氨基酸。 此研究结果将对进一
步阐明腈水合酶对己二腈的区域选择性机制、提高
底物转化率及利用腈水合酶催化制备己二酰二胺
具有重要的指导意义。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
１􀆰 １􀆰 １　 菌种、质粒和培养基
含有 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ􀆰 ｐｕｔｉｄａ ＮＲＲＬ １８６６８ 来源的
ＮＨａｓｅ（ＰｐＮＨａｓｅ）的重组质粒 ｐＥＴ２４ａ ｂａｐ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ＪＭ１０９和 ＢＬ２１ （ＤＥ３）保藏于笔者所在实验室。
２ＹＴ固体培养基（ｇ ／ Ｌ）：胰蛋白胨 １６，酵母提取
物 １０，ＮａＣｌ ５，琼脂粉 ２０；ｐＨ ７􀆰 ０。
１􀆰 １􀆰 ２　 试剂与仪器
Ｐｒｉｍｅｒ ＳＴＡＲＴＭ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、 Ｄｐｎ Ⅰ，
ＴａＫａＲａ公司；己二腈、己二酰二胺，Ｓｉｇｍａ 公司；５
氰基戊酰胺，天津科技大学王敏教授惠赠。 引物合
成委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。
质粒 ＤＮＡ小提试剂盒、ＤＮＡ 纯化回收试剂盒，天根
生化科技（北京）有限公司。
高效液相色谱仪，Ｈｉｔａｃｈｉ 公司；ÄＫＴＡ Ａｖａｎｔ 蛋白
纯化仪，ＧＥ 公司；Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ ＰＣＲ 仪、凝胶成像仪，Ｂｉｏ⁃
Ｒａｄ公司；ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ １ ｍＬ 阴离子层析柱、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ
２００ １０／ ３００ ＧＬ凝胶层析柱、ＧＥ Ｈｅａｔｈｃａｒｅ、高效液相色
谱柱 Ｄｉａｍｏｎｓｉｌ （５ μｍ，２５０ ｍｍ×４􀆰 ６ ｍｍ） Ｃ１８，北京迪
马科技有限公司。
１􀆰 ２　 方法
１􀆰 ２􀆰 １　 ＮＨａｓｅ的表达和纯化
将编码 Ｐ􀆰 ｐｕｔｉｄａ腈水合酶（ＰｐＮＨａｓｅ）及 Ｐ 亚基
基因的重组质粒 ｐＥＴ２４ａ ｂａｐ 转化至大肠杆菌
ＢＬ２１（ＤＥ３），３７ ℃过夜培养。 挑取单菌落，接种至
含有 ５０ μｇ ／ ｍＬ（终质量浓度）卡那霉素的 １０ ｍＬ
２ＹＴ培养基中，２００ ｒ ／ ｍｉｎ、３７ ℃过夜培养。 再将活
化的重组菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）按 １ ∶ １００ 的体积比接种到
１００ ｍＬ 新鲜的 ２ＹＴ 培养基中，按上述条件培养至
６００ ｎｍ吸光度值（ＯＤ６００） ０􀆰 ６ ～ ０􀆰 ８，加入终浓度为
０􀆰 ６ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 的异丙基 β Ｄ 硫代半乳糖苷
（ＩＰＴＧ）以及终质量浓度为 ０􀆰 １ ｍｇ ／ Ｌ 的 Ｃｏ２＋，２００
ｒ ／ ｍｉｎ、２８ ℃下诱导 １６ ｈ。
１）酶分离、纯化过程　 收集菌体，用 ２０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
Ｔｒｉｓ ＨＣｌ缓冲液洗清洗 ３ 次，超声破碎后收集上清
２４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
液，进行（ＮＨ４） ２ ＳＯ４分级沉淀，范围为 ４０％ ～ ７５％，
将最终得到的蛋白液在 ４ ℃透析 １２ ｈ。
２）离子交换层析　 使用 Ｈｉｔｒａｐ Ｑ ＨＰ 阴离子柱于
ÄＫＴＡ Ａｖａｎｔ 层析系统中进行分离。 Ａ 液（２０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
Ｔｒｉｓ ＨＣｌ，ｐＨ ７􀆰 ４，０􀆰 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 二硫苏糖醇（ＤＴＴ））平
衡柱子；Ｂ 液（０􀆰 ５ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＣｌ，ｐＨ ７􀆰 ４，０􀆰 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
ＤＴＴ）洗脱，ＳＤＳ ＰＡＧＥ 检测纯化结果，收集有活性的
部分。 经超滤浓缩后，用少量 ｐＨ为 ７􀆰 ４的 Ｔｒｉｓ ＨＣｌ
缓冲液溶解。
３）凝胶过滤层析 　 将浓缩后的酶蛋白液注入
预先用缓冲液（２０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ ７􀆰 ４）平衡
的 Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０ ／ ３００ＧＬ 层析柱中，用分离缓冲液
（２０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ， ｐＨ ７􀆰 ４，含 ０􀆰 １５ ｍｏｌ ／ Ｌ
ＮａＣｌ）进行洗脱，并收集目的蛋白，即为纯化得到的
纯酶，ＳＤＳ ＰＡＧＥ检测纯化结果。 纯化的蛋白置于
－２０ ℃保存，用于测定酶的区域选择性。
１􀆰 ２􀆰 ２　 催化产物的检测
反应体系：将 ２０ μＬ ３００ μｇ ／ ｍＬ 纯酶加入到 ４３０
μＬ ２０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ缓冲液中，再加入 ５０ μＬ ２００
ｍｍｏｌ ／ Ｌ底物己二腈，３０ ℃反应 １０ ｍｉｎ，加入 ５００ μＬ
甲醇终止反应。 产物测量参考 Ｍｏｒｅａｕ 等［１７］报道的
测量方法，并稍作改进。 使用 Ｄｉａｍｏｎｓｉｌ ５ μｍ×２５０
ｍｍ×４􀆰 ６ ｍｍ Ｃ１８色谱柱分离 ５ 氰基戊酰胺和己二
酰二胺。 流动相采用 ２５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｈ３ＰＯ４和色谱纯甲
醇（体积比 ８９􀆰 ０１ ∶ １０􀆰 ０９，ｐＨ ２􀆰 ５），柱温为 ３０ ℃，流速
１􀆰 ０ ｍＬ ／ ｍｉｎ，紫外检测波长为 ２００ ｎｍ。
１􀆰 ２􀆰 ３　 突变株的构建
以 ｐＥＴ２４ａ ｂａｐ 为模板，将 β 链 ９７ 位 Ａｌａ 进行
缺失，构建出缺失突变体ΔＡｌａ９７，用 ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ􀳏 ＨＳ
ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ试剂盒进行全质粒扩增（ＰＣＲ），扩增
引物见表 １。 ＰＣＲ条件：９５ ℃ ５ ｍｉｎ，９８ ℃ ２０ ｓ，５７ ℃
３０ ｓ，６８ ℃ ６􀆰 ５ ｍｉｎ，１８个循环；６８ ℃ ５ ｍｉｎ终止程序。
扩增产物经 １％琼脂糖凝胶电泳验证，再用 ＤＮＡ纯化
试剂盒切胶回收 ７ ｋｂ 左右的ｐＥＴ２４ａ ｂａｐ 及突变后
的重组质粒，经过 ＤｐｎⅠ酶３７ ℃将模板消化 １ ｈ 后，转
化 ＪＭ１０９，挑取单菌落过夜培养后提取质粒，验证后
转化大肠杆菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）进行表达。
表 １　 本研究中所用引物
Ｔａｂｌｅ １　 Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
引物 序列（５′－３′） 大小 ／ ｂｐ
ΔＡｌａ９７ ｕｐ ＧＣＧＡＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧ ２０
ΔＡｌａ９７ ｄｏｗｎ ＣＧＣＣＧＴＣＴＴＧＣＣＡＧＡＡＧＣＣＴＴＧＣ ２３
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 腈水合酶表达、纯化
收集过夜诱导的重组菌 ＢＬ２１（ＤＥ３） ／ ｐＥＴ２４ａ
ｂａｐ，经过破碎，离心、（ＮＨ４） ２ ＳＯ４沉淀、离子层析凝
胶过滤等进行分离得到较纯的腈水合酶，结果如图
１所示。 由图 １可见：在 ２􀆰 ４×１０４处有较纯的目的蛋
白条带（α亚基相对分子质量 ２􀆰 ３４×１０４，β 亚基相对
分子质量 ２􀆰 ４×１０４），表明经过此分离纯化方法得到
了较纯的 ＮＨａｓｅ，通过测定纯化前后酶的比活力，得
出纯化倍数为 １１􀆰 ６倍。
Ｍ—标准蛋白；１—细胞破碎上清液；２—经过（ＮＨ４） ２ＳＯ４
沉淀后的蛋白；３—经过离子柱及凝胶过滤层析后的纯酶
图 １　 ＮＨａｓｅ纯化过程的 ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析
Ｆｉｇ􀆰 １　 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＮＨａｓｅ
２􀆰 ２　 野生型 ＮＨａｓｅ催化底物区域选择性的检测
首先利用高效液相色谱（ＨＰＬＣ）分别检测 １０
ｍｍｏｌ ／ Ｌ的己二酰二胺和 ５ 氰基戊酰标准样品，然
后检测用纯化的恶臭假单胞菌 ＮＨａｓｅ（ＰｐＮＨａｓｅ）催
化己二腈生成的产物，结果如图 ２所示。 由图 ２（ａ）
和图 ２（ｂ）可知：己二酰二胺标准样品保留时间为
３􀆰 ３２ ｍｉｎ，５ 氰基戊酰胺标准样品保留时间为 ５􀆰 ２７
ｍｉｎ。 由图 ２（ｃ）可知：反应时间分别为 １０ 和 ３０ ｍｉｎ
时，产物为 ５ 氰基戊酰胺，没有己二酰二胺生成；反
应时间为 ８０ ｍｉｎ 时，产物中没有明显的己二酰二胺
生成，绝大部分为中间产物 ５ 氰基戊酰胺；继续延
长反应时间，不能增加己二酰二胺的生成量。 本结
果说明 ＰｐＮＨａｓｅ对己二腈具有催化的区域选择性，
仅能催化己二腈生成 ５ 氰基戊酰，不能继续催化
５ 氰基戊酰生成二酰二胺。
２􀆰 ３　 基因序列比对结果
Ｃ􀆰 ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ５ ＭＧＡＭ ４Ｄ来源的 ＮＨａｓｅ能催
化己二腈生成己二酰二胺，具有区域选择性［１９］。 而
３４　 第 ３期 张　 君等：恶臭假单胞菌腈水合酶 βＡｌａ９７影响催化己二腈的区域选择性
ＮＨａｓｅ的 β亚基与底物的选择、结合有密切的关系。
将 Ｃ􀆰 ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ 来源的 ＮＨａｓｅ（ＣｔＮＨａｓｅ，ＧｅｎＢａｎｋ：
ＡＹ７４３６６６）和 ＰｐＮＨａｓｅ（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ８９３６３􀆰 １）蛋白
质一级序列进行 ＢＬＡＳＴ比对，结果如图 ３ 所示。 由
图 ３ 可知：ＣｔＮＨａｓｅ 与 ＰｐＮＨａｓｅ 氨基酸序列的相似
度为 ９４􀆰 １％。 一个明显的区别是，相对于 ＰｐＮＨａｓｅ，
ＣｔＮＨａｓｅ缺失了 βＡｌａ９７，有缺失突变。 βＡｌａ９７ 可能
与己二腈催化的区域选择性有关。
图 ２　 样品的 ＨＰＬＣ图谱
Ｆｉｇ􀆰 ２　 ＨＰＬＣ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ｓａｍｐｌｅｓ
注：矩形边框部分即为 β９７的氨基酸
图 ３　 恶臭假单胞菌和睾丸酮丛毛单胞菌来源的腈水合酶 β 链氨基酸序列比对
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ β ｃｈａｉｎ ｏｆ ＮＨａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐ􀆰 ｐｕｔｉｄａ ａｎｄ Ｃ􀆰 ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ
２􀆰 ４　 缺失突变体的构建及表达
基于以上分析，笔者构建了 βＡｌａ９７ 缺失的
ＰｐＮＨａｓｅ和 ΔＡｌａ９７。 以含有 ＰｐＮＨａｓｅ（基因结构为
ｂａｐ）的重组质粒 ｐＥＴ２４ａ ｂａｐ作为模板，按“１􀆰 ２􀆰 ３”
方法进行全质粒 ＰＣＲ，构建突变体，基因测序表明
成功构建了突变体。
将重组质粒 ｐＥＴ２４ａ ｂａｐ ／ ΔＡｌａ９７ 转化 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ
ＢＬ２１ （ＤＥ３），挑取单菌落，诱导表达 ΔＡｌａ９７。 按
“１􀆰 ２􀆰 １”方法纯化，获取突变体纯酶 ΔＡｌａ９７。 ＳＤＳ
ＰＡＧＥ分析纯化结果如图 ４ 所示。 由图 ４ 可见：
ＰｐＮＨａｓｅ的 β亚基缺失 ９７位 Ａｌａ后，其 ＮＨａｓｅ的 α、
β亚基相对分子质量都为 ２􀆰 ３×１０４左右，可以看到
ＮＨａｓｅ实现了表达，并且得到了较纯的蛋白。
２􀆰 ５　 ＰｐＮＨａｓｅ中 Ａｌａ９７缺失突变体区域选择性变化
利用 ＨＰＬＣ 检测突变体 ΔＡｌａ９７ 催化己二腈区
域选择性的变化，结果如图 ５所示。 由图 ５可知：突
变体 ΔＡｌａ９７ 纯酶与己二腈分别反应 １０、６０ 和 ８０
ｍｉｎ时，催化产物中均有明显的己二酰二胺生成，并
且己二酰二胺的生成量随反应时间延长而增加。
反应 ８０ ｍｉｎ 时，底物己二腈完全被催化为己二酰二
胺，无 ５ 氰基戊酰胺保留，说明 βＡｌａ９７ 缺失显著改
变了 ＰｐＮＨａｓｅ催化己二腈的区域选择性，βＡｌａ９７ 是
４４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
影响 ＮＨａｓｅ催化己二腈区域选择性的热点氨基酸。
Ｍ—标准蛋白；１—ΔＡｌａ９７的纯化后蛋白
图 ４　 突变体的纯化蛋白 ＳＤＳ ＰＡＧＥ
Ｆｉｇ􀆰 ４　 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｍｕｔａｎｔ ＮＨａｓｅ
图 ５　 突变体的 ＮＨａｓｅ催化己二腈不同时间下
产物的 ＨＰＬＣ图谱
Ｆｉｇ􀆰 ５　 ＨＰＬＣ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ
ＰｐＮＨａｓｅ ｃａｔａｌｙｚｉｎｇ ａｄｉｐｏｎｉｔｒｉｌｅ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ
腈水合酶的区域选择性与酶分子自身和底物
均有关。 李建军等［２０］分析了 Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ􀆰 ＡＪ２７０
腈水合酶催化二腈的反应，发现该催化的区域选择
性会受底物结构的影响。 首先，底物二腈分子的柔
顺性和 ２个氰基的空间伸展方向，能决定该底物分
子能否被酶所水解，当分子结构具有刚性的顺式共
平面时，对酶催化有抑制作用。 其次，底物分子中 ２
个氰基的距离和构型影响酶催化的区域选择性，刚
性的顺式共平面不利于选择性地水解二腈分子中
的单个氰基。 本研究中选用的己二腈，在空间结构
上不是上述刚性平面结构，而是具有较好的柔顺
性，适宜用来作为研究不同来源的腈水合酶对二腈
催化的区域选择性的底物。 目前有报道的 ＮＨａｓｅ催
化己二腈区域选择性的 ３种菌株，分别是 Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ
ｒｕｂｅｒ ＣＧＭＣＣ３０９０［２１］、 Ｐ􀆰 ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ Ｂ２３［６］ 和
Ｃ􀆰 ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ ５ ＭＧＡＭ ４Ｄ［１９］，其中前 ２ 种菌株的
ＮＨａｓｅ能够区域选择地催化己二腈，主要生成 ５ 氰
基戊酰胺。 与本研究所用的 Ｐ􀆰 ｐｕｔｉｄａ ＮＲＲＬ １８６６８
ＮＨａｓｅ催化性质相似，而 Ｃ􀆰 ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ ＮＨａｓｅ 与己
二腈反应生成的终产物全部为己二酰二胺。 通过
比对 ４个不同区域选择性的腈合酶氨基酸序列，α
链的相似性为 ３１􀆰 ３％，β 链的相似性为 ５８􀆰 ４３％，其
中 Ｐ􀆰 ｐｕｔｉｄａ ＮＲＲＬ １８６６８ ＮＨａｓｅ 与 Ｃ􀆰 ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ
ＮＨａｓｅ 相似度极高，却有着不同的区域选择性。
Ｐ􀆰 ｐｕｔｉｄａ ＮＲＲＬ １８６６８ ＮＨａｓｅ β 链的 ９７ 位丙氨酸
残基位于 β链上的不规则区域，在具有相同区域选
择性菌株中没有一定的规律。
３　 结论
通过缺失 β链的 ９７位丙氨酸，改变了腈水合酶
催化己二腈的区域选择性，原始酶仅能将己二腈转
化为 ５ 氰基戊酰胺，而变异体可以将己二腈转化为
己二酰二胺。 变异体在反应过程中有 ５ 氰基戊酰
胺积累，随着时间的推移，５ 氰基戊酰胺逐步减少，
说明此过程是分两步进行的，己二腈分子的 １ 个氰
基首先被催化，之后另外 １ 个氰基被催化。 推测此
氨基酸残基的缺失可以使中间产物 ５ 氰基戊酰胺
易于结合活性中心，最终促进其转化为己二酰二胺。
综上，笔者利用基因序列比对，采用定点突变
的方法，发现了决定腈水合酶催化己二腈反应生成
己二酰二胺为终产物的区域选择性的关键氨基酸
位点，为 β 链上 ９７ 位的 Ａｌａ。 本研究初步阐明了
Ｐ􀆰 ｐｕｔｉｄａ来源的腈水合酶对己二腈的区域选择性机
制，提高了底物转化率，对利用腈水合酶催化制备
己二酰二胺具有重要的指导意义。
参考文献：
［ １ ］ 　 Ｍａｈａｄｅｖａｎ Ｓ，Ｔｈｉｍａｎｎ Ｋ Ｖ．Ｎｉｔｒｉｌａｓｅ：ＩＩ．ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ
ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｍｏｄｅ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ［ Ｊ］ ． Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ，１９６４，１０７：
６２⁃６８．
［ ２ ］ 　 Ｚｈｏｕ Ｚ， Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ Ｙ， Ｓｈｉｒａｋｉ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ
ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｅｌｆ⁃ｓｕｂｕｎｉｔ ｓｗａｐｐｉｎｇ ［ Ｊ］ ． Ｐｒｏｃ
Ｎａｔ Ａｃａ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００８，１０５（３９）：１４８４９⁃１４８５４．
［ ３ ］ 　 Ｍａｓｃｈａｒａｋ Ｐ Ｋ．Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ｏｆ ｎｉｔｒｉｌｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅ：ａｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ
ｕｎｕｓｕａｌ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｂｙ ｎａｔｕｒｅ ［ Ｊ］ ． Ｍｏｌ Ｄｅｓｉｇｎ Ｉｎｏｒｇ
Ｂｉｏｃｈｅｍ，２０１３，８５：８９⁃１１３．
５４　 第 ３期 张　 君等：恶臭假单胞菌腈水合酶 βＡｌａ９７影响催化己二腈的区域选择性
［ ４ ］　 Ｌｉｕ Ｙ， Ｃｕｉ Ｗ， Ｘｉａ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ｓｅｌｆ⁃ｓｕｂｕｎｉｔ ｓｗａｐｐｉｎｇ ｏｃｃｕｒｓ ｉｎ
ａｎｏｔｈｅｒ ｇｅｎｅ ｔｙｐｅ ｏｆ ｃｏｂａｌｔ ｎｉｔｒｉｌｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅ［Ｊ］ ．ＰｌｏＳ Ｏｎｅ，２０１２，
７（１１）：ｅ５０８２９．
［ ５ ］ 　 Ｂｒｏｄｋｉｎ Ｈ Ｒ，Ｎｏｖａｋ Ｗ Ｒ Ｐ，Ｍｉｌｎｅ Ａ Ｃ，ｅｔ ａｌ． Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ
ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｍｏｔｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｏ⁃ｔｙｐｅ
ｎｉｔｒｉｌｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ［ Ｊ ］ ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
２０１１，５０（２２）：４９２３⁃４９３５．
［ ６ ］ 　 Ｎｉｓｈｉｙａｍａ Ｍ， Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ Ｓ， Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｎｉｔｒｉｌｅ
ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｒｏｍ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ Ｂ２３［ Ｊ］ ． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，
１９９１，１７３（８）：２４６５⁃２４７２．
［ ７ ］ 　 Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｓ，Ｋｕｈｎ Ｍ Ｌ，Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｊ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｕｓｉｎｇ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｎｉｔｒｉｌｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ｉｎ ａ ｓｏｌ⁃ｇｅｌ ｍａｔｒｉｘ ［ Ｊ］ ． Ｊ Ｍｏｌ Ｃａｔａｌ Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，
２０１４，１００：１９⁃２４．
［ ８ ］ 　 Ｂａｎｅｒｊｅｅ Ａ， Ｓｈａｒｍａ Ｒ， Ｂａｎｅｒｊｅｅ Ｕ Ｃ． Ｔｈｅ ｎｉｔｒｉｌｅ⁃ｄｅｇｒａｄｉｎｇ
ｅｎｚｙｍｅｓ：ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ［ Ｊ］ ． Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００２，６０（１ ／ ２）：３３⁃４４．
［ ９ ］ 　 Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｍ，Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｓ．Ｎｉｔｒｉｌｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ［ Ｊ］ ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ
Ｂｉｏｌ，２０００，４（１）：９５⁃１０２．
［１０］ 　 Ｍａｒｔｉｎｋｏｖａ Ｌ， Ｍｙｌｅｒｏｖａ Ｖ． Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｉｔｒｉｌｅ⁃
ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ［Ｊ］ ．Ｃｕｒｒ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ，２００３，７：１２７９⁃１２９５．
［１１］ 　 Ｓｉｎｇｈ Ｒ，Ｓｈａｒｍａ Ｒ，Ｔｅｗａｒｉ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｎｉｔｒｉｌａｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｓ
ａ ＂ ｇｒｅｅｎ＂ ｃａｔａｌｙｓｔ［Ｊ］ ．Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓ，２００６，３：１２７９⁃１２８７．
［１２］ 　 Ｗａｎｇ Ｍ Ｘ． Ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｉｔｒｉｌｅｓ ｉｎ
ｏｒｇａｎｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ［Ｊ］ ．Ｔｏｐ Ｃａｔａｌ，２００５，３５（１ ／ ２）：１１７⁃１３０．
［１３］ 　 Ｂａｂｕ Ｖ，Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ Ｂ．Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｉｔｒｉｌｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅ
ａｎｄ ａｍｉｄａｓｅ ｏｎ ｐｏｌｙａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｓｕｒｆａｃｅ
ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］ ．Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｓｕｒｆ Ｂ，２０１２，８９：２７７⁃２８２．
［１４］ 　 Ｂａｔｔｉｓｔｅｌ Ｅ，Ｍｏｒｒａ Ｍ，Ｍａｒｉｎｅｔｔｉ Ｍ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ ｆｉｂｅｒｓ［Ｊ］ ．Ａｐｐｌ Ｓｕｒｆ Ｓｃｉ，２００１，１７７（１ ／ ２）：３２⁃４１．
［１５］ 　 Ｆｉｓｃｈｅｒ⁃Ｃｏｌｂｒｉｅ Ｇ， Ｍａｔａｍａ Ｔ， Ｈｅｕｍａｎｎ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｓｕｒｆａｃｅ
ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｏｌｙａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ ｗｉｔｈ ｎｉｔｒｉｌｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ
ｆｒｏｍ Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ ＢＳＴ２０［Ｊ］ ． Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００７，１２９（１）：
６２⁃６８．
［１６］ 　 Ｔａｕｂｅｒ Ｍ Ｍ，Ｃａｖａｃｏ⁃Ｐａｕｌｏ Ａ，Ｒｏｂｒａ Ｋ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｎｉｔｒｉｌｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅ
ａｎｄ ａｍｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ｈｙｄｒｏｌｙｚｅ ａｃｒｙｌｉｃ
ｆｉｂｅｒｓ ａｎｄ ｇｒａｎｕｌａｒ ｐｏｌｙａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅｓ［ Ｊ］ ． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂ，
２０００，６６（４）：１６３４⁃１６３８．
［１７］ 　 Ｍｏｒｅａｕ Ｊ Ｌ， Ａｚｚａ Ｓ， Ｂｉｇｅｙ Ｆ， ｅｔ ａｌ． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ⁃
ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ⁃ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｔｏ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｉｐｏｎｉｔｒｉｌｅ［ Ｊ］ ． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｐｐｌ，
１９９４，６５６（１）：１９７⁃２０２．
［１８］ 　 Ｓｈａｐｉｒｏ Ｒ， Ｄｉｃｏｓｉｍｏ Ｒ， Ｈｅｎｎｅｓｓｅｙ Ｓ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ
ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａｚａｆｅｎｉｄｉｎ ［ Ｊ］ ． Ｏｒｇ
Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓ Ｄｅｖ，２００１，５（６）：５９３⁃５９８．
［１９］ 　 Ｐｅｔｒｉｌｌｏ Ｋ Ｌ， Ｗｕ Ｓ Ｊ， Ｈａｎｎ Ｅ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｏｖｅｒ⁃ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｏｆ ａ ｔｈｅｒｍａｌｌｙ ｓｔａｂｌｅ ａｎｄ ｒｅｇｉｏ⁃ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｎｉｔｒｉｌｅ
ｈｙｄｒａｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ ５⁃ＭＧＡＭ⁃４Ｄ ［ Ｊ］ ． Ａｐｐｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ，２００５，６７（５）：６６４⁃６７０．
［２０］ 　 李建军，李纪生，王梅祥．二腈的区域和对映选择性生物水解
反应：腈水合酶与二腈分子作用模式初探［ Ｊ］ ．化学学报，
２００１，５９（１０）：１８２７⁃１８３０．
［２１］ 　 Ｗａｎｇ Ｓ，Ｄａｉ Ｙ，Ｗａｎｇ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ
ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ ＣＧＭＣＣ３０９０ ｂｙ ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ
ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ［ Ｊ］ ． Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ Ｔｅｃｈ， ２０１３， ５２ （ ２ ）：
１１１⁃１１７．
（责任编辑　 管　 珺）
６４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷