全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&% 年 月
生"物"加"工"过"程
*4;?BDBW>HF?=G>EY;>9F>CBDDX?J;?BBF;?J
d>G7! />7#
a=O$%&%
@>;&&%7#.).0V7;DD?7&)-$ 8#)-!7$%&%7%#7%&
收稿日期&$%&% 8%& 8%)
基金项目&国家重点基础研究发展计划$.-# 计划%资助项目$$%%.*Y-$,-%,%)浙江省自然科学基金资助项目$Q,%!%##,%
作者简介&郑裕国$&.)&#%"男"浙江象山人"教授"研究方向&生物催化与生物转化"XN<=;G&34B?JOJe3VH:7B@H7C?
一类生物催化剂###氰基耐受型腈水合酶
郑裕国"金晓峰"郑仁朝"林志坚"沈寅初
$浙江工业大学 生物工程研究所"杭州 #&%%&,%
摘"要&氰基耐受型腈水合酶是一类生物催化剂 与普通腈水合酶相比"它能够耐受体系中较高浓度的氰基而
不受抑制"从而为

羟$氨%基酰胺的工业化合成开辟了崭新途径 研究腈水合酶的氰基耐受性机理及提高其
耐受能力是目前需要解决的关键问题 综述了腈水合酶受氰基抑制的机制"氰基耐受型腈水合酶的发现以及其
在蛋氨酸和 $ 羟基异丁酰胺生物合成中的应用 同时"对今后氰基耐受型腈水合酶基础(应用研究的思路进行
了探讨
关键词&腈水合酶)氰基耐受性)

羟基腈)

氨基腈
中图分类号&1-""""文献标志码&(""""文章编号&&)-$ 8#)-!$$%&%%%# 8%%-# 8%)
*:651127M.2:5G56B1G& :B5/.J0S401.1G5/G/.G4.60-BJ45G510
KLX/PQHNJH>"W[/ ;^=>NEB?J"KLX/PZB?NC4=>"T[/K4;NV;=?" SLX/Q;?NC4H
$[?D:;:H:B>EY;>B?J;?BBF;?J" K4BV;=?JR?;]BFD;:O>E_BC4?>G>JO" L=?J34>H #&%%&,"*4;?=%
*M1G45:G&*O=?;@BFBD;D:=?:N?;:F;GB4O@F=:=DB =`D=CG=DD>E2;>C=:=GOD:7*><9=FB@ ;`:4 >F@;?=FO?;:F;GB
4O@F=:=DB" ;:C>HG@ :>GBF=:B4;J4 C>?CB?:F=:;>?D>E:4BCO=?;@B` ;:4>H:;?4;2;:;>?":4HD";:>9B?B@ H9 =?B`
9=:4 =`OE>F:4B;?@HD:F;=GDO?:4BD;D>E

N4O@F>IO=<;@BD=?@

N=<;?>=<;@BD7S:H@O>E:4BCO=?;@BFBD;D:=?:
E?;:F;GB4O@F=:=DB=?@ :4B;<9F>]BE:4B:>GBF=?CBC=9=C;:O` BFB:4B:`><=;? 9F>2GB?BB@B@ :>2BD>G]B@7_4B;?4;2;:;>? E:4B?;:F;GB4O@F=:=DB2O:4BCO=?;@B" =D` BG=D:4B
@;DC>]BFO>ECO=?;@BNFBD;D:=?:?;:F;GB4O@F=:=DB=?@ :4B=99G;C=:;>?D;? :4BDO?:4BD;D>E?;?B=?@
$N4O@F>IO;D>2H:OF;C=C;@ =<;@B` BFB;?:F>@HCB@7_4B2=D;C;@B=DE>FFBDB=FC4;?JCO=?;@BFBD;D:=?:N?;:F;GB
4O@F=:=DB` BFB=GD>@;DCHDDB@7
N0B O24J1&?;:F;GB4O@F=:=DB) CO=?;@BFBD;D:=?CB)
(
NCO=?>4O@F;?)
(
N=<;?>?;:F;GB
""腈水合酶 $/;:F;GBLO@F=:=DB"Xf*f,f$f&f!,"
简称 /L=DB%是一类广泛存在于自然界的微生物
酶"它能催化腈类化合物水合生成相应的酰胺"是
微生物腈化合物代谢途径的重要组成部分 $图
&% 腈水合酶的研究兴起于 $% 世纪 -% 年代中
期"目前全球腈水合酶法生产丙烯酰胺的年产量
达到 ,% 万 :"国内也已超过 #% 万 :"开辟了生物催
化在基础化工中大规模应用的先河"成为工业生
物技术发展史上的里程碑
""经过 #% 余年的发展"微生物腈水合酶的研究热
点已由早期丙烯酰胺(烟酰胺等大吨位化学品的合
成"深入到腈水合酶催化机理阐明(酶 底物构效关
系分析(嗜热等特殊性质腈水合酶的研究以及高附
加值手性精细化学品的合成等领域,&- 例如"
*F=<9 等,$-筛选到一种嗜热菌株 B%0#(/+,%(#4/+
U=C$&"该菌株具有极高的底物专一性和热稳定
图 E?微生物腈化合物代谢途径
Q.;=E?X5G-O5B 27H.:42M.56/.G4.60J0;45J5G.2/
性 笔者开发了手性药物中间体$=% $ m% $"$
二甲基环丙甲酰胺腈水合酶0酰胺酶双酶耦联生物
催化工艺"合成步骤由 ! 步缩短到 $ 步"从源头上去
除了有毒有害溶剂的使用,# 8-- 目前"已报道的产
腈水合酶微生物达 #% 余种"并通过分子动态模拟和
半经验量子力学等方法初步阐明了腈水合酶催化
过程中活性中心氨基酸残基,! 8.- (金属辅基与水分
子等的相互作用机制"利用底物修饰技术考察了腈
水合酶的立体选择性识别机理等
""

羟基酰胺(

氨基酰胺是两类重要的医药
中间体和聚合物单体"市场应用前景广阔"目前化
学合成法存在诸如原材料消耗大(能耗高(废水产
生量大等一系列环境问题 腈水合酶法合成

羟
基酰胺(

氨基酰胺是一种符合绿色化学发展方向
的新工艺"可以有效解决化学法带来的问题 但是
由于底物

羟基腈和

氨基腈的特殊性"酶法工
艺走向工业化生产还有许多问题亟待解决"如腈水
合酶的氰基耐受性问题等
E?$"510受氰基抑制机制
EPE?腈水合酶的结构和催化机理
""腈水合酶是由相等数量的

(
)
亚基构成的一
种金属酶"根据活性中心的不同可分为非血红素
$?>?N4B?NC>F;?>;@%钴型 $
种 活性中心的金属离子与 $ 个酰胺残基(# 个半
胱氨酸残基"形成 & 个八面体结构,&% 8&&- 其中"$
个半胱氨酸残基分别以*OD#S+
$
L和*OD#S+L的
形式存在"这使得金属的配位基形成了一种特殊的
.爪型/结构
""然而"最近的 ^线衍射分析显示"I6"4"0"00/+
23162","(#+(W$-% 铁型腈水合酶的 $ 个半胱氨酸残
基都被氧化成亚磺酸基,&$- 因此"不论是铁型还
是钴型腈水合酶"是否都包含 $ 个亚磺酸基或 & 个
亚磺酸基和 & 个次磺酸基"这一点尚待考证 人
工模拟研究发现"腈类化合物能够与低旋转状态
下的 \B$
%
%和 *>$
%
%活性中心进行牢固地结
合,&#- 通常情况下"活性中心的金属离子发挥了
路易斯酸的作用"能够活化腈类化合物与其进行
亲核反应,&, 8&-
""c>2=O=D4;等,&-提出了腈水合酶的催化机理$图
$%&首先"腈水合酶的 & 个残基处于氧化状态)激活
后羟基占据了该配位)随后"腈水合酶的金属离子
开始与水分子结合"该水分子被活性中心的羟基或
腈水合酶的辅基511$吡咯喹啉酮%激活"并一起攻
击底物中氰基的碳原子"形成酰亚胺"酰亚胺异构
化形成酰胺 由此可见"金属离子 \B或 *>是维持
腈水合酶活性中心结构的必需辅基"一旦丧失金属
辅基"腈水合酶便会失活
图 C?腈水合酶的催化机理
Q.;=C?,5G56BG.:H0:-5/.1H27/.G4.60-BJ45G510
,- 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
EPC?
"
羟$氨%基腈的解离
""在研究利用/L=DB催化水合

羟$氨%基腈生
产

羟$氨%基酰胺时"首先必须考虑的是底物

羟$氨%基腈在水相体系中的稳定性问题,&)- 研究
表明"

羟$氨%基腈在极性溶剂中存在着解离平
衡"并产生相应的醛和一定浓度的L*/,&-- $图 #%
图 @?
"
氨基腈和
"
羟基腈在水中自发分解平衡
Q.;=@?!92/G5/0231J0:2H92G.G.2/27
#
S5H./2/.G4.60
5/J:B5/2-BJ4./
""据报道"*/8与\B#m存在以下反应,&!- &
\B
#m
m#*/
8
m#L
$
+i\B$+L%
#
m#L*/
\B$+L%
#
m)*/
8
i\B$*/%
# 8
)
m#+L
8
""*/
8属于强配位体"它能和其他配离子抢夺金
属离子"形成低自旋的配合物并稳定的存在"因此
*/
8能与金属离子形成稳定的配位物 同时"由前
所述"/L=DB是一种金属酶"其活性中心以三价或二
价金属离子$\B#m(*>#m(*>$m等%为辅基"所以"

羟$氨%基腈自发水解产生的 */8会与 /L=DB活性
中心的金属离子相结合"形成配位物"从而显著降
低/L=DB的活力,&.- "直至完全失活 因此"腈水合
酶要应用于

羟基腈(

氨基腈的生物催化过程"
首先必须解决其对*/8的耐受性
C?氰基耐受型腈水合酶的发现
""早期报道,$% 8$&-表明"不同来源的腈水合酶在不同
浓度氰基作用下"所受到的抑制效果有所不同"氰基浓
度范围在 %f%& g$% <<>G0T之间 YF=?@=>等,$$-报道"
I6"4"0"00/+23162","(#+!-% (/%&. 的腈水合酶受
c*/强烈抑制"当存在$
!
<>G0Tc*/时"其酶活损失
达 %k /=J=D=`=等,$%-报道了一株菌株I6"4"0"00/+
26"4"062"/+W[在 %f%& <<>G0Tc*/下受到明显抑制"
而他们的另一菌株?+/4"&"-%+06("2"2%,6#+Y$#,$&-"在
<<>G0Tc*/下基本不受抑制"仍然能保持较高的腈
水合酶活力
""$%%, 年"PBF=D;<>]=等,$#-首次提出了氰基耐受
型腈水合酶"并且从土壤中成功筛选到 $ 株对氰化
物具有很强耐受性的菌种###?+/4"&"-%+&%2>#-<
%(+a(#$ 和?+/4"&"-%+,/1#4% a(&&#"氰基耐受浓
度达到 &%% <<>G0T"是迄今发现的氰基耐受能力最
高的菌株 随后的进一步研究发现"?f&%2>#-%(+
a(#$ 和?f,/1#4% a(&&# 中腈水合酶的

(
)
亚基
与菌株 ?f06("2"2%,6#+
)
$# 对应亚基同源性较高
同时发现 $ 株耐受型菌株的部分氨基酸序列与
?f06("2"2%,6#+
)
$# 相比"存在一定的差别 但具体
是哪些氨基酸的突变引起了腈水合酶氰基耐受性
能的提高"至今未见相关深入报道
""5BG:等,$,-将醇腈酶$O%-#6"1+0/(-1%%和腈水
合酶$@#12#(#2/,1"2%(R%(#,6#(/+%分别固定化后进行耦
联"利用双酶耦联反应成功催化 种不同的醛合成
相应的手性

羟基酰胺$图 ,% 研究表明"该固定
化腈水合酶在 9Lf"L*/浓度小于 && <<>G0T的
水溶液中具有相当的稳定性且酶活力能保持在
!%k以上 由于低 9L可以抑制中间产物

羟基
腈自发水解"因此整个耦联反应在酸性环境中进
行"通过加入适量浓度的底物醛并分批流加L*/最
终实现了

羟基酰胺的合成
图 T?醇腈酶g腈水合酶耦联合成手性
"
羟基酰胺
Q.;=T?!B/G-01.127$;%S
"
S-BJ42LB5H.J0131./; 5 M.0/IBH5G.:2/0S92G:51:5J027$;%S"/a5/J$"510
-"第 # 期 郑裕国等&一类生物催化剂###氰基耐受型腈水合酶
@?氰基耐受型腈水合酶在重要
"
羟
$氨%基酰胺合成中的应用
""蛋氨酸是禽畜类动物生长所必需的氨基酸之
一"是动物饲料里一种必不可少的添加剂 加有蛋
氨酸的动物饲料能在短时间内帮助动物快速成长"
节省大约 ,%k的饲料 在配合饲料特别是禽类饲
料中"蛋氨酸是第一限制氨基酸 畜禽缺乏蛋氨
酸"会引起发育不良"体重减轻"肝肾机能减弱"肌
肉萎缩"皮毛变质等 随着全球人口数量以及生活
质量水平的不断提高"世界蛋氨酸产量多年来保持
持续增长"$%% 年为 )% 万:"$%%- 年达到 -# 万:
""蛋氨酸主要由法国罗纳 普朗克公司(德国 UBN
JHDD=公司(美国/>]HD[?:BF?=:;>?=G公司以及日本东
洋曹达株式会社等公司垄断"采用以下的化学合成
工艺$图 %
图 U?蛋氨酸化学合成路线
Q.;=U?,-0H.:561B/G-01.1423G027H0G-.2/./0
""德国UBJHDD=公司开发了腈水合酶 化学法蛋
氨酸合成新工艺 由 , 甲硫基丙醛出发"通过斯特
雷克反应合成 , 甲硫基丁腈后"利用氰基耐受型腈
水合酶催化水合得到 $ 氨基 , 甲硫基丁酰胺$图
)%"最后在金属催化剂催化下得到蛋氨酸"与化学
合成法相比"该生物催化工艺的反应条件更为温
和"减少了大量固废和副产物的产生"设备投资也
大幅减少
图 W?蛋氨酸化学#酶法合成路线
Q.;=W?,-0H2S0/IBH5G.:1B/G-01.127H0G-.2/./0
""$ 羟基异丁酰胺是一种重要的药物中间体和聚
合物中间体"是生产甲基丙烯酰胺的前体物质 甲基
丙烯胺酰胺则是一种重要的聚合物单体"主要应用于
纤维匀染剂(吸湿剂(胶黏剂和抗静电剂等
""PBF=D;<>]=等,$#-将 ?f&%2>#-%(+a(#$ 用于水
解 $ 羟基异丁腈生产 $ 羟基异丁酰胺$图 -% 在
, l下"采用流加底物"能够使产物浓度积累至 &)%
<<>G0T以上 并且"

羟基腈解离的氰基完全抑
制了该菌株的酰胺酶活性"阻断了副产物

羟基
酸的产生
)- 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
图 Z?"
羟基酰胺
Q.;=Z?8.21B/G-01.127
"
S-BJ42LB5H.J0MB ""YF=?@=>等,$-通过基因重组技术"获得了一株
稳定表达腈水合酶的重组菌 GP0"(#YT$& $UX#%
$/L=DB%"该菌株能够水解 $ 氨基 #"# 二甲基丁
腈生成相应的酰胺$图 !% 但该重组菌GP0"(#YT$&
$UX#% $/L=DB%受底物和产物的抑制作用都较为
明显"仅能够在较低底物浓度$&% <<>G0T%下实现
完全转化 同时"测得了该腈水合酶的动力学参
数"A
<=I
i!#% R0J")
<
i&f, <<>G0T
图 >?重组大肠杆菌8aCE$Y#@% $$"510%催化合成 C 叔丁基丙氨酰胺
Q.;=>?8.21B/G-01.127343S603:./05H.J0MB 40:2HM./5/G>?2"(#8aCE$Y#@% $$"510%
T?展?望
""氰基耐受型腈水合酶的发现是腈水合酶研究
的又一次重要突破"拓展了腈水合酶在精细化学品
合成中的应用领域"为

羟$氨%基酰胺的工业化
生产开辟了一条新的途径 然而"氰基耐受型腈水
合酶的研究刚刚起步"目前报道的该类腈水合酶极
少"其氰基耐受性机制尚不明确"如何筛选和获得
氰基耐受型腈水合酶仍是关键问题
""为提高腈水合酶的氰基耐受性能或减少酶活
力的损失"需加强以下 # 个方面的研究&&%筛选具
有氰基耐受性的腈水合酶菌株 目前仅在 ?+/4"<
&"-%+D9f(@#12#(#2/,1"2D9f等少数几个微生物种属
内发现了氰基耐受型腈水合酶的产生菌 由于微
生物的多样性和环境适应性"有可能发现新的产氰
基耐受型腈水合酶的菌株 但高通量筛选模型的
建立"是必须解决的首要问题)$%通过生物催化反
应工程的手段"降低反应体系中氰基的浓度"从而
消除或减弱对腈水合酶的抑制 如降低反应温度"
调节反应体系 9L"抑制

羟$氨%基腈在水相中的
解离)以连续流加方式添加底物"使氰基持续保持
较低浓度)采用非水相反应体系"从根本上抑制

羟$氨%基腈的解离)#%通过对氰基耐受型腈水合酶
金属辅基的确证"编码基因(氨基酸序列的测定"运
用生物信息学的方法"比较其与非耐受型腈水合酶
在分子水平上的差异"进而通过同源建模"推求二
者在活性位点结构上的异同"将有助于深入对其氰
基耐受性机理的认识 同时"为通过理性设计手段
提高普通腈水合酶的氰基耐受性能提供理论依据
参考文献&
,&-"c>2=O=D4;a"S4;<;3H S7/;:F;GB4O@F>G=DB,W-7*HF+9;? *4B<
Y;>G"$%%%$,%&.N&%$7
,$-"*F=<9 Z("*>`=? U(7a>GBCHG=FC4=F=C:BF;3=:;>? >E=?>]BG:4BFN
<>94;G;C?;:F;GBLO@F=:=DB,W-7Y;>C4;94OD(C:="&..."&,#&&
$,.N$)%7
,#-"吴玉峰"郑裕国"沈寅初7$"$ 二甲基环丙腈水合酶产生菌的
氮离子注入选育及突变株产酶条件研究,W-7高校化学工程学
报"$%%-"$&$)%&.-&N.-)7
MH QHEB?J"K4B?JQHJH>"S4B? Q;?C4H7_4B2FBB@;?J>E$"$N@;B:4OGCOCG>9F>9=?BC=F2>I?;:F;GB4O@F=:=DBN9F>@HC;?J2O/
m
;<9G=?:=:;>? =?@ >9:;<;3=:;>? >EEBF? C>?@;:;>?D
,W-7W>HF?=G>E*4B<;C=GX?J;?BBF;?J>E*4;?BDBR?;]BFD;:;BD"
$%%-"$&$)%&.-&N.-)7
,,-"K4B?JZ*"M=?JQS"T;H K1"B:=G7[D>G=:;>? =?@ C4=F=C:BF;3=:;>?
>EH(K1#% 1+/2/6%1-+#+KWY$%&-,"C=9=2GB>EINB?=?:;>DBGBC:;]B
--"第 # 期 郑裕国等&一类生物催化剂###氰基耐受型腈水合酶
@BJF=@=:;>? >E$"$N@;9F>9=?BC=F2>I=<;@B,W-7a;CF>2;N
>GZBD"$%%-"&!&$!N$),7
,-"W;? S W"K4B?JZ*"K4B?JQP"B:=G7INB?=?:;>DBGBC:;]B4O@F>GOD;D
>E$"$N@;9F>9=?BC=F2>I=<;@B2O=<;@=DBEF><=?B`GO
;D>G=:B@ D:F=;? B2C#*%012#/&,#42#+KWY$%-%$& ,W-7W(99G
a;CF>2;>G"$%%!"&%&&&%N&&-7
,)-"M=?JQS" H^ Wa"K4B?JZ*"B:=G7[<9F>]BE=<;@=DB9F>N
@HC:;>? 2O=?B`GO;D>G=:B@ H(K1#% 1+/2/6%1-+#+KWY$%&-,
:4F>HJ4 >9:;<;3=:;>? >ECHG:HFB2;>GY;>:BC4?N
>G"$%%!"&!&&.#$N&.#-7
,--"*4B? W"K4B?JZ*"K4B?JQP"B:=G7a;CF>2;=G:F=?DE>F<=:;>? >E
?;:F;GBD:>4;J4N]=GHB=C;@D>F=<;@BD,W-7(@]Y;>C4BN
:BC4?>G"$%%."&&#&##N--7
,!-"QH La"T;H W"S4B? KQ7a>@BG;?JC=:=GO:;CE?;:F;GB
4O@F=:=DB2ODB<;NB<9;F;C=GbH=?:H<?,W-7W
a>GPF=94;CDa>@BG"$%%!"$-$,%&$$N$!7
,.-"5B9G>`DA;T"cH2;=A c"/>`=A M7aBC4=?;C=G=D9BC:D>E?;:F;GB
4O@F=:=DBB?3O<=:;C=C:;];:O&D:BBFB@ <>GBCHG=F@O?=<;CDD;:;>?D>E?+/4"-"0%24#% 162&",6#(% W*a #%. ,W-7*4B<54OD
TB:"$%%!",)-&&,,N&,.7
,&%- LH=?JM W"W;=W"*H<<;?JDW"B:=G7*FOD:=GD:FHC:HFB>E?;:F;GB
4O@F=:=DBFB]B=GD=?>]BG;F>? CB?:FB;? =?>]BGE>G@,W-7S:FHC:HFB"
&..-"$%&).&N)..7
,&&- a;O=?J=("\HD4;?>2H S"[:>c"B:=G7*FOD:=GD:FHC:HFB>EC>2=G:N
C>?:=;?;?J?;:F;GB4O@F=:=DB,W-7Y;>C4B94ODZBD*><$%%&"$!!&&&).N&&-,7
,&$- S>?JT"M=?Ja" S4;W"B:=G7L;J4 FBD>GH:;>? N^F=O<>GBCHG=F
D:FHC:HFB>E:4B?;:F;GB4O@F=:=DBEF>< I6"4"0"00/+23162","(#+
(W$-% FB]B=GD9>D:F=?DG=:;>?=G>I;@=:;>? >E:`>COD:B;?BD;?:>DHGN
E;?;C=C;@D=?@ =?>]BG2;>C=:=GO:;CC4BN
94ODZBD*><,&#- UBD=;Td"K;<?E>F<=:;>?=G
D9=CB=]=;G=2GB:>2F><>IO?;G=?@ =CFOG>?;:F;GB;? ;F>? ?;:F;GB
4O@F=:=DB,W-7U=G:>? _F=?D"$%%,$)%&!-$N!--7
,&,- S4B=FBFW"W=CAD>? LT"SC4 B`;:3BFU"B:=G7_4BE;FD:BI=<9GB>E=
?;:F;GB4O@F=:=DB<>@BGC><9GBI:4=:FB]BFD;2GO2;?@D?;:F;GBD,W-7W
(<*4BC"$%%$"&$,&&&,&-N&&,$!7
,&- S4B=FBFW"cH?J[Q"T>]BGS"B:=G7M4O;D:4BFB=?.[?BF:/CB?:BF;? :4B=C:;]BD;:B>E?;:F;GB4O@F=:=DB&FB=C:;];:O=?@ G;J=?@
@;DD>C;=:;>? EF><=E;]BNC>>F@;?=:B*>$[[% ?;:F;GB4O@F=:=DB<>@BG
,W-7W(<*4BC"$%%&"&$#&,)#N,)!7
,&)- dB??BDG=?@ Y"*>?? XX"c?>`GBD*W7*O=?;@B;? 2;>G>JO,a-7
T>?@>?&T>?@>? (C=@B<;C5FBDD"&.!&7
,&-- +A=?>d"(<=F=GTU"*>F@BDXL7c;?B:;CDBC>?@=FO@BH:BF;H<;N
D>:>9BBEBC:DE>FDH2D:;:H:B@ 2B?3=G@B4O@BCO=?>4O@F;? E>F<=:;>?
,W-7W(<*4BC"&.-)".!$&,%&,$%&N,$%#7
,&!- 翟慕衡"魏先文"查先庆7配位化学,a-7合肥&安徽人民出版
社"$%%-7
,&.- S=F;a("W=>HB? a"S=F>V=/Z"B:=G7[?EGHB?CB>EC>2=G:DH2D:;:HN
:;>? >? :4B=C:;];:O>E;F>?N:O9B?;:F;GB4O@F=:=DB&=FBC>2=G::O9B?;N
:F;GB4O@F=:=DBDFBJHG=:B@ 2OC=F2>? <>?>I;@B,W-7W[?>FJY;>N
C4B<"$%%-"&%&&)&,N)$$7
,$%- /=J=D=`=_"_=ABHC4;c"Q=<=@=L7*4=F=C:BF;3=:;>? >E=?B` C>N
2=G:NC>?:=;?;?J?;:F;GB4O@F=:=DB9HF;E;B@ EF>E
I6"4"0"00/+26"4"062"/+W& ,W-7XHFWY;>C4B<" &..&" &.)&
!&N!.7
,$&- /=J=D=`=_"/=?2=L"ZOH?>c"B:=G7/;:F;GB4O@F=:=DB>E?+/4"<
&"-%+06("2"2%,6#+Y$# 9HF;E;C=:;>? =?@ C4=F=C:BF;3=:;>?,W-7XHFW
Y;>C4B<"&.!-"&)$&).&N).!7
,$$- YF=?@=>5\Y"*G=99 W5"YHG(_7U;]BFD;:O>E?;:F;GB4O@F=:=DB
=?@ =<;@=DBB?3O]BFB@
EF>JF=94;C=GO@;D:;?C:4=2;:=:D,W-7(99GX?];F>? a;CF>2;>G"
$%%#").&-,N-))7
,$#- PBF=D;<>]=_"/>];A>]("+DD`=G@ S7SCFBB?;?J"C4=F=C:BF;3=:;>?
=?@ =99G;C=:;>? >ECO=?;@BNFBD;D:=?:?;:F;GB4O@F=:=DB,W-7X?JT;EB
SC;"$%%,",$)%&,#N,)7
,$,- 5BG:S d"Z=?:`;VA \d"S4BG@>? Z(7SO?:4BD;D>E=G94=:;C$=%N

N
4O@F>IOC=F2>IOG;C=<;@BHD;?J=>?B9>:2;B?3O<=:;CC=DC=@B>E
;<<>2;G;DB@ >IO?;:F;G=DB=?@ ?;:F;GB4O@F=:=DB,W-7(@]SO?:4
*=:=G"$%%."#&&#.-N,%,7
,$- YF=?@=>5\Y"dBFDBCA S"SOG@=:A *7Y;>C>?]BFD;>? >EH"7N:BF:N
GBHC;?B?;:F;GB:>HN:BF:NGBHC;?B2OFBC><2;?=?:CBGDBI9FBDD;?J?;N
:F;GB4O@F=:=DB=?@ HNDBGBC:;]B=<;@=DB,W-7X?JT;EBSC;"$%%,",
$)%&,-N))7
!- 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"