全 文 ：第 １４卷第 ２期
２０１６年 ３月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １４ Ｎｏ􀆰 ２
Ｍａｒ􀆰 ２０１６
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１６􀆰 ０２􀆰 ００１
收稿日期：２０１５－０３－１０
基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３计划）重大项目（２０１３ＡＡ０２０３０１）；普通高校研究生科研创新计划项目（ＫＹＬＸ１５＿０８１１）
作者简介：汤　 宝（１９８７—），男，安徽桐城人，博士研究生，研究方向：发酵工程；徐　 虹（联系人），教授， Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｘｕｈ＠ ｎｊｔｅｃｈ．ｅｄｕ．ｃｎ
通过透明颤菌血红蛋白基因表达提高
γ 聚谷氨酸的生物合成
汤　 宝，冯小海，张　 丹，许宗奇，姜永翔，李　 莎，徐　 虹
（南京工业大学 食品与轻工学院，江苏 南京 ２１１８００）
摘　 要：γ 聚谷氨酸（γ ＰＧＡ）的微生物合成是高消耗氧的生物过程，采取基因工程手段改造 γ ＰＧＡ 生产菌株
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ ２，以提高细胞利用氧的能力。 利用重叠 ＰＣＲ 方法将 Ｐ４３ 强启动子与透明颤菌血红蛋白
（ＶＨｂ）基因 ｖｇｂ拼接，插入大肠杆菌 枯草芽胞杆菌穿梭质粒 ｐＭＡ５上，得到重组质粒 ｐＭＡ５ Ｐ４３ ｖｇｂ，并将其转
化至 Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ ２中，从而获得重组菌 Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ ２（ｖｇｂ＋）。 经 ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析和 ＣＯ差光谱法证明 ＶＨｂ
能在 γ ＰＧＡ生产菌株中成功表达，且具有生理活性，大小约为 １􀆰 ６×１０４。 在 ７􀆰 ５ Ｌ 发酵罐上对重组菌 Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ
ＮＸ ２（ｖｇｂ＋）进行发酵性能考察，结果显示：重组菌比出发菌的生物量提高了 ４１􀆰 ２％，γ ＰＧＡ 的产量提高了
７􀆰 ５％，传代多次表明重组菌具有良好的发酵稳定性。 该研究为 γ ＰＧＡ的进一步工业化生产奠定了基础。
关键词：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ；透明颤菌血红蛋白；γ 聚谷氨酸
中图分类号：ＴＢ３２４　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１６）０２－０００１－０６
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｇｅｎｅ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｐｏｌｙ⁃γ⁃ｇｌｕｔａｍｉｃ
ａｃｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ⁃２
ＴＡＮＧ Ｂａｏ，ＦＥＮＧ Ｘｉａｏｈａｉ，ＺＨＡＮＧ Ｄａｎ，ＸＵ Ｚｏｎｇｑｉ，ＪＩＡＮＧ Ｙｏｎｇｘｉａｎｇ，ＬＩ Ｓｈａ，ＸＵ Ｈｏｎｇ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｌｉｇｈｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｏｌｙ⁃γ⁃ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｉｓ ａｎ ａｅｒｏｂｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓ． Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ ｗｅ ｔｒｉｅｄ ｔｏ ｔｒａｎｓｆｏｒｍ ｔｈｅ
ｓｔｒａｉｎ ｂｙ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｉｔｓ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｕｓｉｎｇ ｏｘｙｇｅｎ． Ｆｉｒｓｔ，ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＭＡ５⁃
Ｐ４３⁃ｖｇｂ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｐ４３ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｔｏ
Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｇｅｎｅ ｖｇｂ， ｔｈｅｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ⁃２， ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｓｔｒａｉｎ Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ⁃２（ｖｇｂ＋）．Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｉｚｅ ｏｆ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ＶＨｂ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎ Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ⁃
２（ｖｇｂ＋）ｗａｓ １􀆰 ６ × １０４ ｂｙ ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ． Ｆｕｒｔｈｅｒ，ｔｈｅ ｃａｒｂｏｎ ｍｏｎｏｘｉｄｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒａ ｖｅｒｉｆｉｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ
ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈａｄ ａ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ⁃２ （ ｖｇｂ＋ ）． Ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ７􀆰 ５⁃Ｌ
ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｈｅ ｂｉｏｍａｓｓ ４１􀆰 ２％ ａｎｄ ｔｈｅ γ⁃ＰＧＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
７􀆰 ５％ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｓｔｒａｉｎ． Ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｙ ａ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ γ⁃ＰＧＡ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ；Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ；ｐｏｌｙ⁃γ⁃ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ
　 　 γ 聚谷氨酸（γ ＰＧＡ）是由微生物合成的细胞
外氨基酸聚合物，由 Ｄ 型和 Ｌ 型谷氨酸通过 γ 酰
胺键连接而成［１］。 具有保湿性和生物可降解性等
理化和生物学特性，在环境、医药、食品和化妆品等
领域具有广泛的应用前景［２ ３］，是不可降解的合成
高分子材料（如塑料和水凝胶等）优良的替代品。
因此，开发该产品有利于加快我国高分子产业和产
品结构向绿色化、功能化方向发展。
透明颤菌血红蛋白（ＶＨｂ）是透明颤菌中的氧
调节蛋白，能够在极低的溶氧环境条件下大量合
成，使得菌体在恶劣的贫氧环境中也能较好地生
存。 科学家们利用 ＶＨｂ 的这一功能，首次将血红
蛋白基因（ ｖｇｂ）在大肠杆菌中进行克隆表达，发现
ＶＨｂ的导入可以在细胞水平上改善 Ｏ２的供应，提
高氧化磷酸化水平和 ＡＴＰ 再生能力，从而加快细
胞的生长和代谢［４］ 。 自从 ＶＨｂ在大肠杆菌中成功
表达以来，该蛋白已被广泛应用于耗氧量大、溶氧
易成为限制因素的工业微生物生产领域。 Ｋａｌｌｉｏ
等［５］将 ｖｇｂ基因在产 α 淀粉酶的枯草芽胞杆菌中
进行表达，提高了菌体生长和产酶能力；郭晓军
等［６］将 ｖｇｂ基因成功导入黄单胞杆菌，极大地提高
了黄原胶的产量； ＶＨｂ 还被用于抗生素工业，
Ｄｅｍｏｄｅｎａ等［７］通过在枝顶青霉菌种中表达该蛋白
提高了头孢菌素 Ｃ 的产量，Ｂｒｕｎｋｅｒ 等［８］也应用该
蛋白的表达来促进糖多孢红霉素菌产红霉素的含
量。 但 ＶＨｂ应用于 γ ＰＧＡ 发酵生产的未见报
道。 因此，为了提高 γ ＰＧＡ生产菌在低溶氧环境
条件下对氧的利用能力，构建 ＶＨｂ 表达的基因工
程菌是一种有效的策略。
本研究中，笔者以 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ ２ 为研
究对象，将强启动子 Ｐ４３与 ｖｇｂ基因连接，构建到大
肠杆菌 枯草芽胞杆菌穿梭质粒 ｐＭＡ５ 上，并将构建
的血红蛋白基因重组表达载体转化到 Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ
ＮＸ ２，考察 ＶＨｂ表达对 γ ＰＧＡ 合成及菌体生长
的影响。
１　 材料和方法
１􀆰 １　 材料
１􀆰 １􀆰 １　 菌株及质粒
大肠杆菌 Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、枯草芽胞杆菌 Ｂ．
ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８、枯草芽胞杆菌 Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ ２、大肠杆
菌 枯草芽胞杆菌穿梭质粒 ｐＭＡ５ 均保存于笔者所
在实验室，携带透明颤菌血红蛋白基因 ｖｇｂ 的质粒
ｐＯＫ１２为中国科学院上海生化研究所惠赠。
１􀆰 １􀆰 ２　 工具酶及试剂
限制性内切酶、连接酶、 Ｅｘ Ｔａｑ 等酶均为
ＴａＫａＲａ公司产品，引物合成、测序由南京金斯瑞公
司完成，其余试剂为进口或国产市售分析纯。
１􀆰 １􀆰 ３　 培养基及培养条件
大肠杆菌和枯草芽胞杆菌分子实验中均采用 ＬＢ
培养基（ｇ ／ Ｌ）：ＮａＣｌ １０，蛋白胨 １０，酵母粉 ５。 大肠杆
菌抗性培养基中各个抗生素的质量浓度（μｇ ／ ｍＬ）：氨
苄青霉素 ５０，氯霉素 ２５，卡那霉素 ２５，四环素 ４０。 枯
草芽胞杆菌抗性培养基中各个抗生素的质量浓度
（μｇ ／ ｍＬ）：氯霉素 １０，卡那霉素 ２５，四环素 ５。
Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ ２发酵培养基（ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ６０，
酵母膏 ５，谷氨酸钠 ５０，Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ ８，ＭｇＳＯ４ ０􀆰 ２５；
ｐＨ ７􀆰 ０。
种子液培养：接一环菌于装有 ８０ ｍＬ种子培养液
的 ５００ ｍＬ三角瓶中，２２０ ｒ ／ ｍｉｎ、３２􀆰 ５ ℃培养 １６ ｈ。
发酵罐培养：７􀆰 ５ Ｌ发酵罐，装液量 ４ Ｌ，配两档
圆盘透平桨，罐径与桨径长度比为 ２ ∶ １，１２１ ℃灭菌
１５ ｍｉｎ，接种量 ２％，发酵温度 ３２􀆰 ５ ℃，搅拌转速 ４００
ｒ ／ ｍｉｎ，通气量 １􀆰 ２ Ｌ ／ ｍｉｎ。
１􀆰 １􀆰 ４　 引物
本实验所用引物如表 １所示。
表 １　 本实验所用引物
Ｔａｂｌｅ １　 Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
引物名称 引物序列（５′ ３′） 酶切位点
产物长
度 ／ ｂｐ
Ｐ４３ Ｆ ＧＧＡＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＴＧＡＴＡＧＧＴＧＧＴＡＴＧＴＴＴＴＣＧＣ Ｎｄｅ Ｉ
Ｐ４３ Ｒ ＴＧＡＧＧＧＴＣＴＴＣＣＴＴＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＡＧＧＣＡＴＧＴ
３８７
ｖｇｂ Ｆ ＡＣＡＴＧＣＣＴＣＡＧＣＴＧＣＡＣＴＡＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＴＣＡ
ｖｇｂ Ｒ ＣＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＣＡＡＣＣＧＣＴＴＧＡＧ ＢａｍＨ Ｉ
４６８
１􀆰 ２　 实验方法
基因组提取、质粒提取、酶切、连接、ＳＤＳ ＰＡＧＥ
分析以及大肠杆菌转化等分子生物学技术均参照文
献［９］的方法。
２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
１􀆰 ２􀆰 １　 重叠 ＰＣＲ连接启动子 Ｐ４３和 ｖｇｂ基因
重叠 ＰＣＲ分两步进行。 第一步反应体系如下：
含 １０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ２􀆰 ５ μＬ、Ｍｇ２＋ ２ μＬ、ｄＮＴＰ ２ μＬ、模
板 Ｐ４３和 ｖｇｂ各 ２ μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶 ０􀆰 ５ μＬ，
加重蒸水至反应液总体积为 ２５ μＬ。 扩增程序如
下：９５ ℃预变性 ４ ｍｉｎ；９４ ℃变性 ５５ ｓ，６５ ℃ 退火
４０ ｓ，７２ ℃ 延伸 １ ｍｉｎ，循环 ５次；７２ ℃ 延长 ２ ｍｉｎ。
第二步在第一步基础上再加入 ２５ μＬ 反应物质，体
系如下：１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ，Ｍｇ２＋２ μＬ，ｄＮＴＰ ４ μＬ，
待重叠片段模板 Ｐ４３上游引物和模板 ｖｇｂ 下游引物
各 ２ μＬ，Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶 １ μＬ，加重蒸水至反应
液总体积为 ５０ μＬ。 扩增程序如下：９５ ℃ 退火 ４
ｍｉｎ；９４ ℃变性 ５０ ｓ，５５～６０ ℃退火 ４０ ｓ，７２ ℃ 延伸
１ ｍｉｎ，循环 ３０次；７２ ℃ 延长 １０ ｍｉｎ。
１􀆰 ２􀆰 ２　 重组表达质粒 ｐＭＡ５ Ｐ４３ ｖｇｂ的构建　
质粒构建流程如图 １ 所示，将 ＰＣＲ 得到的
Ｐ４３ 和 ｖｇｂ 基因片段回收，经过重叠 ＰＣＲ 扩增与
穿梭质粒 ｐＭＡ５ 经过 Ｎｄｅ Ｉ和 ＢａｍＨ Ｉ 双酶切后过
夜连接， 获得重组表达载体 ｐＭＡ５ Ｐ４３ ｖｇｂ，转
化大肠杆菌 ＪＭ１０９，挑选单克隆，经菌体 ＰＣＲ、质
粒双酶切验证。
图 １　 重组表达质粒 ｐＭＡ５ Ｐ４３ ｖｇｂ的构建流程
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ
ｐＭＡ５⁃Ｐ４３⁃ｖｇｂ
１􀆰 ２􀆰 ３　 重组表达质粒 ｐＭＡ５ Ｐ４３ ｖｇｂ 转化枯草
芽胞杆菌
重组表达质粒 ｐＭＡ５ Ｐ４３ ｖｇｂ 转化枯草芽胞
杆菌参照电转化方法［１０］。
１􀆰 ２􀆰 ４　 检测方法
ＣＯ差光光谱法检测透明颤菌血红蛋白 ＶＨｂ 的
表达活性，参照文献［１１］。
细胞生长的测定：将发酵液稀释 ２５倍后通过分
光光度计于 ６６０ ｎｍ处读取吸光值。
γ ＰＧＡ含量的测定参照文献［１２］。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 启动子 Ｐ４３和透明颤菌血红蛋白基因 ｖｇｂ 的
扩增以及重叠 ＰＣＲ连接
　 　 根据表 １ 中引物，分别以 Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８ 基因
组、ｐＯＫ１２ 质粒为模板，ＰＣＲ 扩增得到 Ｐ４３ 启动子
片段、含有自身启动子序列的 ｖｇｂ 基因片段。 所获
得的 ＰＣＲ产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图 ２
和图 ３ 所示。 由图 ２ 和图 ３ 可知：大小约 ４００、４７０
ｂｐ，与预期结果一致。 将上述 Ｐ４３ 启动子片段及
ｖｇｂ 基因切胶回收作为重叠模板，以 Ｐ４３ Ｆ及 ｖｇｂ
Ｒ作为引物进行重叠 ＰＣＲ。 重叠片段经切胶回收后
如图 ４所示。 由图 ４可知：条带大小约为 ８５０ ｂｐ，表
明已将 Ｐ４３启动子与 ｖｇｂ基因连接。
Ｍ—ＤＮＡ标准品；１～２—Ｐ４３启动子片段
图 ２　 Ｐ４３启动子片段的 ＰＣＲ扩增电泳
Ｆｉｇ􀆰 ２　 ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｐ４３
Ｍ—ＤＮＡ标准品；１～２—ｖｇｂ基因片段
图 ３　 ｖｇｂ基因的 ＰＣＲ扩增电泳
Ｆｉｇ􀆰 ３　 ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｖｇｂ ｇｅｎｅ
３　 第 ２期 汤　 宝等：通过透明颤菌血红蛋白基因表达提高 γ 聚谷氨酸的生物合成
Ｍ—ＤＮＡ标准品；１～２—Ｐ４３ ｖｇｂ重叠片段
图 ４　 重叠 ＰＣＲ扩增的 Ｐ４３ ｖｇｂ片段
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｏｖｅｒ⁃ｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ
Ｐ４３⁃ｖｇｂ ｐｒｏｄｕｃｔｓ
２􀆰 ２　 重组表达质粒 ｐＭＡ５ Ｐ４３ ｖｇｂ 的构建及
验证
　 　 重叠片段测序结果表明 Ｐ４３ 启动子序列与 ｖｇｂ
基因序列没有发生碱基的缺失和改变。 将该重叠
片段与 ｐＭＡ５ 质粒用 Ｎｄｅ Ｉ 和 ＢａｍＨ Ｉ 进行双酶切
后连接，按照图 １中流程构建重组表达质粒 ｐＭＡ５
Ｐ４３ ｖｇｂ，转化 Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９，挑取阳性克隆进行菌
液 ＰＣＲ验证，结果见图 ５。 再将 ＰＣＲ 验证有正确条
带的转化子提取质粒进行双酶切验证，结果如图 ６
所示。 图 ５、图 ６ 结果表明重组载体 ｐＭＡ５ Ｐ４３
ｖｇｂ构建成功。
Ｍ—ＤＮＡ标准品；１～４—菌液 ＰＣＲ验证 Ｐ４３ ｖｇｂ片段
图 ５　 重组质粒 ｐＭＡ５ Ｐ４３ ｖｇｂ的 ＰＣＲ验证
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｃｏｌｏｎｙ ＰＣＲ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｐｌａｓｍｉｄ ｐＭＡ５⁃Ｐ４３⁃ｖｇｂ
２􀆰 ３　 ＶＨｂ在 Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ ２中的表达及鉴定
２􀆰 ３􀆰 １　 ｐＭＡ５ Ｐ４３ ｖｇｂ 转化 Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ ２
采用电转化方法将 ｐＭＡ５ Ｐ４３ ｖｇｂ 重组质粒
转化 Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ ２，在卡那霉素抗性平板上进行
筛选，挑取 ３个转化子。 将这 ３株重组菌全部挑取至
含有卡那霉素抗性的液体培养基中，提取质粒验证，
Ｍ—ＤＮＡ标准品；１～２—Ｎｄｅ Ｉ和 ＢａｍＨ Ｉ双酶切 ｐＭＡ５ Ｐ４３ ｖｇｂ
图 ６　 重组质粒 ｐＭＡ５ Ｐ４３ ｖｇｂ的酶切验证
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｐｌａｓｍｉｄ ｐＭＡ５⁃Ｐ４３⁃ｖｇｂ
结果如图 ７ 所示。 由图 ７ 可知：泳道 １ 为出发菌 Ｂ．
ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ ２提取质粒结果，表示宿主菌中不存在质
粒；泳道 ２、３、４分别是 ３株重组菌提取质粒的结果，
表明 ３株重组菌中均有质粒转入。 为进一步验证质
粒是否是重组载体 ｐＭＡ５ Ｐ４３ ｖｇｂ，分别用Ｎｄｅ Ｉ和
ＢａｍＨ Ｉ 对这 ３个质粒进行双酶切，结果如图 ７的泳
道 ５、６和 ７所示，均有 ７ ５００ ｂｐ 和 ８５０ ｂｐ 的条带，说
明 ｐＭＡ５ Ｐ４３ ｖｇｂ已经成功转入 Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ ２，
将重组菌命名为 Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ ２（ｖｇｂ＋）。
Ｍ—ＤＮＡ标准品；１—Ｂ􀆰 ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ ２质粒提取结果；
２～４—重组菌质粒提取结果；５～７—Ｎｄｅ Ｉ和 ＢａｍＨ Ｉ双酶切
重组菌质粒 ｐＭＡ５ Ｐ４３ ｖｇｂ
图 ７　 重组菌 Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ ２（ｖｇｂ＋）的验证
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ⁃２（ｖｇｂ＋）
２􀆰 ３􀆰 ２　 ＳＤＳ ＰＡＧＥ检测重组菌株的血红蛋白 ＶＨｂ
的表达
通过 ＳＤＳ ＰＡＧＥ 检测重组菌 Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ ２
（ｖｇｂ＋）中 ＶＨｂ的表达，结果如图 ８所示。 由图 ８可知：
与原始菌 Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ ２ 相比，重组菌 Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ
ＮＸ ２（ｖｇｂ＋）成功表达了相对分子质量约 １􀆰 ６×１０４的蛋
４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
白条带，即血红蛋白 ＶＨｂ，与文献报道大小一致［１３］。
Ｍ—蛋白标准品；１—Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ ２（ｖｇｂ＋）总蛋白；
２—Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ ２总蛋白
图 ８　 ＶＨｂ在重组菌 Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ ２（ｖｇｂ＋）的表达
Ｆｉｇ􀆰 ８　 ＶＨｂ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ
ＮＸ⁃２（ｖｇｂ＋） ｂｙ ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ
２􀆰 ３􀆰 ３　 ＣＯ差光谱法检测重组菌 ＶＨｂ的表达活性
透明颤菌血红蛋白在不同的环境条件下可呈
现 ３种不同的状态，即氧化态、还原态、氧合态，并可
以相互转化，其中还原态是生理活性态，而氧合态
则是富氧条件下的表现形式［１４］。 若向溶液中鼓入
ＣＯ气体，则可形成血红蛋白 ＣＯ复合物，在 ４１９ ｎｍ
处呈现特征吸收峰。 通过 ＣＯ 差光谱法检测，结果
如图 ９所示。 由图 ９ 可知：重组菌 Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ ２
（ｖｇｂ＋）在 ４１９ ｎｍ处有明显的特殊吸收峰，而原始菌
Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ ２没有相应的吸收峰，表明重组菌表
达了有生理活性的血红蛋白。
图 ９　 重组菌 Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ ２（ｖｇｂ＋）的 ＣＯ差光光谱分析
Ｆｉｇ􀆰 ９　 ＣＯ⁃ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒａ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ⁃２（ｖｇｂ＋）
２􀆰 ４　 ＶＨｂ表达对 Ｂ􀆰 ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ ２发酵的影响
２􀆰 ４􀆰 １　 ＶＨｂ对发酵生产 γ ＰＧＡ的影响
在 ７􀆰 ５ Ｌ 罐中考察 Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ ２ 与 Ｂ．
ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ ２（ ｖｇｂ＋ ）分批发酵合成 γ ＰＧＡ 的过
程，结果如图 １０所示。 由图 １０可知：ＶＨｂ的表达极
大地促进了菌体生长，并且比原始菌提早进入对数
期，最终生物量（ＤＣＷ）达到（６􀆰 ８９±０􀆰 ２０） ｇ ／ Ｌ，比原
始菌增加了 ４１􀆰 ２％。 ＶＨｂ 的表达也加快了底物葡
萄糖和Ｌ 谷氨酸的消耗，但底物的消耗更多地用于
菌体生长，对 γ ＰＧＡ的合成没有明显的促进作用。
Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ ２（ｖｇｂ＋）发酵合成 γ ＰＧＡ 产量的最
高值为（３４􀆰 ４±０􀆰 ３８） ｇ ／ Ｌ，较原始菌提高了 ７􀆰 ５％。
或许因为 ｐＭＡ５ Ｐ４３ ｖｇｂ 作为外源质粒转 Ｂ．
ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ ２，表达效率不高。 另外，在发酵过程
中，重组菌株的发酵液颜色由微红色逐渐加深，发
酵结束时呈现为土黄色。 在有氧发酵过程中，由于
ＶＨｂ的表达导致发酵液颜色改变的现象已有报
道［１２］，或许在长时间的发酵过程中，表达质粒会有
少量的丢失，并且血红蛋白呈现的红色与枯草芽胞
杆菌的代谢产物长时间混合在一起导致了发酵体
系颜色的变化。 Ｋａｌｌｉｏ 等［１５］研究发现 ＶＨｂ 的表达
可以增加细胞中氧的利用效率，使呼吸链末端氧化
酶的活性发生改变，提高细菌中 ＡＴＰ 的水平，从而
提高细胞对氧的利用能力。
图 １０　 ＶＨｂ的表达对 γ ＰＧＡ分批发酵过程的影响
Ｆｉｇ􀆰 １０　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＶＨｂ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｂａｔｃｈ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ γ⁃ＰＧＡ
２􀆰 ４􀆰 ２　 重组菌 Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ ２（ｖｇｂ＋）的发酵稳定性
质粒稳定性是影响基因工程菌外源蛋白表达
的重要因素，同时外源蛋白的表达又影响着质粒的
稳定性。 特别在组成型表达系统中，由于外源蛋白
的持续表达，导致细胞代谢负担加重，质粒稳定性
的控制比较困难。 为考察重组菌 Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ ２
（ｖｇｂ＋）的发酵稳定性，分别将重组菌在含有卡那霉
素抗性及无抗性选择压力情况下传代多次，同时以
原始菌 Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ ２ 在无抗性条件下传代作为
对照。 随机选取 ３ 种培养条件下的第 ２、４、６、８ 和
１０代进行摇瓶发酵，结果见表 ２。 由表 ２ 可知： 含
有卡那霉素抗性选择压力的重组菌传代培养有较
５　 第 ２期 汤　 宝等：通过透明颤菌血红蛋白基因表达提高 γ 聚谷氨酸的生物合成
好的发酵稳定性，γ ＰＧＡ 产量未有明显下降，且均
优于原始菌的发酵结果。 而不含有抗性选择压力
的重组菌传代培养在第 ６代之后已没有明显的发酵
优势，甚至其 γ ＰＧＡ 产量还低于原始菌，可能原因
是多次无压力的传代培养造成了质粒的丢失，对细
胞内微环境造成了不利的影响。 由于笔者在保存
及活化重组菌过程中都是在含有卡那霉素抗性选
择压力的条件下进行的，因此，可以保证质粒的稳
定性，不会明显影响 ＶＨｂ表达对 γ ＰＧＡ 发酵的作
用效果。
表 ２　 Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ ２（ｖｇｂ＋）的发酵稳定性
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ⁃２（ｖｇｂ＋）
菌株
ρ（γ ＰＧＡ） ／ （ｇ·Ｌ－１）
第 ２代 第 ４代 第 ６代 第 ８代 第 １０代
Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ ２ ３０􀆰 ５±０􀆰 ２０ ３０􀆰 ３±０􀆰 １８ ３０􀆰 ０±０􀆰 １９ ３０􀆰 １±０􀆰 １６ ３０􀆰 ３±０􀆰 １７
Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ ２（ｖｇｂ＋）（Ｋｍｒ＋） ３５􀆰 １±０􀆰 ２２ ３５􀆰 ２±０􀆰 ２１ ３５􀆰 ０±０􀆰 ２０ ３４􀆰 ９±０􀆰 １９ ３４􀆰 ８±０􀆰 １５
Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ ２（ｖｇｂ＋）（Ｋｍｒ－） ３５􀆰 ０±０􀆰 ２１ ３４􀆰 ８±０􀆰 １５ ３０􀆰 ３±０􀆰 １８ ２９􀆰 ８±０􀆰 ２１ ２８􀆰 １±０􀆰 １８
３　 结论
通过在 Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ ２ 中外源表达透明颤菌
血红蛋白基因 ｖｇｂ，从分子水平上提高细胞自身对
溶氧的利用能力，最终重组菌的细胞量达到（６􀆰 ８９±
０􀆰 ２０） ｇ ／ Ｌ、γ ＰＧＡ产量为（３４􀆰 ４±０􀆰 ３８） ｇ ／ Ｌ，相比
原始菌分别提高了 ４１􀆰 ２％、７􀆰 ５％。 因此，在保持现
有设备和能耗压力不变的情况下，该策略为解决工
业微生物在发酵过程中的供氧不足问题提供了一
条新的途径。
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（责任编辑　 管　 珺）
６ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷