全 文 ：第９卷第５期
２０１１年９月
生　物　加　工　过　程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．９Ｎｏ．５
Ｓｅｐ．２０１１
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－３６７８．２０１１．０５．０１１
收稿日期：２０１１－０２－２１
基金项目：江苏省农业科技自主创新基金资助项目（ＣＸ（１０）２２６）；江苏省自然科学基金资助项目（ＢＫ２００９３５７）；江苏省高校自然科学重大基础
研究资助项目（０８ＫＪＡ１８０００１）
作者简介：张　丹（１９８８—），女，河南鹤壁人，博士研究生，研究方向：生物材料；徐　虹（联系人），教授，Ｅｍａｉｌ：ｘｕｈ＠ｎｊｕｔ．ｅｄｕ．ｃｎ
ＢａｃｉｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＮＸ ２聚谷氨酸合成酶基因
ｐｇｓＢＣＡ的克隆及生物信息学分析
张　丹，徐　虹，李　莎，许宗奇，魏　艳
（南京工业大学 食品与轻工学院，南京 ２１０００９）
摘　要：克隆ＢａｃｉｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＮＸ ２中的聚谷氨酸合成酶基因ｐｇｓＢＣＡ并进行测序。应用生物信息学分析方法和工
具对ＰｇｓＢ、ＰｇｓＣ、ＰｇｓＡ蛋白质的理化性质、跨膜区域、信号肽、细胞定位等进行分析和预测，并探讨它们的作用方
式。结果表明：ＰｇｓＢ蛋白不含有跨膜区，它与ＡＴＰ结合并催化ＡＴＰ的水解，为 ＰＧＡ合成提供能量；ＰｇｓＣ蛋白保守
性最高，其含有４个跨膜区域，是疏水性膜结合蛋白；ＰｇｓＡ为亲水性稳定蛋白，在Ｎ端存在１个跨膜区域。
关键词：Ｂａｃｉｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ；生物信息学；ｐｇｓＢＣＡ基因；序列分析
中图分类号：Ｑ７５　　　　文献标志码：Ａ　　　　文章编号：１６７２－３６７８（２０１１）０５－００５３－０６
ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｇｓＢＣＡｇｅｎｅｓｏｆＢａｃｉｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＮＸ２
ＺＨＡＮＧＤａｎ，ＸＵＨｏｎｇ，ＬＩＳｈａ，ＸＵＺｏｎｇｑｉ，ＷＥＩＹａｎ
（ＣｏｌｅｇｅｏｆＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＬｉｇｈｔＩｎｄｕｓｔｒｙ，ＮａｎｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１０００９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｐｇｓＢＣＡｇｅｎｅｓ，ｅｎｃｏｄｉｎｇａｐｏｌｙγｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ（γＰＧＡ）ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｓｙｓｔｅｍｏｆＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ
ＮＸ２，ｗｅｒｅｃｌｏｎｅｄａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅｄ．Ｔｈｅｐｈｙｓｉｃａｌａｎｄｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｒｅｇｉｏｎ，ｓｉｇｎａｌ
ｐｅｐｔｉｄｅ，ｃｅｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＰｇｓＢ，ＰｇｓＣ，ａｎｄＰｇｓＡｐｒｏｔｅｉｎｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄａｎｄｐｒｅｄｉｃｔｅｄｂｙｕｓｉｎｇ
ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｍｅｔｈｏｄｓ．ＲｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｓｓｅｎｔｉａｌＡＴＰｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｗａｓｍａｉｎｌｙｃａｔａｌｙｚｅｄｂｙｔｈｅａｃ
ｔｉｏｎｏｆＰｇｓＢｐｒｏｔｅｉｎ，ｗｉｔｈｏｕｔｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｒｅｇｉｏｎｓ．ＰｇｓＣｗａｓｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃａｎｄｍｅｍｂｒａｎｅｂｏｕｎｄｐｒｏ
ｔｅｉｎｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｆｏｕｒｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｒｅｇｉｏｎｓ．ＴｈｅｐｇｓＣｇｅｎｅｗａｓｔｈｅｍｏｓｔｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｇｅｎｅｏｆｐｇｓＢＣＡ
ｇｅｎｅｓ．ＰｇｓＡｗａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃａｎｄｓｔａｂｌｅｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｏｎｅｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｄｏｍａｉｎｎｅａｒｉｔｓＮｔｅｒｍｉ
ｎｕｓ，ｗｈｉｃｈｓｅｅｍｅｄｌｉｋｅｌｙｆｏｒｔｈｅｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｏｆγＰＧＡ．Ｔｈｉｓｓｔｕｄｙｗａｓｈｅｌｐｆｕｌｆｏｒｅｘｐｌａｉｎｉｎｇｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆ
ｔｈｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓＰｇｓＢ，ＰｇｓＣａｎｄＰｇｓＡｏｆγＰＧＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓｓｙｓｔｅｍ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｂａｃｉｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ；ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ；ｐｇｓＢＣＡｇｅｎｅｓ；ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ
　　γ 聚谷氨酸（γＰＧＡ）是一种由微生物合成的
胞外氨基酸聚合物，具有水溶性好、可生物降解以
及良好的生物相容性等优点，在环境、医药、食品和
化妆品等领域具有广泛的应用前景［１－２］。目前国内
外对于γＰＧＡ生产方法与应用的研究比较深入，而
对其合成机制的研究才刚刚起步。自从 Ｍａｋｉｎｏ
等［３］在炭疽芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ）的ｐＯＸ２质
粒上发现了编码 γＰＧＡ合成酶系的基因 ｃａｐＢ、
ｃａｐＣ、ｃａｐＡ后，Ａｓｈｉｕｃｈｉ等［４］在 Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ｎａｔｏ）的
基因组上也发现了与合成酶系相关的基因 ｐｇｓＢ、
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ｐｇｓＣ、ｐｇｓＡ（与炭疽芽孢杆菌的ｃａｐＢ、ｃａｐＣ、ｃａｐＡ同源
性分别为 ６６％、７７％、５０％）。通过将 ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ、
ｐｇｓＡ３个基因在Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ中分别组合表达，发
现所有这 ３个基因都是 γＰＧＡ合成必不可少的。
Ａｓｈｉｕｃｈｉ等［５］为了验证枯草芽孢杆菌中是否还存在
其他 γＰＧＡ合成系统，敲除了 Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ｃｈｕｎｇｋ
ｏｏｋｊａｎｇ）中的ｐｇｓＢＣＡ基因，结果表明突变株在任何
条件下都无法合成 γＰＧＡ，除此之外其他任何性状
都与野生株相同。另外，Ａｓｈｉｕｃｈ等［５］发现 ＰｇｓＢ具
有酰胺连接酶的结构特征，ＰｇｓＡ有可能与γＰＧＡ分
子链的延伸有关，而 ＰｇｓＣ只在 γＰＧＡ合成菌中存
在。Ａｓｈｉｕｃｈｉ等［６－７］研究发现，γＰＧＡ合成酶体系
与细胞膜紧密相连且不稳定，因此加大了该酶的纯
化难度。
　　笔者应用生物信息学的方法对 ｐｇｓＢＣＡ基因编
码的蛋白进行一系列的分析研究，以期为该基因的
深入研究提供参考和理论依据。
１　材料与方法
１１　材料
１１１　菌株与质粒
　　ＢａｃｉｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＮＸ ２，ＥｃｏｌｉＪＭ１０９为笔者所
在实验室保藏，ｐＭＤ１８ Ｔ购自ＴａＫａＲａ公司。
１１２　培养基
　　细菌常规培养基为 ＬＢ，抗性培养基为 ＬＢ中添
加终质量浓度１００μｇ／ｍＬ的氨苄青霉素。
１１３　试剂
　　ＴａｑＤＮＡ聚合酶，Ｔ４ＤＮＡ连接酶，限制性内切
酶，ＤＮＡ片段纯化试剂盒（ＴａＫａＲａ公司）；氨苄青霉
素，氯霉素（南京圣比澳生物科技有限公司）；质粒
提取试剂盒，基因组提取试剂盒 （上海申能博彩有
限公司 ），酵母提取物，胰化蛋白胨（Ｏｘｏｉｄ公司）。
其他试剂均为国产分析纯。
１２　方法
１２１　枯草芽孢杆菌基因组 ＤＮＡ的提取
　　用上海申能博彩有限公司的革兰氏阳性菌基
因组试剂盒提取ＢｓｕｂｔｉｌｉｓＮＸ ２基因组。
１２２　引物的设计与合成
　　根据ＮＣＢＩ中Ｂｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８的ｙｗｓＣｙｗｔＡＢ序列
设计引物，使用软件ＮＴＩ１００设计合成了３对能扩
增ＢｓｕｂｔｉｌｉｓＮＸ ２中ｐｇｓＢＣＡ基因的引物。在引物
５′端分别引入 ＢａｍＨⅠ酶切位点和 ＨｉｎｄⅢ 酶切位
点 （下划线部分），如下序列分别为 ｐｇｓＢＣＡ
（２８０５ｂｐ）：ｓｅｎｓｅ：５′ｇｔａａｇｃｔｃｃｇａｔｇａｇａａｔｃａｔａｇｔｇａｔ
３′，ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：５′ｇｔｇｇａｔｃｃｃｔｃｃｇａｔａｔｔａｇａｔｔａｇｔ３′；ｐｇｓＢＣ
（１８３８ｂｐ）：ｓｅｎｓｅ：５′ｃｔａａｇｃｔｃｃｇａｔｇａｇａａｔｃａｔａｇｔｇａｔ
３′，ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：５′ｃｔｇｇａｔｃｃｔａａａｔａｃｇｔｇｃｔａｔｇｇｔｔ３′；ｐｇｓＡ
（１１８４ｂｐ）：ｓｅｎｓｅ：５′ｃａａａｇｃｔａｔｇｔａａｇｇｔｇｔｇｔｃａａａｃｇａｔ
３′，ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：５′ｃａｇｇａｔｃｃｃｔｃｃｇａｔａｔｔａｇａｔｔａｇｔ３′。
１２３　ＰＣＲ体系与反应条件
　　以提取的ＢｓｕｂｔｉｌｉｓＮＸ ２全基因组ＤＮＡ为模
板，用合成的引物进行 ＰＣＲ扩增，ＰＣＲ反应条件：
９４℃ ５ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５９℃３０ｓ，７２℃６０ｓ，３０
个循环；７２℃延伸 １０ｍｉｎ。
１２４　目的片段的回收、纯化及序列测定
　　使用ＤＮＡ片段纯化试剂盒回收纯化目的片段，
然后分别与 ｐＭＤ１８ Ｔ载体连接，将连接产物转化
感受态细胞 ＥｃｏｌｉＪＭ１０９，将鉴定为阳性克隆的菌
液送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。
１２５　ｐｇｓＢＣＡ基因序列分析
　　ｐｇｓＢＣＡ基因编码蛋白的理化性质采用 Ｐｒｏｔ
Ｐａｒａｍ预测；信号肽使用 ＳｉｇｎａＩＰ３０Ｓｅｒｖｅｒ进行分
析；跨膜区域使用ＴＭＨＭＭＳｅｒｖｅｒ和Ｔｍｐｒｅｄ进行预
测；亚细胞定位采用 ＰＳＯＲＴＢ预测；二级结构采用
ＳＯＰＭＡ进行分析；结构功能域采用 ＮＣＢＩ链接的
ＣＤＤ预测；多序列比对及同源性分析采用 ＰＣ机本
地安装的ＮＴＩ１００软件进行。
２　结果与讨论
２１　合成酶基因的ＰＣＲ扩增
　　以 ＢｓｕｂｔｉｌｉｓＮＸ ２基因组 ＤＮＡ为模板，应用
合成的３对引物进行ＰＣＲ反应扩增合成酶基因，所
获得的 ＰＣＲ产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，ｐｇｓＢＣＡ
基因约２８００ｂｐ，ｐｇｓＢＣ基因约１８００ｂｐ，ｐｇｓＡ基因
约１２００ｂｐ，与预期结果相符（图１）。
２２　重组质粒 ｐＭＤ１８Ｔ ＢＣＡ的 ＰＣＲ及双酶切
验证
　　将重组质粒 ｐＭＤ１８Ｔ ＢＣＡ转化 ＥｃｏｌｉＪＭ１０９
感受态细胞，获得大量重组转化子。从中随机挑选
几个重组子单菌落，以 ＰＣＲ方法进行鉴定，用３对
引物分别扩增得到了大小约为２８００、１８００和１２００
ｂｐ的特异性片段（图２），表明所检测的克隆中含有
目的片段 ｐｇｓＢＣＡ。重组质粒 ｐＭＤ１８Ｔ ＢＣＡ经
ＢａｍＨⅠ单酶切后，得到大约５０ｋｂ的线性片段，经
ＢａｍＨⅠ和 ＨｉｎｄⅢ双酶切后，得到大约２８００ｂｐ的
插入片段和大约２７００ｂｐ的载体片段（凝胶电泳没
４５ 生　物　加　工　过　程　　 第９卷　
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Ｍ为ＤＮＡ标准品；１～３分别为ｐｇｓＢＣＡ、ｐｇｓＢＣ和ｐｇｓＡ基因
图１　ＮＸ ２合成酶基因的ＰＣＲ扩增电泳
Ｆｉｇ．１　ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆγＰＧＡｓｙｎｔｈｅｉｃｇｅｎｅｓ
ｆｒｏｍＢｓｕｂｔｉｌｉｓＮＸ ２
有分开），证明所挑取的克隆为正确的重组转化子
（图３）。
Ｍ为ＤＮＡ标准品；１～３分别为ｐｇｓＢＣＡ、ｐｇｓＢＣ和ｐｇｓＡ基因
图２　重组质粒ｐＭＤ１８Ｔ ＢＣＡ的ＰＣＲ验证
Ｆｉｇ．２　ＣｏｌｏｎｙＰＣＲｐｒｏｆｉｌｅｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄ
ｐＭＤ１８ＴＢＣＡ
２３　γＰＧＡ合成酶体系基因的序列测定
　　将阳性克隆的菌液进行测序，将３个基因提交
ＧｅｎＢａｎｋ，获得了注册序列号：ＪＦ３４３５６１、ＪＦ３４３５６２、
ＪＦ３４３５６３。分析其序列表明：ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ、ｐｇｓＡ基因
的开放阅读框大小分别为１１８２、４５０和１１４３ｂｐ，分
别编码３９３个、１４９个、３８０个氨基酸。测定序列与
ＧｅｎＢａｎｋ中报道的Ｂｓｕｂｔｉｌｉｓ（ｎａｔｏ）和Ｂｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８
中对应的序列进行同源性分析，试验株ｐｇｓＢ基因与
Ｂｓｕｂｔｉｌｉｓ（ｎａｔｏ）ｐｇｓＢ和 Ｂｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８ｙｗｓＣ基因核
苷酸同源性都为９９％，ｐｇｓＣ基因与Ｂｓｕｂｔｉｌｉｓ（ｎａｔｏ）
ｐｇｓＣ和Ｂｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８ｙｗｔＡ基因核苷酸同源性都为
１００％，ｐｇｓＡ基 因 与 Ｂｓｕｂｔｉｌｉｓ（ｎａｔｏ） ｐｇｓＡ和
Ｂｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８ｙｗｔＢ基因核苷酸同源性分别为９９％
Ｍ为ＤＮＡ标准品；１、３分别为ＢａｍＨⅠ酶切ｐＭＤ１８Ｔ ＢＣＡ结果；
２、４为 ＢａｍＨⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切ｐＭＤ１８Ｔ ＢＣＡ结果
图３　重组质粒ｐＭＤ１８Ｔ ＢＣＡ的ＰＣＲ验证
Ｆｉｇ．３　Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄ
ｐＭＤ１８ＴＢＣＡ
和１００％。
２４　γＰＧＡ合成酶体系蛋白理化性质分析
　　使用 ＥｘＰＡＳｙ数据库的 ＰｒｏｔＰａｒａｍ软件对 γ
ＰＧＡ合成酶基因编码的３种蛋白质氨基酸序列进
行分析，推定出３种蛋白质的分子式、相对分子质
量、等电点以及主要氨基酸残基等，结果如表 １所
示。根据不稳定参数的数值在 ４０以下才是稳定蛋
白的标准，推定ＰｇｓＣ和ＰｇｓＡ蛋白均属于稳定蛋白，
而ＰｇｓＢ蛋白为不稳定蛋白。ＰｇｓＢ和 ＰｇｓＡ蛋白的
疏水性系数均小于０，从而表明这２种蛋白为亲水
性蛋白，而ＰｇｓＣ蛋白的该系数大于０，推定其为疏
水性蛋白。
２５　γＰＧＡ合成酶体系蛋白结构与功能的预测和
分析
２５１　信号肽及跨膜结构的预测与分析
　　使用 ＳｉｇｎａＩＰ３０Ｓｅｒｖｅｒ软件对 γＰＧＡ合成酶
体系３种蛋白的氨基酸序列进行信号肽预测分析，
结果显示这３种蛋白均不存在信号肽，都属于非分
泌型蛋白。
用ＴＭＨＭＭＳｅｒｖｅｒ和 Ｔｍｐｒｅｄ工具对 γＰＧＡ合
成酶体系３种蛋白氨基酸序列的跨膜结构域进行预
测，推定蛋白质的跨膜结构和方向。图４为 ＰｇｓＢ、
ＰｇｓＣ、ＰｇｓＡ蛋白的跨膜结构分析结果。由图 ４可
知：ＰｇｓＢ蛋白在Ｎ端１～１７位氨基酸处存在一个跨
膜螺旋区；ＰｇｓＣ蛋白存在４个强跨膜螺旋区，推测
该蛋白牢固地与细胞膜结合，属于膜结合蛋白；
ＰｇｓＡ蛋白在Ｎ端２６～４２位氨基酸处存在一个强跨
５５　第５期 　　　张　丹等：ＢａｃｉｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＮＸ ２聚谷氨酸合成酶基因ｐｇｓＢＣＡ的克隆及生物信息学分析
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膜螺旋区，以上结果表明这３种蛋白都属于膜结合 蛋白，与Ａｓｈｉｕｃｈｉ等［６］的研究结果一致。
表１　γＰＧＡ合成酶体系３种蛋白质氨基酸序列的理化性质分析
Ｔａｂｌｅ１　ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｎγＰＧＡｓｙｎｔｈｅｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓ
理化性质 ＰｇｓＢ ＰｇｓＣ ＰｇｓＡ
分子式 Ｃ１９６９Ｈ３１５７Ｎ５２７Ｏ５８７Ｓ１５ Ｃ７９５Ｈ１２５７Ｎ１６９Ｏ１８７Ｓ４ Ｃ１９３１Ｈ３０１５Ｎ５１３Ｏ５６６Ｓ１０
相对分子质量 ４４０８×１０４ １６３×１０４ ４２７９×１０４
等电点 ５３８ ９４３ ８８９
不稳定参数 ４０９６ ２２４８ １６０９
疏水性系数 －０２１１ １３５１ －００４６
带负电荷氨基酸残基数 （Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）５７ （Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）５ （Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）４７
带正电荷氨基酸残基数 （Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）４６ （Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）９ （Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）５２
主要氨基酸残基 Ｉｌｅ４２；Ｇｌｕ３４；Ａｌａ３１ Ｌｅｕ２６；Ｉｌｅ２０；Ｇｌｙ１５ Ｌｙｓ４３；Ｖａｌ３２；ＡｌａＡｓｐ２８
图４　γＰＧＡ合成酶体系蛋白的跨膜螺旋分析
Ｆｉｇ．４　ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｈｅｌｉｃｅｓｏｎγＰＧＡｓｙｎｔｈｅｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓ
６５ 生　物　加　工　过　程　　 第９卷　
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２５２　氨基酸序列的亚细胞定位分析
　　用 ＰＳＯＲＴＢ软件对 γＰＧＡ合成酶体系３种蛋
白进行亚细胞定位分析，推定各个蛋白在细胞质、
细胞膜以及细胞壁上的定位可能性（表２）。由表２
可知：ＰｇｓＢ、ＰｇｓＣ、ＰｇｓＡ定位于细胞膜上的可能性分
别是８７８％、１００％和９５１％，表明这３种蛋白大都
定位在细胞膜上（表２）。由表２可以发现，ＰｇｓＣ蛋
白预测１００％定位在细胞膜上，与前面的蛋白跨膜
螺旋区分析结果一致。
表２　γＰＧＡ合成酶体系蛋白亚细胞定位分析
Ｔａｂｌｅ２　ＳｕｂｃｅｌｕｌａｒｌｏｃａｔｉｏｎｏｆγＰＧＡ
ｓｙｎｔｈｅｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓ
亚细胞定位
比例／％
ＰｇｓＢ ＰｇｓＣ ＰｇｓＡ
细胞质 １０５ ０ １７
细胞膜 ８７８ １００ ９５１
细胞外（含细胞壁） １７ ０ ３２
２５３　氨基酸序列的功能结构域分析
　　利用ＮＣＢＩ链接的ＣＤＤ软件分析了γＰＧＡ合成
酶体系３种蛋白氨基酸序列的功能结构域，结果如图
５所示。由图５可知：ＰｇｓＢ和 ＰｇｓＡ有相关结构域，
ＰｇｓＣ的分析结果未得到结构域。Ｖｅｔｉｎｇ等［８－９］在
ＰｇｓＣ中发现了Ｎ 乙酰谷氨酸合成酶的Ｎ 乙酰转移
酶结构域。而同样在另１种聚氨基酸（ｐｏｌｙεＬｌｙ
ｓｉｎｅ）的合成酶复合体中也发现了３个类似的结构域，
并且这个结构域对酶催化作用相当重要。
　　ＰｇｓＢ分析结果显示在氨基酸序列３３～２２１位
置与Ｍｕｒｌｉｇａｓｅ相似性较高，Ｍｕｒｌｉｇａｓｅ属于细胞壁
肽聚糖合成酶，共有 ４种（ＭｕｒＣ，ＭｕｒＤ，ＭｕｒＥ和
ＭｕｒＦ）。这 ４种酶对 ＬＡｌａ，ＤＧｌｕ，ｍｅｓｏｄｉａｍｉｎ
ｏｐｉｍｅｌａｔｅ或 ＬＬｙｓ和 ＤＡｌａＤＡｌａ与ＵＤＰＮａｃｅｔｙｌ
ｍｕｒａｍｉｃａｃｉｄ的有效结合具有重要的作用。它们都
有３个结构域：ＮｔｅｒｍｉｎａｌＲｏｓｓｍａｎｎｆｏｌｄｄｏｍａｉｎ负
责结合底物 ＵＤＰＭｕｒＮＡｃ；中间结构域，与多种 ＡＴ
ＰａｓｅｓａｎｄＧＴＰａｓｅｓ的 ＡＴＰ 结合域相似，Ｃｔｅｒｍｉｎａｌ
ｄｏｍａｉｎ，与二氢叶酸还原酶ｆｏｌｄ相似，负责结合即将
加入的氨基酸。Ａｓｈｉｕｃｈｉ等［５－６］提出的γＰＧＡ合成
酶复合物的反应机制中也体现了 ＡＴＰ的重要性，并
且在谷氨酸存在的条件下可以检测到 ＡＴＰ酶的活
性。也有观点认为该酶在整个合成酶复合体系起
着最关键的催化作用，负责合成短链的 γＬ谷氨酰
胺链［１０－１３］。
　　ＰｇｓＡ分析结果显示在氨基酸序列６３～２９８位
置与ＭＰＰ超级家族相似性较高，ＭＰＰ是金属磷酸酶
家族，该酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，
即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除
去，并生成磷酸根离子和自由的羟基。Ｎｏｒｄｌｕｎｄ
等［１４－１５］同样也发现了ＰｇｓＡ中含有与磷酸酶同源的
区域。
图５　γＰＧＡ合成酶体系蛋白的功能结构域分析
Ｆｉｇ．５　ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌｄｏｍａｉｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆγＰＧＡｓｙｎｔｈｅｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓ
２６　二级结构预测与分析
　　二级结构是指多肽链或多核苷酸链沿分子的
一条轴所形成的旋转和折叠等，主要是由分子内的
氢键维系的局部空间排列。预测蛋白质的二级结
构有助于了解蛋白的空间构象。采用 ＳＯＰＭＡ预测
γＰＧＡ合成酶体系３种蛋白的二级结构，结果表明
ＰｇｓＢ蛋白是由 ４３７７％α 螺旋，１６０３％ β折叠，
５０９％β转角，３５１１％无规则卷曲组成；ＰｇｓＣ蛋白
是由 ５９７３％α 螺旋，１６１１％β折叠，１２０８％
β转角，１２０８％无规则卷曲组成；ＰｇｓＡ蛋白是由
２５５３％α 螺旋，２５５３％β折叠，６０５％β 转角，
４２８９％无规则卷曲组成。
３　结论
　　１）ＰｇｓＢ与肽聚糖合成酶负责催化区（负责氨
基酸单体结合）具有高度的同源性。ＰＧＡ合成需要
ＡＴＰ提供能量，而 ＰｇｓＢ中氨基酸残基 ５６～６３为
ＡＴＰ结合位点，因此推测 ＰｇｓＢ主要负责 γＰＧＡ链
７５　第５期 　　　张　丹等：ＢａｃｉｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＮＸ ２聚谷氨酸合成酶基因ｐｇｓＢＣＡ的克隆及生物信息学分析
＼＼ＤＺ１９＼Ｄ＼孙桂云＼生物加工２０１１＼第５期＼ＳＷ１１０５．ＰＳ　６校样　排版：孙桂云　修改日期：２０１１／０９／２８
中谷氨酸的加入，并且参与结合 ＡＴＰ以提供合成的
能量。
　　２）ＰｇｓＣ是一个跨膜蛋白具有４个跨膜区，其
保守性最高。亚细胞定位预测其１００％位于细胞膜
上，因此推测该酶的作用是连接另外２个酶的 Ｎ端
牢固结合在细胞膜上，共同完成γＰＧＡ的合成。
　　３）ＰｇｓＡ在Ｎ端具有一个跨膜区，属于 Ｎ端插
入细胞膜的胞外酶，推测该酶负责 γＰＧＡ链的延
长，具有将 ＰＧＡ链拉离细胞以辅助 γＰＧＡ合成的
功能。
参考文献：
［１］　ＳｈｉｈＩＬ，ＶａｎＹＴ．Ｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙ（γｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ）
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８５ 生　物　加　工　过　程　　 第９卷　
＼＼ＤＺ１９＼Ｄ＼孙桂云＼生物加工２０１１＼第５期＼ＳＷ１１０５．ＰＳ　６校样　排版：孙桂云　修改日期：２０１１／０９／２８