全 文 ：生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
第22卷 第7期
2010年7月
Vol. 22, No. 7
Jul., 2010
文章编号 ：1004-0374(2010)07-0668-06
收稿日期：2010-06-08
基金项目：国家自然科学基金(30873366); 国家重点基
础研究发展计划(“9 7 3”项目)( 2 0 0 7 C B 9 4 6 9 0 3，
2009CB941602); 国家高技术研究发展计划(“863”计
划)(2006AA10A121，2007AA02Z109)
*通讯作者：E-mail:dhzhu@pumc.edu.cn
非编码RNA 在骨骼肌发育中的功能
张　勇，朱大海*
(中国医学科学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)
摘 要：近几年的研究表明，非编码 R N A 的功能几乎涉及生命活动的各个方面。非编码 R N A 在骨骼
肌发育中的功能研究揭示了骨骼肌发育调控的复杂性。该文总结了骨骼肌发育中非编码RNA 的系统发现
与鉴定以及非编码 R N A 在骨骼肌发育和再生中的功能研究。
关键词：非编码 R N A ；m i R N A ；骨骼肌发育；调控
中图分类号：Q52; R336　　文献标识码：A
Non-protein coding RNAs in muscle development
ZHANG Yong, ZHU Da-hai*
(National Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical
Sciences, Beijing 100005, China)
Abstract: Functional studies have demonstrated that non-protein coding RNAs (ncRNAs) play critical roles in
a wide spectrum of biological processes. The implication of ncRNAs in the regulation of muscle development
highlights the complexity of the regulatory network underlining the vertebrate myogenesis. Herein, we reviewed
the systematic identification and characterization of ncRNAs during muscle development. The functional stud-
ies of ncRNAs during muscle development and regeneration were also included.
Key words: non-protein coding RNA; microRNA; muscle development; regulation
骨骼肌发育是由多因素参与的受严格调控的复
杂生物学过程。骨骼肌细胞的增殖与分化是骨骼肌
发育的核心问题。以往的研究主要集中于各类成肌
调控因子的时序表达及其对骨骼肌细胞增殖分化的
调控机理，包括成肌调节因子家族(Myf5、MyoD、
Myogenin 和 MRF4)、肌细胞增强因子-2(myocyte
enhancer factor-2, MEF-2)、含有配对结构域的转录
调控因子Pax 家族成员Pax3和 Pax7 等。这些骨骼
肌发育重要调控蛋白质始终受到关注。近年来研究
表明，非编码RNA(non-protein coding RNA, ncRNA)
分子参与调节胚胎发育、器官发生、干细胞的维
持、细胞增殖分化与凋亡、基因表达调控等多个生
物学过程。非编码RNA对骨骼肌发育的调控成为骨
骼肌发育生物学的研究热点。
1　非编码 RNA
非编码RNA是生物体中不编码蛋白质但却起着
重要调控作用的 RNA 分子。ncRNA 是基因组的转
录产物，有些是由RNA 聚合酶I 转录的(如rRNA);
有些是RNA 聚合酶III 转录的(如 tRNA、5SrRNA);
多数是由RNA 聚合酶II 转录的。就序列特征而言，
ncRNA 中反复出现起始密码子和终止密码子，因而
没有开放读码框(open reading frame, ORF)。就功能
而言，ncR N A 具有蛋白质和核酸的双重特性，在
基因组印记、染色体复制、转录调节、R N A 加工
及剪切、mRNA 稳定性及翻译、蛋白质降解和运输
等过程中发挥重要作用，因而广泛参与胚胎发育、
669第7期 张　勇，等：非编码 R N A 在骨骼肌发育中的功能
器官发生、干细胞的维持、细胞增殖分化与凋亡等生
命活动的调节[1-4]。它们可特异性识别靶RNA 或DNA
分子上的核苷酸，通过形成互补碱基对发挥功能。
最初只是根据 ncRNA 所在位置、大小、特征
或功能给予命名。除了rRNA 和 tRNA 外，还包括：
催化性RNA (catalytic RNA, cRNA)，亦称核酶，是
R N A 拟酶和其他 R N A 自我催化分子；类 m R N A
(mRNA like)，是一类3端有PolyA，无典型ORF
的 RNA分子；指导性RNA (guide RNA, gRNA)，是
指导 m R N A 编辑的小 R N A 分子；端粒酶 R N A
(telomerase RNA); 信号识别颗粒(signal recognition
particle, SRP) RNA；核内小分子RNA (small nuclear
RNA, snRNA); 核仁小分子RNA (small nucleolar RNA,
snoRNA); microRNA 等。实际上，ncRNA 远不能
以上述方法分类，因为目前发现的ncRNA 种类越来
越多。目前倾向于用分子大小来分类：小的
ncRNAs (19~35 nt)，如miRNAs、piRNAs、内源
性的siRNAs等；中等大小的ncRNAs (50~500 nt)，
如tRNAs、snoRNAs、snRNAs 等；长片段非编码
RNA (大于500 nt)，如Xist 等。大规模cDNA 文
库测序[5]和Tiling基因芯片[6,7]研究结果表明，人类
基因组中大约 93% 的 DNA 可以转录为 RNA，其中
只有 2% 能够翻译蛋白质(即 mRNA)，其余 98% 为
非编码 RNAs。迄今为止，人们对各个物种基因组
中转录的非编码RNA的认识仍然是初步的，甚至不
知其基因的确切数目和种类。
2　骨骼肌发育中非编码RNA 的系统发现
随着功能基因组学研究和转录组测序技术的应
用，越来越多的非编码 RNA 被发现，非编码 RN A
的功能涉及到细胞生命活动和个体发育与疾病发生
的各个方面。尤其是时空特异性表达的非编码RNA
的发现提示非编码RNA在个体发育和组织器官发生
中发挥重要作用。肌肉组织特异性表达的非编码
RNA 的发现使非编码RNA 对肌肉发育的调控成为骨
骼肌发育生物学的研究热点。系统发现和鉴定在肌
肉组织中表达的非编码RNA对于理解非编码RNA对
肌肉发育的调控具有重要意义，同时为深入研究非
编码RNA对骨骼肌发育的调节机理和调控网络提供
充分的数据。
骨骼肌的发育来源于轴旁中胚层，轴旁中胚层
进一步发育成体节，体节的多能干细胞经历肌肉始
祖细胞发育命运的决定、增殖与分化，沿着既定的
路线迁移至将来形成肌组织的部位分化成骨骼肌。
为了研究非编码RNA对体节发育的调控及其对进一
步的肌组织形成过程的影响，Rathjen等[8]采用显微
切割的方法收集发育 3 ~ 5 d 鸡胚的体节，提取
RNA，对19～24 nt 的小RNA用 Solexa 技术深度测
序。发现在体节中表达的127 种 miRNAs，其中85
个是已知的，42 个是在体节中新发现的 miRNAs。
通过Northern杂交发现几个miRNAs在体节部位有高
水平表达，提示这些 mi RN A s 参与体节发育的调
控。Nielsen 等[9]采用另一种小RNA 测序的方法
(massively parallel sequencing technology)对猪的骨骼
肌组织中表达的miRNA 进行深度测序，获得212个
m i R N A s 在 骨 骼 肌 组 织 中 表 达 。 H u a n g 等
[10]采用 in
silico预测和miRNA芯片分析了猪胚胎期和出生后骨
骼肌组织的miRNA 表达谱，鉴定了在胚胎期和出生
后表达的 miRNAs。
我们实验室以骨骼肌生长速度显著差异的肉用
型鸡和蛋用型鸡为材料，采用Solexa测序的方法对
鸡的骨骼肌组织中表达的miRNA 进行分析，发现在
鸡的骨骼肌组织中有216 种 miRNAs 表达，表达丰
度最高的是miR-206。同时，采用生物信息学分析
方法，发现39 个新的miRNAs。通过比较蛋用型鸡
和肉用型鸡骨骼肌组织中miRNA 的表达水平，发现
15 个蛋鸡和肉鸡骨骼肌组织差异表达的 miRNAs。
提示这 15 个 miRNAs 可能是骨骼肌发育的调控因
子，目前正在进行其功能的研究(数据未发表)。
除了miRNAs，其他类型的非编码RNA 在骨骼
肌发育中也发挥重要作用。通过构建骨骼肌组织非
编码RNA文库(50~500 nt)，我们实验室克隆了在鸡
的骨骼肌组织中表达的125 种非编码RNAs(50~500
nt)和在恒河猴的骨骼肌组织中表达的117个非编码
RNA 分子[11,12]。通过检测这些非编码RNAs 的时空
表达谱，分析非编码RNA在蛋鸡和肉鸡骨骼肌组织
中表达的差异，筛选到了一些对骨骼肌发育可能起
重要调控作用的非编码 RNAs。包括 1 个骨骼肌和
心肌特异表达的新的非编码RNA(GGN39)，6 个蛋
鸡和肉鸡骨骼肌组织差异表达的非编码RNAs(其中1
个功能未知的新的非编码RNA、3 个 snoRNAs 和 2
个scaRNAs)。这些蛋鸡和肉鸡骨骼肌组织差异表达
的非编码 RNA 可能对骨骼肌发育起重要的调控作
用。
3　肌肉特异表达的非编码RNA 对骨骼肌发育
的调控
microRNA(也写作miRNA 或 miR)作为一类具有
670 生命科学 第22卷
调控活性的非编码小分子RNA，广泛参与多种组织
器官的发育与疾病发生。miRNA 参与骨骼肌发育的
直接证据来自于骨骼肌组织条件性敲除dicer小鼠的
骨骼肌发育异常[13]。dicer基因敲除鼠的骨骼肌发育
受到严重影响，包括围产期致死、骨骼肌块减小、
肌纤维形态异常。由于dicer基因编码的蛋白是miRNA
成熟加工所必需的核酸内切酶，说明miRNAs 在胚
胎骨骼肌发育过程中起重要作用。研究中发现一些
miRNAs 在骨骼肌组织中特异表达，称为MyomiRs，
比如miR-l、miR-133、miR-206参与肌细胞增殖分
化的调控以及肌肉相关性疾病的病理发生[14]。miR-l、
m iR - 1 3 3、m iR - 2 0 6 的启动子区含有 My o D 和
Myogenin等成肌调控因子结合位点，保障和维持了
MyomiRs的骨骼肌组织表达特异性[15]。同时，miR-1
的启动子区还有MEF-2和血清应答因子(serum re-
sponse factor，SRF)结合位点，受MEF-2和SRF的
调控[16]。
miR-1/206 家族在进化上出现较早，序列和功
能都非常保守。在果蝇中的研究表明，miR-1 是维
持体壁肌肉发育和完整性的必需基因(essential
gene)，尽管miR-1对中胚层的模式形成和肌肉细胞
的特化(mesoderm patterning and muscle specification)
不是必需，但对幼虫阶段(快速生长期)果蝇肌肉生
长发育非常关键。在大量肌肉生长的二期幼虫发育
阶段，miR-1 突变体幼虫出现肌肉组织萎陷，运动
减少直至死亡[17]。体外和体内研究证明，miR-1 和
miR-133对成肌细胞的分化和增殖起重要调控作用。
组蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)是促分化的转录因子
MEF- 2 的阻遏因子，可以抑制肌细胞分化。研究
表明，在骨骼肌细胞分化过程中，HDAC4 是 miR-1
的靶基因[18]，而MEF2是miR-1的转录调控因子[16]。
这样miR-1 通过抑制HDAC4 表达促进MEF-2 的功能
而建立一个正反馈调控环，MEF2 上调miR-1 进一
步抑制 H D A C 4 ，从而促进肌细胞分化。相反，
miR-133 的功能是通过靶向血清应答因子SRF 促进
骨骼肌细胞增殖[16]。miR-206的功能与miR-1相似，
促进 C2C12 成肌细胞分化。它通过靶向 DNA 聚合
酶的α亚基(polα1)[19]、连接蛋白43 (connexin 43、
Cx43)[20]、follistatin-like 1 (Fstl1)和utrophin (Utrn)[21]，
从而抑制DNA 合成使细胞退出细胞周期进入终末分
化。
我们实验室克隆了一个新的在鸡骨骼肌和心肌
组织特异表达的非编码RNA (GGN39)[11]。基因组定
位分析表明，G G N 3 9 位于 M - 型磷酸果糖激酶
(phosphofructokinase M, PFKM)基因的第二内含子
中。PFKM 第二内含子全长 68 个碱基，而 GGN 39
全长 67 个碱基，与 PFKM 的第二内含子相比少了
一个3端的G。Northern杂交的方法检测GGN39与
P F K M 基因在鸡的不同组织中的表达情况，结果
PFK M 基因与 GG N 3 9 有一致的组织表达模式，主
要在骨骼肌和心肌组织中表达。PFKM 基因与GGN39
在不同发育阶段的骨骼肌组织中的表达趋势相同：
在胚胎期表达较少，主要在出生后的骨骼肌中表
达。通过PFKM 第二内含子剪切位点突变实验研究
表明，GGN39 的产生依赖于 PFKM 初始转录产物的
内含子剪切过程。PFKM 是糖酵解途径的关键酶(限
速酶) ，在骨骼肌代谢和发育过程中发挥重要作
用。作为限速酶，P F K M 受到多方面的调控，
GGN39 这个非编码RNA 分子可能通过对PFKM 表达
或活性的调节参与骨骼肌发育与代谢的调控。进一
步的生物信息分析发现，GGN39 不属于已知类型的
非编码 RNA 分子。本研究结果提示，除了目前研
究较多的miRNAs 外，仍有其他类型的非编码 RNA
呈现组织表达特异性并对特定组织器官发育起重要
调节作用。
4　非肌肉特异表达的非编码RNA 对骨骼肌发
育的调控
除了前面提到的MyomiRs，许多各种组织广泛
表达的 miRNAs 也参与骨骼肌的发育和功能调控。
miR-27在分化的胚胎肌节和激活的成年卫星细胞中
均有表达。在骨骼肌细胞中，miR-27 特异性靶向
pax3 mRNA，下调pax3 的蛋白水平确保肌细胞正
常进入肌肉分化程序[22]。Hox-A11 是一种成肌细胞
终末分化的阻遏物，可以通过诱导MyoD 的表达促
进肌肉细胞的增殖。miR-181 在小鼠肌原性细胞系
C2C12分化过程中显著上调，提示miR-181可能参与
骨骼肌细胞分化的调节。进一步分析发现，miR-181
可以靶向 Hox-A11 来促进成肌细胞终末分化[23 ]。
YY1与Ezh2是肌肉特异基因表达的阻遏物，可以抑
制miR-29 表达。在骨骼肌细胞分化过程中YY1 表
达下调，miR-29 表达抑制解除，然后miR-29 进一
步靶向转录因子YY1促进骨骼肌细胞的分化[24]。横
纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma，RMS)细胞肌源性分
化缺陷，分析发现 RMS 细胞中 miR-29 表达沉默，
过表达miR-29 诱导RMS细胞分化，因此miR-29 作
671第7期 张　勇，等：非编码 R N A 在骨骼肌发育中的功能
为促分化因子起到肿瘤抑制基因的作用[24]。miR-26
通过靶向Ezh2，使Ezh2表达下调来促进终末分化[25]。
miR-214通过Hedgehog信号转导通路影响慢肌纤维
的产生[26]。Sun等[27]在 TGF-β抑制成肌分化的模型
中发现miR-24表达受到抑制，研究发现这种抑制是
通过Smad3 实现的，进一步功能研究表明miR-24
是促成肌分化分子。在几种类型的肌营养不良病例
中，均发现一些特征性的miRNA 表达谱改变[28]，这
些miRNAs 多数是在各种组织中广泛表达的。以上
一系列研究说明，非肌肉组织特异表达的miRNAs
在骨骼肌发育和肌肉相关性疾病发生中起重要作用。
最近，对 miRNA 在骨骼肌增殖分化中发挥功
能的信号传导通路研究取得进展。Cardinali等[29]通
过比较增殖和分化的肌细胞中miRNA 的表达谱，鉴
定了一批参与肌源性分化的miRNAs，其中miR-221
和miR-222 在骨骼肌细胞分化过程中显著下调。使
用温度敏感的细胞分化模型，发现miR-221和miR-
222 的表达受Ras-MAPK 信号通路调节。通过生物
信息学分析和实验验证发现在骨骼肌细胞分化过程
中 p27 是 miR-221 和 miR-222 的一个靶基因[29]。
miR-486 主要在心脏、肺、骨骼肌和膀胱组织中表
达，在肌肉组织中的表达丰度较高。Small 等[30]发
现 miR-486 的转录水平受血清应答因子SRF 和 SRF
的共转录激活因子MRTF-A(myocardin-related tran-
scription factor-A)以及MyoD的调控。进一步分析
发现PTEN(phosphatase and tensin homolog)和Foxo1a
是 miR-486 的靶基因。 miR-486 通过抑制PTEN 和
Foxo1a 影响PI3K/Akt信号转导通路的活性而调节肌
肉生长发育。
除了miRNAs，其他类型的非骨骼肌组织特异
性表达的ncRNA 在骨骼肌发育和疾病中的作用也有
报道。横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma，RMS)是一
种恶性软组织瘤，包括两种亚型：腺泡型(alveolar
RMS)和胚胎型(embryonal RMS)，表现为骨骼肌细
胞分化程度低。Chan等[31]采用RDA(representational
difference analysis)技术克隆了一个新基因NCRMS
(non-coding RNA in RMS)，NCRMS 在腺泡型横纹
肌肉瘤中的表达水平显著高于胚胎型横纹肌肉瘤。
Northern 杂交显示，NCRMS 在腺泡型横纹肌肉瘤中
的转录本为1.25 kb，没有读码框，属于长片段的
非编码 RNA。NCRMS 作为非编码 RNA 可能参与骨
骼肌细胞增殖分化的调控及不同亚型横纹肌肉瘤的
病理发生。我们实验室在研究肌营养不良相关致病
基因时，发现一个长片段的非编码RNA 可能参与肌
营养不良的病理发生。选择同一进行性肌营养不良
患者的正常肌肉组织和萎缩的肌肉组织为材料，采
用差异显示(differential display PCR, DD-PCR)技术得
到一系列差异表达的 ESTs。序列分析发现，其中
一个EST是一个长的非编码RNA MALAT-1(metastasis
associated in lung adenocarcinoma transcript 1 long
isoform, transcribed non-coding RNA)在肌营养不良
患者的萎缩肌肉组织中表达上调[32]，提示MALAT-1
作为非编码RNA可能对肌营养不良的病理发生起重
要作用。另外，我们实验室以骨骼肌生长速度显著
差异的蛋用型和肉用型鸡为实验材料，筛选鉴定骨
骼肌发育中起调控作用的非编码RNA，发现一些各
种组织中广泛表达的snoRNA (small nucleolar RNA)
在蛋鸡和肉鸡的骨骼肌组织中的表达存在差异，提示
这些snoRNA 可能参与骨骼肌发育和代谢的调控[11]。
总之，尽管miRNAs 是目前非编码RNA 对骨骼肌发
育调控研究的焦点，但是其他各种类型的ncRNA 也
在骨骼肌发育与疾病发生的调控网络中发挥重要作
用。
5　非编码RNA 在骨骼肌损伤再生以及肌肉肥
大过程中的作用
MDX小鼠是肌营养不良蛋白dystrophin基因缺
陷鼠，是研究肌营养不良发病机制和骨骼肌损伤再
生机理的常用模型。Greco等[33]采用实时定量RT-PCR
方法比较了 MDX 小鼠与野生型小鼠骨骼肌组织中
miRNA 的表达变化，同时分析了与正常人相比在肌
营养不良患者(DMD 型)骨骼肌组织中表达改变的
miRNAs，发现 11 个 miRNAs 在 MDX 小鼠和 DMD
患者中有类似的表达改变。由于肌纤维坏死和再生
是 DMD 患者和 MDX 小鼠的常见病理改变，他们又
制备了后肢缺血诱导小鼠的肌肉损伤再生模型，进
一步检测骨骼肌损伤再生过程中表达改变的
miRNAs, 发现在MDX 小鼠和DMD 患者中有表达改
变的 m i R N A 可分为三类：( 1 ) 肌肉再生相关的
miRNAs (regenerative miRNAs), 包括miR-31、miR-34c、
miR-206、miR-335、miR-449 和 miR-494, 这些
miRN As 在 MDX 小鼠和 DMD 患者中表达上调，而
且在缺血损伤引起的再生纤维及新生鼠骨骼肌组织
中表达水平较高；( 2 )肌肉退变相关的 m i R N A s
(degenerative miRNAs)，包括miR-1、miR-29c和
miR-135a, 这些miRNAs 在 MDX 小鼠、DMD 患者
672 生命科学 第22卷
和肌肉损伤再生的退变期表达下调，这些 miRNAs
的下调伴随着肌纤维的损失和纤维化；(3)炎症反应
相关miRNAs，包括miR-222和 miR-223, 在损伤的
肌组织部位表达上调，而且与炎细胞浸润呈正相关[33]。
为了探讨已知的MyomiRs在dystrophin基因缺陷引
起的肌营养不良病理发生过程中的作用，Yuasa 等[34]
分析了 MDX 小鼠胫骨前肌中 miRN A 的表达情况，
发现与野生型小鼠相比miR-206 在 MDX小鼠的胫骨
前肌表达明显上调，而miR-1 和 miR-133 表达没有
变化。原位杂交结果显示，miR-206 主要在新形成
的肌管或再生纤维中表达。这些结果表明，
miRNAs在骨骼肌损伤再生的病理过程中发挥重要作
用。
持续锻炼后，会导致骨骼肌重塑，骨骼肌组
织中调节肌肉肥大、线粒体生成、糖脂代谢的转录
调控网络激活。近几年的研究表明，miRNAs 参与
锻炼后骨骼肌重塑的调控过程。Aoi 等[35]探讨了
miRNA 对体育锻炼引起的骨骼肌肥大以及废用性肌
肉萎缩的影响。C57BL/ 6 鼠锻炼 4 周(runni ng
exercise)诱导肌肉肥大，后肢固定诱导废用性萎缩
模型。采用miRNA 基因芯片的方法分析了腓肠肌组
织miRNA 表达谱，发现miR-696 的表达水平在两种
模型中有显著性改变。PGC-1α在肌肉锻炼后显著
上调，在废用性萎缩肌肉组织中表达下调，与miR-696
的表达趋势相反。进一步研究发现PGC-1α是miR-696
的靶基因。因此，miR-696 通过对PGC-1α的靶向
调控影响锻炼后的骨骼肌代谢和肥大[35]。Safdar等[36]
研究了持续锻炼引起的miRNA的表达变化以及与锻
炼应答的转录调控网络的关系。C57Bl/6J 鼠被固着
或强迫锻炼(sedentary or forced-endurance exercise by
treadmill run)以后，股四头肌中miR-181、miR-1和
miR-107 的表达水平显著升高，分别增加了 37%、
40% 和 56%；miR-23 的表达降低了84%；miR-133
表达没有变化。miR-23的靶基因PGC-1α和PGC-1α
的下游基因ALAS、CS、cytochrome c 的表达水平
显著上调。这些研究结果表明miRNA 介导的转录后
调控参与到持续锻炼后骨骼肌重塑的调控网络中。
鉴于miR-1、miR-133和miR-206对肌肉发育起
重要调控作用，Nakasa等[37]探讨了在大鼠骨骼肌损
伤再生模型中，局部注射肌肉特异表达的miRNA 对
肌肉组织再生过程的影响。 大鼠胫骨前肌损伤后，
注射miR-1、miR-133 和 miR-206 的混合物。与对
照组相比，损伤一周后，注射miR组在形态学和生
理指标上能够观察到肌肉再生较强，并有效地抑制
纤维化。局部注射myomiR 可能为骨骼肌损伤的治
疗提供新的思路。
6　展望
非编码RNA的功能研究揭示了骨骼肌发育调控
的复杂性。目前，miR N A 对骨骼肌发育的调控是
骨骼肌发育生物学研究的焦点。miRNA 通过对靶基
因的调节参与到骨骼肌发育调控网络中。在骨骼肌
细胞增殖分化过程中，一个miRNA 可以调控多个靶
基因，同一个基因又可以受多个 miRNAs 的调控。
因此，m i R N A 靶基因的鉴定和功能研究是阐明
miRN A 对骨骼肌发育调控的关键。同时，在骨骼
肌发育中miRNA 基因自身的表达调控机制研究也是
解析由非编码RNA和蛋白质分子构成的复杂调控网
络的核心问题之一。另一方面，其他类型的非编码
RNA 在骨骼肌发育中的调控也是将来的研究重点，
尽管富有很大的挑战。
[参　考　文　献]
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