全 文 ：第25卷 第10期
2013年10月
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
Vol. 25, No. 10
Oct., 2013
文章编号：1004-0374(2013)10-0952-06
应用合成生物学构建蓝细菌细胞工厂的研究进展
任　蔷，陈　磊，王江新，张卫文*
(天津大学化工学院合成微生物学实验室，天津 300072)
摘　要：蓝细菌是一类能进行放氧光合作用的原核微生物，具有生长速度快、光合效率高、易于基因遗传
操作等特点。它们能够将捕获的光能和二氧化碳转化为生物能源分子，在解决当前社会面临的能源紧缺和
环境污染等问题上有着重要的理论和应用研究价值。近年来，随着合成生物学的迅猛发展，构建以蓝细菌
为底盘的“人工细胞工厂”用于合成各类生物能源和精细化学产品取得了令人瞩目的成绩。重点介绍了应
用合成生物学构建蓝细菌细胞合成工厂的研究进展，并对“光合自养型细胞工厂”面临的两大问题——产
物毒性问题以及细胞内氧化胁迫问题进行了重点讨论。
关键词：蓝细菌；细胞合成工厂；产物毒性；氧化胁迫
中图分类号：Q81；Q939.9 文献标志码：A
Constructing cyanobacterial cell factories via synthetic biology approaches
REN Qiang, CHEN Lei, WANG Jiang-Xin, ZHANG Wei-Wen*
(Laboratory of Synthetic Microbiology, School of Chemical Engineering & Technology,
Tianjin University, Tianjin 300072, China)
Abstract: Cyanobacteria, as photoautotrophic prokaryotes, possess the characteristics of fast growth, high
photosynthetic efficiency, relatively simple genetic background and easy gene manipulation. In addition, since they
can convert solar energy and CO2 into biofuel molecules, they have attracted significant attention in researches of
renewable fuels and green chemicals. In recent years, remarkable progress has been made in applying synthetic
biology techniques to construct cyanobacterial autographic cell factories for producing biofuels and fine chemicals.
Here, we summarized recent progress in constructing cyanobacterial cell factories via synthetic biology. Moreover,
tolerance to toxic products and cellular oxidative stress, the two important issues for the successful application of
cyanobacterial cell factories were critically discussed.
Key words: cyanobacteria; cell factories; toxicity; oxidative stress
收稿日期：2013-07-04
基金项目：国家重点基础研究发展计划 (“973”
项目) (2011CBA00803)；天津市国际科技合作项目
(12HZGJHZ01000)
*通信作者：E-mail: wwzhang8@tju.edu.cn；Tel: 022-
27406394
合成生物学作为 21世纪新兴的一门前沿学科，
旨在以工程学的思想为指导，从头设计并构建新的
生物元件装置和系统，或对现有的天然的生物系统
进行重新设计和改造，以实现各种重要的工业和医
药应用 [1-3]。目前，在合成生物学的新思想、新策
略的指引及新技术、新工具的支持下，人们在各种
模式微生物，如大肠杆菌和酵母菌的研究中积累了
丰富的经验和成熟的操作技术手段。例如，2003年，
加州大学伯克利分校 Jay Keasling教授研究组在大
肠杆菌中成功构建了青蒿素合成途径，使其生产成
本显著降低，并已投入工业生产 [4]；2009年，加州
大学洛杉矶分校 James Liao教授研究组通过改造酵
母细胞，将其氨基酸代谢中的碳源转而合成一系列
丁醇衍生物，迈出了合成生物能源的重要一步 [5]。
这些研究既加深了对生命系统运作机制的理解，也
大大提高了利用工程化的生物系统生产可再生能
源、合成精细化学品、制造新材料、改善环境等的
能力和效率。
任　蔷，等：应用合成生物学构建蓝细菌细胞工厂的研究进展第10期 953
蓝细菌具有两个重要的内在特质——光合作用
和易于基因改造，这使其成为良好的应用于合成生
物学的底盘生物。蓝细菌具有复杂的光合系统，能
吸收广泛波长的太阳光并将能量传递给其他能量载
体 [6]，而且光能利用率是陆生植物的 10倍，可达
到 10%以上，超过目前已知的任何工程菌株的能
量转化效率。蓝细菌可将光能和 CO2直接进行化学
品生产，避免了高成本的碳水化合物原料给工业生
产带来的经济问题。此外，蓝细菌营养要求简单，
仅需太阳光、CO2、水和少量无机离子即可进行生长。
同时，作为一种单细胞原核生物，蓝细菌还具有结
构简单、遗传背景清楚、便于遗传操作等特点 [7]，
部分蓝细菌含内源质粒，为构建适用于蓝细菌的外
源基因的表达提供了有利条件。近年来，蓝细菌分
子生物学和基因工程学得到了较快的发展，使其成
为研究光合作用、遗传改造、系统生物学和合成生
物学研究的重要模式微生物之一。
由于化石燃料的日益枯竭以及大量使用化
石燃料的环境后果日益受到关注，蓝细菌作为生
产可再生燃料和高附加值化学产品的“自养型人工
细胞工厂”也引起了社会的广泛关注，促进了相关
研究的升温。欧盟第六框架计划 (FP6)开展的
BioModularH2项目，旨在通过设计组建分子模块，
重新定向代谢流向，实现氢气能源的最大限度生产。
自 2007年以来，美国用于光合藻类生物燃料研究
与开发的投资超过 10亿美元 [8]。近期，我国“973
计划”在“十二五重大科学问题导向项目”(“973
计划”重大科学问题导向项目“人工合成细胞工厂”，
资助编号 2011CBA00800)中也专门立题针对光合
微生物的合成生物学研究。应用合成生物学策略，
精简光合蓝细菌基因组、解读基因组功能、协调工
程蓝细菌底盘代谢途径和外源引入的生物燃料合成
途径等研究，对进一步构建光合蓝细菌成为直接利
用 CO2的“自养型人工细胞工厂”将具有重要的价
值。同时，解决产物毒性以及细胞内氧化胁迫问题
也是进一步提高蓝细菌合成能力从而提高其工业应
用潜力的关键。以下针对应用合成生物学构建蓝细
菌细胞工厂的研究进展进行了系统的综述，并对“光
合细胞工厂”面临的两大问题，产物毒性问题以及
细胞内氧化胁迫问题进行详细的讨论。
1　基于蓝细菌底盘合成生物燃料和重要化学
产品
随着全球能源需求量的不断增加及环境问题的
日益突出，以石油为基础的工业生产日益受到石油
供给和价格的影响，因此，寻求一种绿色的可持续
发展的新能源成为各国科学家关注的焦点。近年来，
在利用工程光合蓝细菌生产各种生物燃料，如氢气、
乙醇、丁醇、丙酮、脂肪酸、类异戊二烯等方面，
研究者们已经做出诸多努力，这对开发新一代光合
能源微生物系统、解决生物质资源不足等问题具有
重要意义。
1.1　氢气
氢气燃料热值高，燃烧产物对环境不会产生任
何污染，是目前最清洁的能源。此外，其“零排放”
的特点也使它在汽车能源领域应用潜力巨大。天然
蓝细菌的产氢代谢途径有两条：一是固氮酶产氢，
另一种是双向氢化酶产氢。但自然生产途径面临许
多瓶颈问题 [9]：(1)产生的氢气易被细胞 (双向氢化
酶 )吸收；(2)固氮酶和 /或氢化酶具有较低的能源
效率和转化效率；(3)有活力的产氢酶数量有限；(4)
固氮酶和 /或氢化酶对氧气高度敏感；(5)氢化酶驱
动系统中 ATP的积累抑制电子传递；(6)光合系统
II(PSII)和光合系统 I (PSI)较大的天线系统降低量
子效应；(7)电子消耗路径与氢气合成酶途径竞争
电子。针对蓝细菌氢气产率低的问题，Baebprasert
等 [10]通过构建硝酸盐还原酶或 /和亚硝酸盐还原酶
的缺失突变菌株，解除了硝酸盐同化过程与氢化酶
产氢代谢途径对电子的竞争，有效提高了氢气的产
量。Ducat等 [11]将编码丙酮丁醇梭菌 Clostridium
acetobutylicum的 [FeFe]氢化酶 HydA基因引入蓝细
菌 Synechococcus elongatus PCC 7942基因组中，该
工程菌在厌氧条件下培养 45 min后，相比于内源
[NiFe]氢化酶的氢气释放速率，提高了 500倍以上。
此外，McNeely 等 [12] 通过敲除 Synechococcus sp.
PCC 7002的 ldhA基因，降低乳酸合成过程中 NADH
的消耗，细胞内 NADH/NAD+比例明显升高，也使
得氢气产量提高了 5倍。
1.2　生物乙醇
目前，生物乙醇主要通过农作物发酵进行生产，
但其大规模生产会对粮食供应和食品价格方面等
带来负面影响。因此，生物乙醇作为化石燃料的
替代品饱受争议。蓝细菌作为光合自养型微生物，
克服了传统能源作物的诸多缺点，如占用可耕种土
地、淡水消耗量大、营养要求高等，成为生产生物
乙醇的优势细胞工厂。早在 1999年，Deng等 [13]
将 Zymomonas mobilis丙酮酸脱羧酶基因 pdc和乙
醇脱氢酶 II基因 adh导入蓝细菌 Synechococcus sp.
生命科学 第25卷954
PCC 7942中，在内源启动子 PrbcLS的调控下进行表
达，基因改造后的蓝细菌乙醇产率达到 54 nmol/L/d。
Dexter等 [14]将相同的基因导入蓝细菌 Synchocystis
sp. PCC 6803，在光诱导启动子 PpsbAII的调控下，乙
醇产率达到 5.2 mmol/L/d。最近，中科院青岛生物
能源与过程研究所 Gao等 [15]筛选和表征了一系列
来源于不同蓝细菌的乙醇脱氢酶，并将其中催化性
质最佳的乙醇脱氢酶替换外源乙醇脱氢酶，避免了
乙醇合成过程中副产物乙醛的积累，同时提高了蓝
细菌乙醇产量。该团队还通过在蓝细菌基因组不同
位点分别引入外源丙酮酸脱羧酶基因与内源乙醇脱
氢酶基因 slr1192，实现了这两个关键酶在蓝细菌中
的高效表达，使得蓝细菌乙醇产量大幅提高 (培养
26 d后，乙醇产量 5.5 g/L，产率 212 mg/L/d)，这
一产量为目前文献报道的蓝细菌乙醇最高产量。
1.3　生物丁醇
丁醇与乙醇相比，具有更高的能量密度和更
低的吸湿性，更适合作为汽油代替品 [16]。2009年，
加州大学洛杉矶分校 James Liao教授研究小组通
过定向工程改造 S. elongatus PCC 7942代谢途径，
并过表达核酮糖 -1, 5-二磷酸羧化酶 /加氧酶
(Rubisco)，实现了从 CO2直接合成异丁醛和异丁醇，
产量分别达到 1 100 mg/L和 450 mg/L[17]。2011年，
该研究组将依赖于辅酶 A的 1-丁醇合成途径引入
蓝细菌 S. elongatus PCC 7942中，并异源表达了整
合到基因组的所有相关酶系，首次实现了在光合自
养微生物中进行 1-丁醇生产 [18]。最近，该研究组
在蓝细菌 Synechococcus中通过过表达乙酰乙酰辅
酶 A合酶 (NphT7)，构建了一条 ATP驱动的乙酰乙
酰辅酶 A生物代谢合成网络，同时过表达其下游的
1-丁醇合成途径，得到了 6.5 mg/L的 1-丁醇。研
究者还将糖乙酸多丁醇梭菌 Clostridium saccharoper-
butylacetonicum N1-4的丁醛脱氢酶 (Bldh)和大肠杆
菌 Escherichia coli的乙醇脱氢酶 (YqhD)分别引入
蓝细菌中，替代其内源的乙醛 /乙醇脱氢酶 (AdhE2)，
最终使得丁醇产量提高到 29.9 mg/L [19]。
1.4　丙酮
丙酮是重要的有机溶剂和工业原料，是一类具
有代表性的大宗石化产品。2010年 2月的世界石化
报告显示，全球每年的丙酮消耗量将近 670万吨。
目前，丙酮的生产方法还主要依赖于石化燃料，寻
求一种绿色的经济有效的新方法将为解决全球资源
和能源问题开辟一条新路。最近，中科院微生物研
究所 Zhou等 [20]向 Synechocystis sp. PCC 6803中分
别引入了乙酰乙酸脱羧酶基因 adc和辅酶 A转移酶
基因 ctfAB，同时定点敲除聚 -β-羟基丁酸酯 (poly-
β-hydroxybutyrate, PHB)合酶基因 phaCE和磷酸转
乙酰酶基因 pta，成功获得了产量为 36.0 mg/L的丙
酮。该研究首次在蓝细菌中创建了一条从 CO2生物
合成丙酮的新途径，这种新途径的设计思路以及模
块组装和优化方法，为利用 CO2生物合成更多大宗
石化产品提供了有利的参考价值。
1.5　脂肪酸
蓝细菌中富含脂肪酸，经提取后可以进一步通
过化学方法转化为其他工业产品，如生物柴油。
Liu等 [21]在蓝细菌细胞中引入了酰基载体蛋白硫
酯酶基因，并对该基因进行了遗传密码的优化，提
高了细胞内脂肪酸的积累浓度；他们还通过敲除
细胞表面蛋白基因 sll1951，减弱了肽聚糖的屏障作
用，促进了脂肪酸的分泌；同时通过降低脂肪酸合
成前体相关酶的反馈抑制作用，获得了脂肪酸的
高效生产，基因改造后的蓝细菌的脂肪酸最终分泌
产量达到 (197 ± 14) mg/L。为了减轻下游分离回收
工作的负担，该研究小组构建了“Green Recovery”
策略，使得脂肪酸最终分泌产量达到了 3.61 × 10−11
mg/细胞 [22]。
1.6　异戊二烯
异戊二烯是多种化合物的前体物质，主要用
于工业橡胶的合成。蓝细菌体内没有编码异戊二
烯合成酶 IspS的基因。Lindberg等 [23]将 Pueraria
montana (kudzu)异戊二烯合成酶 IspS的编码基因
转入 Synechocystis sp. PCC 6803体内，在光合作用
启动子 PpsbA2的调控下，实现了异戊二烯的合成，
产率约为 50 μg/g 干细胞 /d。
1.7　聚-β-羟基丁酸酯
聚 -β-羟基丁酸酯 (PHB)因其理化性质与传统
塑料相似且具有良好的降解性，越来越引起人们
的关注。Panda等 [24]通过改善蓝细菌的培养条件和
营养供应，提高了细胞对 PHB的积累量，达到细
胞干重的 29%。Tyo等 [25]运用反向代谢工程的方法，
鉴定出某些基因的敲除可以提高 PHB的积累量。
然而，PHB作为一种大分子聚合物，难以分泌到细
胞外，后续提取工作无疑会增加工业生产的负担。
为此，Wang等 [26]在蓝细菌内构建了 3-hydroxybutyrate
(3HB)的代谢合成途径，3HB是 PHB的单体物质，
无需过表达转运蛋白即可进行胞外分泌。此研究通
过定点敲除编码 PHB聚合酶基因 slr1829和 slr1830，
成功获得了产量为 533.4 mg/L的 3HB，为使用光合
任　蔷，等：应用合成生物学构建蓝细菌细胞工厂的研究进展第10期 955
微生物合成“绿色生物塑料”奠定了重要的基础。
与基于农作物的生产系统相比，工程化的蓝细
菌在生物燃料生产、化学品合成和 CO2利用方面有
着前所未有的优势。然而，为了让细胞工厂经济可
行，还需对蓝细菌产物耐受性和细胞内的氧化压力
方面作进一步的改进。
2　蓝细菌底盘对产物的耐受性
大多数生物能源物质都属于有机溶剂分子，过
量的积累会破坏细胞膜结构，增加膜的通透性，扰
乱膜蛋白功能，影响发酵产量。因此，改善底盘细
胞对产物的耐受性对于提高发酵产量进而实现工业
化生产有着重要意义。目前，关于微生物对有机溶
剂耐受的机制已经有过报道，包括细胞膜的调整、
热激蛋白的响应和外排泵系统的表达等 [27]。近年来，
针对蓝细菌对几种有机溶剂的耐受性研究也已取得
了一些重要的进展。
2.1　乙醇耐受性
利用光合蓝细菌生产乙醇已得到较快的发展，
从最初的 0.23 g/L[13]提高到 5.5 g/L[15]。但相对于工
业上采用的酵母菌来说，还处于一个相当低的水平，
究其原因，蓝细菌对乙醇浓度的敏感度就是一个重
要的限制因素。乙醇干扰细胞膜的屏障作用，影响
了细胞内正常的生理功能 [27]，例如 1.50% (v/v)的
乙醇便会使蓝细菌细胞生长减缓 50% (24 h)[28]。
近年来，在改善工程菌株 (如酵母菌 )对乙
醇耐受性方面，研究者们已做出很多努力。Teixeira
等 [29]在酵母中过表达了多抗药性 ABC转运蛋白
Pdr18p基因，提高了其对乙醇的耐受性。Alper
等 [30]使用全局转录工程 (global transcription machine
engineering, gTME)方法，对酵母菌 Saccharomyces
cerevisiae中关键的转录因子 Spt15p进行成功改造，
突变体的乙醇耐受性显著提高。目前，针对蓝细菌
对乙醇耐受性的研究还十分有限。近期，天津大学
合成微生物学实验室Wang等 [28]探究了 Synechocystis
sp. PCC 6803对乙醇的耐受性机理，研究表明菌株
细胞利用多种方法抵抗乙醇胁迫，包括热激蛋白的
响应、转运蛋白的表达、细胞膜蛋白的调整、聚羟
基脂肪酸的积累。此外，乙二醛酶和光合作用相关
酶也可能参与乙醇毒性的耐受。同时，信号转导蛋
白在抵抗乙醇毒性的过程中也可能发挥着重要的作
用。该小组通过基因敲除方法，初步鉴定了一系列
与乙醇耐受性相关的基因，为我们揭示了与乙醇耐
受性相关的潜在基因靶点，这为后续的改造工作提
供了理论基础。
2.2　丁醇耐受性
高浓度的丁醇严重破坏细胞质膜的结构，干扰
细胞膜的正常生理功能。在丁醇的生产中，菌株对
丁醇的耐受能力是影响丁醇产量的限制性因素。为
了提高菌株的耐受性，Borden等 [31]在丙酮丁醇梭
菌中过表达了 2个丁醇耐受性相关基因，重组后的
菌株对丁醇的耐受性分别提高了 13%和 81%。
Tomas等 [32]在丙酮丁醇梭菌中过表达编码热激蛋
白的 groESL基因，使丁醇对菌体细胞的抑制作用
降低了 85%。Winkler等 [33]运用原生质体融合技术，
获得了可以耐受 2%丁醇的大肠杆菌杂交体。近年
来，丁醇丙酮梭菌和大肠杆菌对丁醇耐受机理已得
到广泛地研究，但对蓝细菌丁醇耐受性的研究却十
分有限。为此，天津大学合成微生物学实验室 Tian
等 [34]利用 iTRAQ-LC-MS/MS技术对丁醇处理的
Synechocystis sp. PCC 6803细胞进行分析，共鉴定
了 303个差异表达的蛋白，通过注释和 GO富集分
析表明，蓝细菌细胞在对抗丁醇毒性时作出一系列
的应答反应，如热激蛋白的响应、转运蛋白的表达、
脂肪酸的合成和细胞膜的调整。此外，一些与氧化
胁迫相关的基因也参与了对丁醇毒性的抵抗。该研
究揭示的一系列丁醇抗性相关的潜在靶点，成为将
来改造蓝细菌以提高丁醇抗性的重要依据。
2.3　烷烃耐受性
Kämäräinen等 [35]对一些异源合成的醛类、酸
类和醇类分别作了毒性分析，发现烷烃对蓝细菌
细胞的毒性最低，有望成为能源代谢终产物的最
佳选择。为了构建强健的、对烷烃具有高耐受能
力的蓝细菌宿主细胞，天津大学合成微生物学实验
室 Liu等 [36]选择 Synechocystis sp. PCC 6803为模式
菌株，探究其对己烷的耐受性机理。该研究组利
用 iTRAQ-LC-MS/MS技术，鉴定到 1 492个独特的
蛋白，覆盖了 Synechocystis全基因组预测蛋白的
42%，其中 164个和 77个蛋白表达量分别上调和
下调；功能注释和 KEGG通路分析表明，大量转运
蛋白、膜结合蛋白、抗氧化胁迫蛋白、硫传递系统
和光合作用相关蛋白都被诱导，作为细胞抵抗己烷
的主要防御措施。
综合目前的研究进展来看，这些研究初步阐明
了蓝细菌对产物 (如乙醇、丁醇和己烷 )毒性的分
子耐受机制，并提供了一系列潜在的基因 /蛋白靶
点，将来的工作应将重点放在如何针对这些靶点，
利用工程策略改造蓝细菌。
生命科学 第25卷956
3　克服蓝细菌细胞内的氧化胁迫
蓝细菌是一类能进行放氧光合作用的微生物，
在光合作用过程中，光系统 II(PSII)利用光能将水
裂解并释放出大量的氧气，氧气的存在影响了氧敏
感酶的表达。例如，氢气合成过程中所需的 [NiFe]
氢化酶或 [FeFe] 氢化酶对氧气都有较低的耐受
性 [37]；而且催化 N2转化为 NH4
+的固氮酶对氧气
也极度敏感 [38]。从更广泛的应用前景来说，这种氧
气敏感问题可能成为厌氧微生物的大量代谢途径能
否在蓝细菌细胞内成功表达的关键。例如，前面所
述的 1-丁醇合成途径在蓝细菌中表达就是一个挑
战。目前，已经从自然界中筛选出对氧耐受的酶，
如来源于 Ralstonia eutropha H16[39]和Hydrogenovibrio
marinus[40]的氢化酶。Dementin等 [41]通过对Desulfovibrio
fructosovorans氢化酶定点突变，成功提高了该酶对
氧气的耐受能力。此外，将有氧光合反应和氢气合
成途径暂时分隔开不失为一种可取的方法。自然界
中，许多蓝细菌都已经进化了一种机制：白天进行
光合固碳反应，夜间进行厌氧固氮反应 [38]。而且，
采用空间划分的方法，将氢化酶固定到某些有利的
空间 (例如在异形胞中表达 )，也可有效地避免氧
胁迫 [38]。最近，一项有关微生物的微区 (microcom-
partments, MCPs)装配为我们提供了另一种解决方
法，它可将互不兼容的需氧反应和厌氧反应进行空
间上隔离 [42-44]。同时，Mehler反应也已被应用到克
服氧化胁迫的研究中 [45-46]，例如在 N2固定过程中，
Mehler反应会消耗细胞内约 75%的氧气，使氧气
浓度维持在一个较低的水平 [47-48]。Mehler反应还会
消耗大量的还原剂 [46]，对维持氧敏感酶的活性有重
要的作用。
4　展望
光合蓝细菌具有一系列的优秀特质，包括相对
简单的遗传背景、营养要求简单、生长迅速等，同
时可将捕获的光能和二氧化碳直接转化为生物化学
品，成为生产可再生替代能源和精细化学产品的新
型底盘生物。近年来，构建基于蓝细菌细胞的人工
细胞工厂的研究已取得令人鼓舞的进展，实现了多
种重要产品在蓝细菌细胞工厂中的合成。然而，为
了进一步提高合成的效率以及经济可行性，还需要
在提高蓝细菌产物耐受性、克服蓝细菌细胞内氧化
胁迫等方面作进一步的努力。相信在不久的将来，
随着功能基因组学和合成生物学相关技术的发展和
日益完善以及应用，对蓝细菌底盘细胞性能的不
断优化，以蓝细菌为底盘的“自养型人工细胞工厂”
将不仅仅局限于实验室的基础性研究，而是生物燃
料和精细工业品的工业化大规模生产的重要方式。
[参　考　文　献]
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