全 文 ：第6卷第3期
2008年5月
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
May2008
· 17·
响应面法优化枯草芽孢杆菌产T-PGA的条件
范洪臣1，李艳华2，梁金钟2，王立群1
(1．东北农业大学 生命科学学院，哈尔滨150030；2．哈尔滨商业大学食品工程学院，哈尔滨150076)
摘要：对枯草芽孢杆菌液体发酵产7一聚谷氨酸[7一poly(Stutamicacid)，7一PGA]条件进行了优化。首先采用单因
子实验筛选出最适碳源为玉米糖化液，氮源为蛋白胨和谷氨酸钠，无机盐为KH：P0．，MgCl，MnCh和NaCl。在此基
础上，利用Plackett．Burman设计对影响产量的12个因素进行评价，筛选出具有显著效应的因素蛋白胨、谷氨酸钠
和NaCI。用最陡爬坡路径逼近最大产y-PGA区域后，利用响应面中心组合设计对显著因素进行优化，得出蛋白
胨、谷氨酸钠和NaCI的最佳质量分数分别为0．54％，8．13％和0．96％。优化后液体发酵液7．PGA产量提高到
29．00吕／L，比初始y-PGA产量14．10g／L提高了2倍。
关键词：枯草芽孢杆菌；7一聚谷氨酸；响应面法；优化
中图分类号：Q815 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2008)03—0017一cr7
Optimizationof9,-PGAfermentationconditionw thBacillussubtilis
byresponsesurfacemethodology
FANHong．thenl，LIYan．hua2，LIANGJin．zhon92,WANGLi．qunl
(1．NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，China；2．HaerbinUniversityofCommerce，Harbin150076，China)
Abstract：Theferm ntationconditionof7一poly(glutamicacid)(y·PGA)byBacillussubtiliswagopti—
mized．Usinginglefactorialexperiments，sourcesofcarbon，nitrogenandinorganicionsweredeter-
mined鹊cornfloursaccharificationliquor，peptone，glutamate，KH2P04，MgCl2，MnCl2，andNaCl．
Threesignificantfactors，peptone，glutamateandNaCl，werescr enedbyPlackett—Burmandesig ．The
optimalregionof7·PGAproductionWagfoundbysteepestascentapproach．Theoptimalcombinedcon-
centrationformaximumy-PGAproductionWagdeterminedbyr sponsesurfacemethodology8S：0．54％
Peptone，8．13％Glutamateand0．96％NaCl．TheproductionlevelWasincreaseto14．10g／L．
Keywords：Bacillussubtilis；y—polyglutamicacid；responsesurfacem thodology；optimization
y一聚谷氨酸[y—poly(glutamicacid)，7一PGA]是
由微生物合成的一种细胞外高分子。它是一种水溶
性的酰胺化合物，可以通过芽孢杆菌的变种来生产，
这种阴离子物质是由L型谷氨酸或D型谷氨酸单体
之间通过Ot氨基和y羧基形成肽键之后生成的同聚
酰胺。7-PGA具有极佳的成膜性、成纤维性、阻氧性、
可塑性、黏绪眭、保湿性和可生物降解等独特的理化
和生物学特性，是一种对人体和环境无毒害的生物
相溶性新型天然高分子⋯，可应用在工农业及其他行
业领域。目前y—PGA生产主要使用枯草芽孢杆菌和
地衣芽孢杆菌碳源为蔗糖、葡萄糖、柠檬酸和甘油，且
大多为谷氨酸依赖型，由于成本过高的限制，这一技
收稿日期：2007．10．It
基金项目：黑龙江省“十一五”重大科技攻关责助项目(GA061M01)
作者简介：范洪臣(1978一)，男，黑龙江哈尔滨人。硕士研究生，研究方向：应用微生物。
联系人：王立群，教授，E·mail：lj,20so@126．eom
万方数据
· 18· 生物加工过程 第6卷第3期
术只停留在实验室水平。针对这些特点，我们筛选获
得的一株产7一PGA的枯草芽孢杆菌，拟通过优化发
酵条件进一步提高该菌y-PGA的产量，为y-PGA的
工业化生产提供方法和数据。
1材料与方法
1．1材料
1．1．1菌种
枯草芽孢杆菌B一115(BacillussubtilisB—l15)。
1．1．2培养基
种子培养基：质量分数1％蛋白胨、质量分数
0．5％NaCI、质量分数0．3％牛肉膏，质量分数2％琼
脂粉，pH7．0。
初始发酵培养基：质量分数6％玉米糖化液、质
量分数1％蛋白胨、质量分数5％谷氨酸钠、质量分
数0．1％KH2PO。、质量分数0．05％MgS04。
1．2方法
1．2．1糖化液的制备
糖化液的制备过程为：配料_÷液化_÷糖化叶过
滤-+灭酶。
液化时，pH6．0—6．5，85℃，40min，a-淀粉酶
质量分数0．5％，淀粉浆质量分数30％；糖化时，pH
4．2～4．5，60℃，4h 糖化酶质量分数0．6％，糖化
液还原糖可达No．22g／mL。
1．2．2还原糖的测定
还原糖的测定按GB／TS009．7—2003进行。
1．2．3发酵培养
将活化后的种子培养液接种至发酵培养基中，
37℃，150r／min摇床培养48h。
1．2．4y—PGA测定方法
7一PGA的测定方法按重量法进行[2】。
2 结 果
2．1 碳源、氦源及无机盐对产Y—PGA的影响
2．1．1碳源的影响
改变初始碳源的种类，分别以玉米糖化液、可
溶性玉米淀粉、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖作为碳源进行
实验，结果如图1所示。
由图1可见，在供试的5种碳源中可得出玉米
糖化液产量达到14．01g／L，最低为葡萄糖，所以选
择玉米糖化液为最佳碳源。由图l所示，玉米糖化
液质量分数在6％时，Y．PGA的产量最大，所以选择
质量分数6％的玉米糖化液为最佳碳源。
2．1．2氮源的影响
以玉米糖化液为碳源，分别以硫酸铵、氯化铵、
酵母膏、蛋白胨4种无机和有机的氮源进行实验，结
果如图2所示。
16
14
，12
÷10
掌8
璎6
4
2
O 2 4 6 8 lO 12
w／％
—·一玉米糖化液一可溶性淀粉——一葡萄糖———一蔗糖—一a一麦芽糖
图1碳源对产y-PGA的影响
Fig．1Effectofvariouscaxbon瓢mI℃e8ony—PGAproduction
16
14
12
■10
掌8
理6
4
2
O 2 4 6 8 lO 12 14
p／(10-39。mL-1、
+蛋白胨——一酵母膏 +氯化铵——一硫酸铵
图2氮源对产y·PGA的影响
Fig．2Effectdvariousnitrogen80t1113e8ony-PGAplⅨhlction
由图2可以得出加蛋白胨组7一PGA产量最大，
加无机盐硫酸铵和氯化铵组Y-PGA产量很少，因此
选择蛋白胨为最适氮源。以蛋白胨为氮源其质量浓
度4×10一一1．2×10’2s／mL的范围内Y—PGA产量
为13—14g／L，当质量浓度超过这一范围时产量
下降。
2．1．3谷氨酸钠对产7．PGA的影响
Y．PGA是由微生物通过谷氨酸聚合酶合成的，
谷氨酸是其合成的前体物质旧】。由此考察基础发
酵培养基中不同质量浓度的谷氨酸钠对菌株合成
y—PGA的影响，结果如图3所示。
万方数据
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25
20
÷15
删10
{L
5
图3结果表明，在基本发酵培养基中添加谷氨
酸钠对7一PGA的合成是完全必要的，在没有添加谷
氨酸钠的培养基中，y-PGA产量为0；而添加谷氨酸
钠对y．PGA的合成具有明显的促进作用，添加量越
多，y-PGA合成越多。最终添加到80g／L时，7一PGA
产量最高达到18．36g／L。在继续增加产量降低，谷
氨酸钠质量浓度太大起到了抑制作用。
2．1．4无机盐的影响
以玉米糖化液为碳源，蛋白胨为氮源，谷氨酸
钠为前体物，分别以质量分数为0．5％KH：PO。、
0．5％NaCl、0．5％CaCl2、0．5％MgS04、0．001％
FeCl，、0．001％ZnCl2和0．001％MnCl2作为无机盐进
行实验，结果如图4所示。
14
12
，10
÷8
∞
面6
{L4
2
由图4可知KH2P04、MgSO。、NaCl的加入
y-PGA的产量相对较高，而FeCl3的加入y—PGA产
量为0，选用KH2PO。，MgS04，NaCl为单一无机盐加
入所得y—PGA相差无几，考虑复合无机盐进行下一
步优化。
2．2 Plackett—Burman设计筛选影响液体发酵的显著
因素”1
影响枯草芽孢杆菌液体发酵产7一PGA的可能
因素包括玉米糖化液、蛋白胨、谷氨酸钠、KH：PO。、
MgSO。、NaCl，培养基起始的pH、摇床转速、发酵温
度、发酵时间、装液量、接种量等，对这12个因素进
行全面考察，选用N=16的Plackett．Burman设计，
并设4个空白作为误差分析项。每个因素取高
(+1)低(一1)2个水平。运用SAS6．12软件分析
计算各因素的效应值，并对各因素效应进行t检验，
选择置信度较高的因素作为显著因素进一步实验。
Plackett—Burman设计及实验所测得的y—PGA
产量见表l，各因素所代表的参数、水平及因素效应
见表2。
2．3 响应面因素水平的中心点的确定
响应面拟合方程在考察的紧接邻域里才近似
真实情形，所以，要先逼近最大产7．PGA区域后才
能建立有效的响应面拟合方程。最陡爬坡法以实
验值的变化方向为爬坡的方向，根据各因素效应值
的大小确定变化步长，能最快地逼近最大产y—PGA
区域。由表2可知，对液体发酵产y．PGA有显著影
响的因素有谷氨酸钠、蛋白胨、和NaCl。其中谷氨
酸钠和NaCl对产量有正效应，蛋白胨有负效应。要
提高Y—PGA的产量应当适当提高谷氨酸钠和NaCl
的质量分数，降低蛋白胨的质量分数。其他因素影
响不显著可维持在低水平。在最陡爬坡实验中，由
于谷氨酸钠质量分数对7-PGA产量的影响最大，因
此，以谷氨酸钠质量分数作为标准，按照蛋白胨递
减作为基本变化值。采用3因素质量分数同时变化
进行最优化搜索，随机性太大，通过设计合理的步
长，增加实验的密集度，逼近产7一PGA的最大区域，
以减小对因素变化带来的弊端，所以谷氨酸钠、蛋
白胨和NaCl三者质量分数的步长依次取0．15、
一0．05、0．05。最陡爬坡实验设计及实验测得的
7一PGA产量结果见表3。
由表3可知最大产7·PGA区在第10次实验附
近，故以实验10的条件为响应面实验因素水平的中
心点，响应面实验因素水平见表4。
2．4显著因素的最优水平的确定
以最大产量区进行响应面中心组和实验设计，3
因素5水平的响应面中心组和实验设计及实验测得
产量结果见表5。
2．4．1回归模型的建立及置信度分析
由minitab软件拟合的方程为以戈)=28．5731+
2．4691x4+0．9008xlo一0．0212戈5—3．382lx4戈4—
3．6916xlo石10一2．387lx5茹5—0．8402x4茗Io一0．9148·
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·20· 生物加工过程 第6卷第3期
标号 因素
水平 显著性检验—— 效应——
低(一1) 高(+1)t值Pr>It
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表3最陡爬坡实验设计及结果
Table3 Experimentaldesignofsteepestascent
andcorrespondingresults
表4响应面中心组合设计的因素及水平
Table4 Factorsandlevelsofresponsesurface
centralcompositedesign
表5 响应面中心组和实验设计及结果
Table5 Responsesurfacecentralcompositedesign
andcorrespondingresults
表6回归模型系数估计
Table6 Thestimatedcoefficientregressionmodel
表7回归模型方差分析
Table7 AnalysisofvarianceforY
方差来源DF SeqSS AdjSS AdjM$ F P
Regression 9 84．7243 84．7243 9．4138 40．98 0
Linear 3 34．6886 33．4075 11．1358 48．48 0
Square 3 47．7688 47．7688 15．9229 69．32 0
Interaction 3 2．2669 2．2669 0．7556 3．29 0．067
ResidualError 10 2．2972 2．2972 0．2297
Lack．of．Fit 5 1．3660 1．3660 0．2732 1．47 0．342
PureError 5 0．931l 0．931 0．1862
Total 19 87．0215
R2 97．4％
万方数据
·22· 生物加工过程 第6卷第3期
由表6、表7可知，交互项的系数和均方差较
小，说明响应面分析所选的3个因素之间交互效应
较小。在仅=0．01水平上，该模型失拟不显著，回
归高度显著。决定系数R2=97．4％，表明97．4％
的变化可由此模型解释，因此可用上述模型代替真
实实验点对7一PGA发酵进行分析和预测。
2．4．2显著因素水平的优化
运用SAS对回归方程进行分析，结合图5—7
三维响应面图和等高线图可求出该方程的最大产
量的稳定点及对应的因素水平为茹。=8．13，龙，=
0．54，石，o=0．96即谷氨酸钠的质量分数为8．13％，
蛋白胨质量分数为0．54％，氯化钠的质量分数为
0．96％，最大产量为29．06g／L。而实际产量为
29．00g／L，进一步说明该模型能够很好地预测实际
发酵情况。
优化后发酵生产7一PGA最佳培养基组成为：质
量分数0．96％氯化钠，质量分数6％玉米糖化液、质
量分数0．54％蛋白胨、质量分数8．13％谷氨酸钠、
质量分数0．1％KH2P04、质量分数0．05％MgS04，
pH自然，培养温度37℃，摇床转速150r／min，接种
量1％，培养48h。
一30
· 25
警
蛔20
k
注："(氯化钠)=Q95％
图5谷氨酸钠和蛋白胨产T-PGA产量的响应图和等高线图
Fig．5Surfae．eandcontourplotsfortheffectspeptone
VsglutamateonPGAproduction
S27．5
k25．0
谪22．5
{L20．0
注："(谷氨酸钠)=＆1％
图6氯化钠和蛋白胨产Y-PGA产量的响应图和等高线图
Fig．6SurfacendcontourplotsfortheffectsNaCIvs
peptoneonPGAproduction
327．5
k25．0
面22．5
钆20．0
注：∞(蛋白胨)=Q5518％
图7氯化钠和谷氨酸钠产y-PGA产量的响应图和等高线图
Fig．7SurfacendcontourplotsfortheffectsNaC]
v8glutamateonPGAproduction
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2008年5月 范洪臣等：响应面法优化枯草芽孢杆菌产y-PGA的条件 ·23·
3讨论
对7一PGA培养条件优化进行了研究，对降低y-
PGA生产成本用玉米糖化液作为基本碳源，进行了
初步探索，在直接利用玉米原料生产7一PGA方面得
到了一些有意义的结果。y．PGA的最高产量达到
了29．00g／L，与一些利用Bacillussubtilis菌株以甘
油、柠檬酸生产y-PGA"1相比在产量和成本上有一
定的优势。若实现y—PGA工业化生产，必须以降低
生产成本为研究重点，应在如下方面开展进一步研
究：采用诱变育种、基因工程和代谢工程的方法，进
一步提高y-PGA生产能力；寻找廉价氮源替代发酵
培养基中的谷氨酸钠；在发酵液中，由于y—PGA分
子的高粘度特性，给分离提纯带来一定的困难，研
究开发高效的7-PGA分离技术也将是本课题今后
研究的重点。
参考文献：
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[D]．北京：中国农业大学，2005．
2008年4月18日，以“迎接可持续发展的生物经济时代”为主题的中国工业生物技术发展高峰论坛在
天津举行。论坛由中国科学院生命科学与生物技术局、科技部中国生物技术发展中心、天津市科委和中国
生物工程学会共同主办。来自中国、美国、日本等海内外70多家企业、高校、科研院所的学者和代表共400
余人参加了此次会议。
中国是一个石化能源严重短缺的国家，煤炭、油气资源十分有限，资源匮乏、能源短缺和环境污染日趋
恶化等现实问题，已成为社会可持续发展的巨大障碍。工业生物技术作为生物经济发展的支柱，其应用将
促进生物能源、大宗化学品与生物材料等生物质产品工程的发展，是一条通往绿色生态的现代化之路。
中国科学院院士欧阳平凯预计，未来20a内，生物能源、生物材料和生物质资源化技术将得到实际应
用，2020年工业生物技术在中国GDP中的贡献将达到2．2万亿元。
中国科学院副院长李家洋院士也认为，中国工业生物技术有良好的基础，近些年发展也比较快，是可能
实现跨越式发展的高新技术领域之一。基于微生物和酶的工业生物技术具有生物安全相对较好、研发投人
较少、周期较短的优势，且中国已形成良好的产业基础，是参与生物技术国际竞争的～个良好的机遇和难得
的切入点，应成为中国生物技术应用研究的一个战略重点。
(张春鹏)
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