全 文 ：Nov．2007
·32·
生物加工过程
ChineseJou皿alofBioprocessEn矛nee^“g
第5卷第4期
2007年11月
嗜热菌Boc川Ms如一ii3—2海因酶的纯化及性质
孙倩倩，潘瑶，姚忠；何冰芳
(南京工业大学制药与生命科学学院，南京210009)
摘要：对自行筛选的海固酶法厶苯丙氨酸生产茵株B钟埘附如商i3_2中的海因酶进行了分离纯化厦相关性质研究。
该海因酶协同}氨甲酰水解酶是海固酶法生产厶氨基酸的关键酶。最知戚i30茵悬液经压力破碎离心后取上清液
为粗酶液，粗酶液通过硫酸铵分级沉淀、P岫ylFT(h讪sub)疏水层析以厦soIlIce15Q离子交换层析，经sDs-PAGE
分析达到电泳纯，亚基相对分子质量为55×10’，海因酶的纯化回收率为2n5％．纯化倍数为149．23。该海因酶在pH
8．0—1n0的范围内具有较高的活性，在45—70℃具有很高的酶活力，最适反应pH和温度分别为10．0℃和65℃。
纯酶易氧化失活，哪对谅酶有一定的保护作用。二价金属离子。M一+、c02+及Fen对酶活性有显著的促进作用。而
caz+、cu“等时酶活性有押制作用。相关研究可为谊菌株茂海因酶的进一步开发与应用提供理论指导。
关键词：海固酶；觑珊瑚知栅f3．2；纯化；酶学一雎质
中图分类号：Q55 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2007)04—0032—05
PurmcationandcharacterizationoflIydaIItoinase
fromthermophilus曰口c溉博扣r颤3_2
SUNQian—qian，PANYao，YA0zhong，HEBing—fang
(cou。geof“fescien∞曲dPh唧aceudcalErIginee五“g，N舯jingurIiver吕ityoflkhnology，N蚰jitlg210009．ch；m)
Abstract：卟epud丘c“on卸dpropeniesofbyd蚰toinase‰m￡一phenylalaJlin6pmducer砒d盯瑚扣戚i3-
2 ofhydantoina鸵processwe陀studied．HydantoinaseBnd￡一ca小锄oyla鸵arebo山k ybiocatalyst8inthe
production0fthe叩ticallypure￡-amjnoacids．Hydalltoin8se舶mB们 髓出加趟i3-2waspu一6edtohom-
ogeneityby哪moniumsuⅡ乱efjactionation，PhenylFF( ighsub)hydmphobicinteractionhromatogra-
phy明dS0urce15Qionexcha“gechmmatography埘thayieldof20．5％粕d149．23一foldpuri6c“on．
Theh培hacⅡ“ties0fhydantoinasewereshowedinthe砌geofpH8．0—10．O蚰dattIletempemIIl他0f
45—70qc．1heoplimalreac石ontemperaturendpHwe肥65℃and10．0，respecnvely．卟es“pplement
0f明厂rw曲helpfult0tllestabili髓tionofpurehydanfoina的．Hyd加toina8eac廿V时w嬲si印i6cantlyen-
hancedbyMn2+，Co¨andFe2+，andiIllljbitedyca2+alldcu“．nisstudywillprovidet}Ieorybasi8
fortlledevel叩ment0fthehydantoin明eof曰．扣rd豇3-2．
Keywords：hydantoin曲8；B衄i池s扣趟i3-2；puri6catio“；e“zymecharacterization
海因酶催化水解现．5’诹代海因的内酰胺键
生成D．型或￡-型Ⅳ-氨甲酰基一氨基酸，后者在由Ⅳ-
氨甲酰水解酶催化生成D-氨基酸或L．氨基酸。海
因酶法是继发酵法之后的重要氨基酸工业制备方
收稿日期：2006-12-18
基金项目：国家973膏助嘎目(2∞3cB716004)；国掌自然科学基仝膏助项目(20336010)
作者简介：孙倚侪(1980一)，士，江苏镇江人．项士研究生．研究方向：生轴化工。
联系人：何水芳，教授，博士生旱师，E-Ⅱl丑il．b；n出ngIle@njut．幽．叩
万方数据
万方数据
·34· 生物加工过程 第5卷第4期
酶活测定方法：取含O．2％苄基海因的T^9一Hcl
缓冲液(pH9．0)2mL，加人1mL酶液，45℃反应
10min，加12％三氯乙酸lmL终止反应，离心去变
性蛋白，取2mL反应液上清液，加2mLPDAB，在
438nm处测吸光值并根据标准曲线计算酶活(Ⅳ-氨
甲酰￡一氨基酸标准曲线：c=0．03072+0．55446
O见。)，以零时刻的酶反应液做空白。酶活定义：每
分钟转化生成1“molⅣ一氨甲酰氨基酸所需酶量为
一个酶单位(u)。比活力为1mg蛋白的海因酶活
力(U／mg)。
1．5．2蛋白质含量测定
蛋白质含量测定按照Bradford检测法“⋯，标准
蛋白为牛血清白蛋白。
聚丙烯酰胺凝胶电泳按文献[20]方法进行。
2结果与讨论
2．1纯化结果
海因酶粗酶液经过硫酸铵分级沉淀(取40％一
60％饱和度)、疏水层析(PhenylFF)、murce15Q强
阴离子交换层析3步纯化步骤获得了电泳纯海因酶
(见图1)，由电泳图推测该海因酶的亚基相对分子
质量约5．5×104。该酶经3步纯化，比酶活为38．8
U／mg，纯化倍数为149．23，回收率约为20．5％(见
表1)。文献报道的海冈酶回收率一般在9％～50％
之间”。]。该纯化工艺较为简单，回收率较高。
表l海园酶纯化总表
Table1 Aeu唧“ry0fhydantonina瞬Pu一矗∞由n
总酶 总蛋 比活 收卓／纯化
活／u 白／mg力／u·mgq％倍数
CⅢdentⅢt422841600 026 100 1．00
(NH4)2s04沉淀39685 497．10080 938 3．07
PhenvlFF
Q15
158．8691．30l 74 37．66．69
8649 2．23 8蚰 20．5149．23
2．2海因酶酶学性质研究
2．2．1pH对酶活的影响
在不同的pH缓冲液中以DL．苄基海因作为底
物测定酶活力见图2。图2表明且如r洲3．2在pH
8．0一lO．O的范围内具有较高的活性，最适pH为
10．0。pH对海因酶催化的影响除直接影响酶结构
与解离外，还影响底物的有效浓度，在碱性条件下，
底物D￡．苄基海因的消旋加快，有效浓度提高，一般
文献报道的海因酶最适pH基本在7．5—8．5之
间‘9“驯。本研究的口．如rd“3-2海因酶最适pH更
高，利用了底物在反应过程中的消旋转化。
l—prokmMarke‘；2—{hcti∞fmm洲砌umBulphakp弛clpi州-
“；3——fmd∞hⅫPIIenyIFF；4—hclionfmmsmlm15Q
图1 纯化海因酶sDs-PAGE(12％)电泳
Fig．1AsDs—PAGE【12％)0fthepu曲edhydanki哪e
亭
●
呈
蝗
避
55 60丘5707580859_o95 10．010511．0
DH
图2 PH对酶活的影响
Fjg．2E盯ect0fpHvdueonhydantoinaseacjti“ty
2．2．2温度对酶活的影响
不同的反应温度对B．扣也3-2海因酶活性的
影响见图3，该海因酶在45—70℃之间具有较高的
酶活，最适酶活为65℃。显示了较高的耐热性，接
近于文献报道的胍iⅡm来源的海因酶。而其他如
^n^r06毗r㈨”1或风e以or∞，Ⅻ㈣来源的海因酶最
适温度较低。本研究中海因酶来源于嗜热菌曰．如r-
以￡，最适生长温度45℃，这可能是该酶具有较高耐
热性的重要原因之一。
"加“印”如¨帅”如拍如“m：兮∞
万方数据
万方数据
万方数据