全 文 ：海因酶热稳定性及底物特异性研究进展
梅艳珍，何冰芳，欧阳平凯!
（南京工业大学 制药与生命科学学院，南京 !"###$） 摘 要：海因酶是在微生物中广泛分布的能水解 %&取代海因衍生物制备光学纯氨基酸的关键生物催化剂，在各种 氨基酸的酶法生产中具有良好的应用前景。着重概述了海因酶的热稳定性、底物特异性研究及应用，并讨论了其 发展方向。 关键词：海因酶；热稳定性；底物特异性 中图分类号：’%% 文献标识码：( 文章编号：")*! + ,)*-（!##%）#, + ##!. + #% !"#$"%&& ’( &)*+, #( )-%".#&)/0’1’), /(+ &*0&)"/)% &2%3’4’3’), #4 -,+/()#’(/&%
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近十年来，光学纯氨基酸在医药、食品、农药等
方面的广泛应用，引起了越来越多的兴趣［"］。利用
海因酶生物转化法进行光学纯氨基酸的不对称合成
成为新的研究热点，不仅是生产制备 F&氨基酸的极
好补充，也为生产制备 R&氨基酸提供了一条可行性
路线。生物催化剂的区域立体选择性强、操作简单、
成本较低、公害少，且能完成一些化学合成难以进行
的反应。此领域受到微生物学家、有机化学家和药
物化学家的极大重视［!］。在海因酶法制备 F&色氨
酸、F&蛋氨酸、R&苯丙氨酸等氨基酸的研究方面取得
了较好的进展［, X %］，尤其是已成功实现了 R&对羟基
苯甘氨酸等非天然氨基酸的工业化生产［)］。
如图 " 所示，海因酶法制备光学纯氨基酸通常
有两种途径：其一，利用一菌双酶法，即海因酶和 ?&
氨甲酰水解酶联合使用；其二，单酶与化学偶联法，
即海因酶水解 %&取代海因后用化学方法如亚硝酸盐
法或热解法使 ?&氨甲酰氨基酸脱氨甲酰。RF&%&单
取代海因是该酶学方法的原料，酮式和烯醇式的互
变异构是海因结构的一个典型特征。在中性条件
下，酮式占优，而在弱碱性溶液中则在 . 位和 % 位之
间发生烯醇化，这一特征具有的实用价值是，不需要
通过化学消旋化步骤，即可将消旋的 %&单取代海因
转化为中间体 ?&氨甲酰氨基酸，此中间体进一步被
氨甲酰水解酶转化为 R&氨基酸或 F&氨基酸。由于
海因类衍生物的溶解度较低，提高温度不仅可增加
底物的溶解度，同时可促进 %&单取代海因的消旋，故
! 收稿日期：!##%&#*&!*
基金项目：国家 $*, 项目（!##,C9*")###） 作者简介：梅艳珍（"$*-&），女，博士研究生，研究方向：应用微生物。
联系人：何冰芳，0&K3:E：T:4;<34;67Y 4MSP Z 7IS Z H4，Q7E：#!%&-,%-*,,)
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生 物 加 工 过 程
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第 , 卷第 , 期
!##% 年 - 月
万方数据
热稳定性海因酶的应用研究在工业上日益受到重
视［!，"］，本论文重点介绍海因酶热稳定性、海因酶的
底物特异性及应用前景。
图 # 海因酶法制备光学纯氨基酸的催化反应过程
$%& ’# ()*+,%-./ %.0-10)2 %. ,3) 342*.,-%.*/) 56-+)//
! 海因酶的热稳定性
#’# 海因酶在微生物种群中的分布及其产生菌的筛选
早在 #7"8年，9*:*2* 等人［8］设计筛选培养基以
;<=>=甲硫乙基海因为诱导剂，从细菌、放线菌、酵母
菌中等发现了产 ;=海因酶菌种，证实了海因酶的存
在。随后研究者通过改变环境条件中的某些因素，如
碳源、氮源、温度、盐度或加入某些诱导剂等方法从土
壤中筛选到多种海因酶产生菌。?%:*.. 等［7］制备了
海因酶的抗血清，用 @因 酶 产 生 菌，!"#$"%&’(#)" ’*")+(),+ ;?C !"D" 和 ;?C!"D>。9-E-F)E% 等 人［#G］筛 选 到 -.’/%&’(#)"0*1 /5 ’BH!7#I，主要用于芳香族 <=氨基酸的制备研究。 表 #中列举了已报导的部分海因酶产生菌，多数为常 温生长菌株，比较耐热的菌株鲜见报导，但海因酶相 对较耐热，一般最适催化温度为DG J >G K。因此进一 步提高酶的耐热性或热稳定性，降低发酵成本［"］，也 是摆在众多研究者面前的重要课题。 表 # 部分海因酶产生菌及所产氨基酸构型的例子 L*M1) # @N*:51)/ -O :%+6--6&*.%/:/ P%,3 342*.,-%.*/) *+,%0%,4 *.2 ,3) +-.O%&Q6*,%-. -O *:%.- *+%2/ 56-2Q+)2 微生物菌株 生长温度 R K 海因酶构型 氨甲酰水解酶构型 产物氨基酸构型 引文 2+)*3%1%,’+ 4*#03’ I> ;< < < SQ+3*.*.［D］ -.’/%&’(#)"0*1 /5 !=! I8 < < < T%/3%2*［##］ 50("%&’(#0*1 .06*)7’(0),+ BH!7#I !G ;< < < L*E).*E*［#I］ 2+)*3%1%,’+ /5’ T?U"# !G ;< < < A/3%E*P*［#!］ !"#$"%&’(#)" /5 ;?C !"D" !G < < < V6-//［#D］
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!"#$%%&’ ’()"*+(,)*-+.,$%&’ ,-!!##. 中分离到耐热性
/0海因酶，在 123下，海因酶的半衰期为 #4 567。
896: 等［#4］从嗜热微生物中分离到两种新的耐热性
;0海因酶，这两种酶在 <2 3下可连续使用数 (。
-()*5)等人［!=］筛选到热稳定性的 ;0海因酶菌种
!"#$%%&’ >? .@=，此酶在 <2 3的半衰期为 12 567，在 A2 3保持 + (，活性仅丧失 BBC。 微生物海因酶耐热性的分子基础至今还不十分 清楚，并且一直是研究的热点。绝大多数海因酶是 四聚体或二聚体，寡聚结构对酶的活性是必需的，并 有助于提高酶的热稳定性。酶的高级结构的形成主 要依靠非共价键：即氢键、离子键、疏水相互作用。 酶结构模拟分析表明，热稳定性的酶与普通酶的主 要差别只在于分子内部这些非共价键数量上的不 同，并未发现有特殊的键。在寡聚结构中容易形成 分子间氢键，使其构象得以稳定，进一步稳定了海因 酶的分子结构。增加海因酶亚基间的分子间氢键可 以稳定酶的四级结构，进一步增加酶的稳定性［#A］。 D(%7E 等［!4］报道的 /0海因酶嗜热菌 /)(,"0+#+#1 #&’ " 2"00"’#,$$在含有 2 "4 5’: F / 的 8D: 溶液中有较 好的稳定性。超嗜热海因酶的低聚反应依赖于温度 和盐的浓度，这可能有助于酶的稳定。 蛋白质动力学研究耐热机制的常用途径是取代 突变。即在酶蛋白的某个位点改变氨基酸种类来改 变蛋白质工程的高级结构，再筛选出热稳定性增加 的突变株，然后进行蛋白质工程的结构分析。其中 被精氨酸、赖氨酸或大的疏水氨基酸替代，则耐热性 可明显提高。若被天冬氨酸、谷氨酸或一些中性的 氨基酸替代，则耐热性就下降。一般说来，对蛋白质 表面疏水性氨基酸的代替不适宜于热稳定性的提 高［#<］。D(%7E等从超嗜热海因酶产生菌 /)(,"0+#+#1 #&’ " 2"00"’#,$$克隆了海因酶基因，与 .’)&3+-+0"’ >? 的海因酶氨基酸序列比较发现，有 + 个保守的组氨 酸残基，在酶的催化过程中扮演重要角色。 !"#$%%&’
’()"*+(,)*-+.,$%&’ 的 ;0海因酶基因通过定点突变，将 +个组氨酸残基换成天冬氨酸后，导致酶的活性及 耐热性丧失，证实了组氨酸残基的重要性［#1］。 虽然通过对嗜热海因酶产生菌和常温海因酶产 生菌蛋白质氨基酸组成的比较表明，有 1=C以上的 同源性［#=］，但并不能由此认为通过改变几个特定氨 基酸就可以使热不稳定酶变为高温下的耐热酶。也 不能认为通过耐热菌与常温菌蛋白质的同源性比 较，可以看出这些改变，并由此建立热稳定性的普遍 机制，能应用于对常温酶的改造。要解释某个酶的 稳定性机制，需要有三维结构信息。利用生物信息 学方法，对酶的基本理论研究以及酶催化相互作用 的分子模拟，探究其序列、结构、热稳定性的关系，已 经成为十分重要的研究手段［B2，B!］。李家璜［B#］对来 自栖热菌 (,)*-&’ ’. 的海因酶在不同温度下的单亚 基和二聚体进行分子动力学模拟发现，海因酶双亚 基界面上还有许多极性和带电荷的氨基酸残基，可 以形成分子间氢键和盐键，稳定了酶的结构。相关 理论可为海因酶的热稳定性改造提供重要的依 据［BB］。 ! 海因酶的底物特异性 # "! 海因酶的对映体选择性分类 根据海因酶立体选择性差异可将海因酶分为两 大类：;0海因酶系和 /0海因酶系。已报道的海因酶 产生菌中 ;型海因酶居多，两种酶系在作用机制和 特性等方面存在一定的差异。在组成海因酶系的两 种酶中，有些情况下可能仅是一种具有立体选择性， 而有些情况下则是两种水解酶均具有立体选择性。 但尚未发现海因酶系作用后的最终产物为外消旋体 的报道。从已报道文献中发现，/0海因酶系中只有 一个酶具有立体选择性，而 ;0海因酶往往是两种酶 均具有立体选择性。两种立体选择性的海因酶在微 生物种群中的分布不同。从上述表 ! 中可看出，/0 海因酶一般分布在节杆菌、黄杆菌、棒杆菌等属，;0 型海因酶则多分布在假单胞菌和土壤杆菌等属。 # "# 海因酶底物特异性催化机理 也有报道称某些海因酶的立体选择性与底物 40 位侧 链 结 构 有 关。$)G 等［B+］研 究 4*(,*+5"#()*
"&*)’#)0’ ;-$B<+4 的海因酶时，给出一种模型，如图 #所示分别为苯海因、甲硫乙基海因、苄基海因的底 物作用模型图。 该模型根据观察到的底物谱来解释对映体选择 性的底物依赖性。无甲叉基取代的底物，如苯海因， 其疏水区不能与酶的疏水区之间相互作用，因而不 能作为底物。对于甲硫乙基海因，其两种对映体在 空间上处于同一位置，因此酶对于甲硫乙基海因是 无选择性的。对于吲哚甲基海因或苄基海因而言， 其两种对映异构体在空间结构上具有差别较大的侧 链，与酶的活性中心疏水作用差别较大，所以具有高 ·#A· 生物加工过程 第 B 卷第 B 期 万方数据 度选择性。但是这种模型只能解释一部分现象，而 不能解释假单胞菌属 !"#$% 和嗜热脂肪芽胞杆菌
!"%%&&’产生的海因酶转化 ()*甲硫乙基海因得到
)*蛋氨酸的现象。
图 & !"#$"%&’(#)" ’*")+(),+ ("+ ,$-. 所产海因酶的立体选择
性催化机制模型［,-］
/01 2& 34565789 :8;<=>07: 5? 7@848578A8;@0B0@C ?54 @<8 @50>=78
?45: !"#$"%&’(#)" ’*")+(),+ ("+ ,$-.［,-］
二氢嘧啶酶催化底物的结构要求有所不同［,.］，
它选择性水解 .D*单取代海因，此酶既不需要甲叉基
连接基团，也不需要与底物之间的疏水相互作用。
海因酶对不同底物的对映体选择性差异，以及对于
五元环、六元环底物的不同的作用方式，还需要更深
层地从酶的结构等方面研究。’E8>945@< 等［&#］通过
结构比较发现，来自不同菌种的海因酶有较高的同
源性，但是其选择性差别却很大，并且给出了分别来
自 !"#$"%&’(#)" ’*")+(),+ 的 )*海因酶与来自 -$)".*+
76的三维结构图，如图 ,。它们同属一个折叠类型，
海因酶的活性中心处在一个共同的、保守的（!F"）G
桶结构域，海因酶分子的催化中心由 & 个 H>& I、
J;K%.L（羧基化的赖氨酸）、M07#L、M07#&、M07%G,、
M07&,N、’76,%& 组成。酶分子在结构上的差别主要
体现在富含"折叠片的结构域的大小不同。
研究预测，海因酶分子的底物结合部位包括两
部分，一部分识别和结合海因基团，另外一部分识别
底物侧链基团，识别海因基团以氢键为主，识别底物
侧链以疏水作用为主。与 (*海因酶相比，)*海因酶
活性部位的空间比较大，海因酶结构底物结合部位
大部分残基分布在 .N O $,，N% O %LL，%-N O %.N，,%L
O ,%. 等折叠股上，这些残基决定了酶的催化底物。
从性质上看，这些残基是疏水性为主。将不同的底
物放入酶的活性部分，侧链与酶分子有空间抵触而
不能作为底物。从模型上看，这可能是导致 )*海因
酶和 (*海因酶催化不同构型底物的主要原因。利
用同源模建技术，来预测不同海因酶结构和底物选
择性的催化机理，也将成为实验设计的重要依
据［,#］。
=：)*@50>=78 @8@4=:84 E：(*@50>=78 @8@4=:84
图 , )*海因酶与 (*海因酶的四级结构
/01 2, P8@4=:84 5? )*@50>=78 =>9 (*@50>=78
! 海因酶的应用及发展［!"］
海因的生物转化有多种海因水解酶和 !*氨甲
酰氨基酸酰胺水解酶的参与。这些酶的合用或单酶
与化学偶联法提供了制备光学纯氨基酸的许多有吸
引力的途径，将海因酶分别与立体专一的 (*氨甲酰
水解酶或 )*氨甲酰水解酶合用可将一个海因消旋
体 %LLQ地转化为光学纯的对映体。例如 (*对羟基
苯甘氨酸、(*苯甘氨酸、)*苯丙氨酸、)*色氨酸、)*对
氯苯基丙氨酸、对三甲硅苯基丙氨酸、)*萘基丙氨酸
和"*萘基丙氨酸等。P=R=<=7<0 等还描述了海因酶的
另一个有趣的应用［,G］，将 (*海因酶用于逆反应的催
化，即从!，!*双取代*!*氨甲酰氨基酸的消旋混合物
选择性地合成 (*海因。作为一种天然氨基酸的新
型拮抗，.，.*双取代海因和!，!*双取代氨基酸将会
受到更多的关注。海因酶生物转化法已在光学纯氨
基酸及其衍生物的合成中展现出多方面的作用。
国外学者已对海因酶基因的克隆、测序、重组表
达、酶晶体结构解析以及产酶菌筛选和酶的分离纯
化、固定化、反应动力学等方面做了很多的研究。国
内有部分产酶菌的研究，对海因酶的基础性研究相
对较少。目前海因酶的报道趋向于热稳定性海因酶
产生菌的分离、重组表达及高效海因酶基因改造等
方面。对海因酶进行重组表达的主要作用在于降低
其催化剂的成本，提高催化效率。海因酶的研究正
向细分的方向发展，其中以酶结构和功能的相关研
究最为活跃，可以进一步开展酶的蛋白质设计和分
&LL. 年 G 月 梅艳珍等：海因酶热稳定性及底物特异性研究进展 ·&$· 万方数据 子模拟。对于海因酶的生理功能及相关海因酶热稳 定性、底物特异性以及酶与底物相互作用的详细机 制将是人们关注的焦点［!!，!"］。 在海因酶法氨基酸制备工艺中提升温度将提高 底物的溶解度和海因的自消旋速度，同时有可能发 展海因酶系双相催化的潜力，所以提高酶的稳定性 及其相关酶系固定化技术的发展是该工艺走向产业 化的瓶颈。同时还可开发新的非天然氨基酸产物， 海因酶转化法将是多姿多彩的微生物世界中酶应用 的一个范例。 参考文献： ［#］ 张炳荣$氨基酸工业大全［%］$北京：中国轻工业出版社，#""#$
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苄基海因制备 J=苯丙氨酸的过程分析及强化［ <］$现代化工， &DDA，@：AA=AB$
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