全 文 ：!"#$%&’( )!"#*固定化 !+海因酶及其催化性质
丁成勇，徐晓滢，马 ，刘 辉，姚 忠!
（南京工业大学 制药与生命科学学院，南京 ,-.../）
摘 要：!+海因酶是海因酶法制备 !+氨基酸的关键酶。利用 "#$%&’()*$+, ,*-*,+. -..0 菌发酵产酶，所得海因酶纯化
后，以 !"#$%&’( ),1.*为载体进行共价固定化。分别考察了酶液蛋白浓度、固定化时间对蛋白固定量和酶活回收率的
影响以及固定化前后海因酶催化性质的变化。结果表明：较高的酶液蛋白浓度和较长的固定化时间均有助于改善
海因酶的固定化效果；固定化可显著提高海因酶的最适作用温度，但对其最适作用 #2 影响不大；固定化后海因酶
对 !，/+32和 42的米氏常数均有较大幅度的降低。固定化酶反应器的实验表明：5. 6下，底物（!，/+32）- 7. &·
* 8 -，体积流速 - 7. 9*·9’: 8 -，经 ,- ;转化，产物 0+<;$质量浓度可达 . 75= &·* 8 -，转化率达 50 7,->。
关键词：海因酶；!"#$%&’( ),1.*；固定化；性质
中图分类号：?@/0A 7, 文献标识码：B 文章编号：-A=, 8 0A=C（,..A）.5 8 ..5- 8 .1
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!+海因酶（ !+;HTL:(I’:LW$，!) 0 71 7, 7,）是海因 酶法生产 !+型氨基酸的关键酶，目前已在 !+对羟
! 收稿日期：,..A+.A+.1
基金项目：国家 /=0 项目（FI7,..0)3=-A...5）
作者简介：丁成勇（-/==+），男，江苏苏州人，硕士研究生，研究方向为生物化工。
联系人：姚 忠，副研究员，!+9L’P：HLIZ;./^,A07 :$(
第 5 卷第 5 期
,..A 年 -- 月
生 物 加 工 过 程
);’:$W$ _I"%:LP IQ 3’I#%IS$WW !:&’:$$%’:&
FIV [ ,..A
·5-·
万方数据
苯甘氨酸、!!苯丙氨酸等手性氨基酸合成中得到了
广泛的应用［"!#］。但游离的 !!海因酶在催化过程中
难以回收利用，且不利于产物分离的缺陷严重阻碍
了其发挥更大的效用。采用固定化酶技术可以有效
地稳定酶的催化性能，提高酶的各种稳定性，方便产
物与酶的分离。#$$" 年，%&’()*+ ,-.+*)/ 等利用商品
化的 012&’.*) 3#4$5环氧树脂共价连接 "!海因酶取得
了较好的实际效果，国内未见研究报道［6!7］，作者已
使用 012&’.*) 3#4$5环氧树脂共价连接 !!海因酶得到
了 879的酶活收率，且 : ;下储存半衰期达到了
# 4$$ <［8］。对 012&’.*) 3#4$5固定化 !!海因酶的过程
及固定化 !!海因酶的性质进行了进一步的考察。
! 实验部分
" =" 材料及仪器
!!海因酶，南京工业大学制药与生命科学学院
自行发酵、纯化制备；4!苄基海因（4!>&+/?@!，"!CD，纯度!E8 =49），自制；4!甲硫乙基海因（4!
F&)制；环氧树脂 012&’.*) 3#4$5，HIJGK 3D0GI3K5 3B =；
三羟甲基氨基甲烷（L’*(），中国惠兴生化试剂有限公
司；其余试剂均为国产分析纯。
M%LK 0N2@B’&’ "$$ 蛋白质快速纯化系统，KF&’!
(<-F O<-’F-P*-；控温往复式水浴摇床；74#Q 紫外 R可
见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司。
" =# 实验方法
" =# =" !!海因酶的制备
将由本实验室的一株 #$%&’()*+%,- -+.+-,/ "$$6
菌株发酵产酶经过细胞破碎、硫酸铵沉淀、疏水层析
和离子交换层析等步骤后得到电泳纯的 !!海因酶
样品溶液［8］，蛋白质量浓度为 " =77 F.·F5 S "，于 :
;下保存备用。
" =# =# 蛋白浓度检测
参照 C’-ATB’A法［E］。
" =# =6 酶活测定方法及单位定义
采用分光光度法测定产物生产量的方法测定
!!海因酶的酶活［8］。 !!海因酶的活力定义为：:$
;，2D U 8 =4 条件下，6$ F*+ 内催化生成 "!FB5 0!
氨甲酰氨基酸所需要的酶量定义为 " 个酶活单位。
" =# =: 012&’.*) 3#4$5固定化 !!海因酶
配制一定蛋白浓度的酶液，按照 1（树脂）V 2
（酶液）（. V F5）U " V #$ 加入密闭的反应容器中，: ;
振荡（"$$ ’·F*+ S "）一定时间。取出滤去残液，用 "$
倍于树脂量（. V F5）的 2D 8 =4，"$$ FFB@·5 S "的 L’*(!
D3@缓冲液洗涤 6 遍后，浸泡于 4$ 倍树脂量（. V F5）
的 2D 8 =4，"$$ FFB@·5 S "的 L’*(!D3@ 缓冲液中。
" =# =4 酶活表现率计算［"$］。
酶活表现率 U 实测的固定化酶的活力被固定化了的酶在游离状态的活力 W "$$9
" 结果与讨论
# =" 酶液蛋白浓度对固定化效果的影响
分别配制蛋白质量浓度为 $ =#，$ =4，" =$ F.·
F5 S "的酶液与树脂进行固定化反应，酶活表现率及
蛋白固定量的变化趋势如图 " 所示。因为树脂的担
载量一定，随着酶液蛋白总量的增加，蛋白固定量有
所增加。但是蛋白固定量的增加并没有使酶活表现
率有相应的增加，即并非所有固定于树脂上的酶分
子都表现出了相同的催化性能。由于固定化酶催化
的反应属于非均相反应，底物与产物的内扩散强度
将显著影响整体的催化效率。结合图 6 的电镜照片
可以发现，以低浓度酶液进行固定化后，树脂表面呈
现较多的微孔，底物、产物扩散阻力较小，海因酶可
表现出较高的活性；而以高浓度酶液进行固定化后，
树脂表面结合了大量的酶分子，微孔密度明显降低，
底物、产物内扩散阻力增强，被固定于树脂内部的海
因酶活性表现率将显著降低（图 #）。而酶活表现率
高于 "$$9的情况可能与酶分子在固定化过程中构
象的改变有关。
—"—X*&@A BT 2’B)&*+；—#—X*@&A BT &+/?F& -P)*Y*)?
图 " 蛋白质量浓度对固定化效果的影响
Z*. =" I+T@1&+P& ->B1) )<& PB+P&+)’-)*B+ BT 2’B)&*+ B+ *FFB>*@*/-)*B+
# =# 固定化时间对固定化酶催化效果的影响
参照“" =# =:”方法，将 6 组 : F5 蛋白质量浓度
" =$ F.·F5 S "的酶液及 $ =# .干树脂加入密闭反应
·:#· 生物加工过程 第 : 卷第 : 期
万方数据
图 ! 不同荷载量固定化酶的底物扩散示意图
"#$ %! &#’’()#*+ *’ )(,)-./-0) /,*(- 1#’’0.0+- 0+2340 5*/1#+$ .0)#+
（6）：蛋白质量浓度 7 %! $·8 9 :酶液固定化后树脂表面扫描电
镜图；（;）：蛋白质量浓度 : %7 $·8 9 :酶液固定化后树脂表面
扫描电镜图
图 < 不同蛋白浓度的酶液固定化后树脂颗粒表面扫描电镜图
"#$ %< =>? 4#@.*$./AB) *’ -B0 .0)#+ A/.-#@50)
器中，反应时间分别为 !C，CD，E! B。固定化结束后，
以 !（树脂）："（#，$F;G饱和溶液）H（:：!7）进行反
应，以第一次反应的底物转化率为标准分析其操作
稳定性，结果见图 C。由图 I 可见，前 I 次转化过程
<个固定化酶活性均有明显的下降，这可能是由于
强度较差的树脂破碎以及结合较弱的酶分子脱落造
成的。经过 :! 次转化后，固定化时间 !C B 和 CD B
的固定化酶开始出现明显失活。而固定化时间为
E! B的固定化酶则没有明显的失活，!7 次转化后的
酶活仍能保持 J7K左右。这可能与 #F海因酶的固
定化方式有关。一个酶分子表面的多个活性基团（F
LG!和F=G）与载体表面的多个匹配基团（环氧基）之
间生成多个共价键（图 I），这种多点固定化的结构
大大增强了固定化酶的操作稳定性，而较长的固定
化时间更有利于这种结构的形成。
—!—!C B；—"—CD B；—#—E! B
图 C 固定化 #F海因酶操作稳定性
"#$ %C MA0./-#*+ )-/,#5#-3 *’ -B0 #44*,#5#201 #FB31/+-*#+/)0
图 I 多点固定化示意图
"#$ %I ?(5-#FA*#+- /--/@B40+- *’ #FB31/+-*#+/)0
! %< 固定化酶的最适反应温度及最适反应 AG值的
变化
固定化过程可以有效地提高酶的耐受能力，图
J 表明了 #F海因酶在固定化前后的最适反应温度
及最适反应 AG 值的变化。游离酶的最适反应温度
为 C7 N，而固定化酶的最适反应温度提高到了 J7
N（图 J（6）），这表明经过固定化过程之后，酶分子
的自由度降低，热变性效应被削弱。由于载体孔径
较大，GO的扩散阻滞作用较小，使得酶周围的微环
!77J 年 :: 月 丁成勇等：>(A0.$#- P!I78固定化 #F海因酶及其催化性质研究 ·C<·
万方数据
境与液相主体之间区别不大，所以固定化酶的最适
!"值无明显变化（图 #（$））。
—!—%&’’ ()*+,’；—"—-,,./010*’2 ()*+,’
图 # 温度（3）和 !"值（$）对固定化酶活力的影响
%04 5# (66’78 .6 8’,!’&98:&’（3）9)2 !"（$）.)
9780;08+ 9/.:8 0,,./010*’2 !<=+29)8.0)9>’
? 5@ 固定化酶的米氏常数
配制不同质量浓度的 A<苄基海因（!，"<$"），A<
甲基海因（!，"和固定化酶为催化剂进行反应，测定不同底物浓度
下的初始反应速度，以米氏方程拟合求得 #,，结果
如表 C 所示。酶分子经过固定化后，两种底物的 #,
值均有所下降，分别为原来的 C D C@ 和 C D E，这表明酶
分子对底物的亲和力得到了提高，且酶分子对 !，
"<$"的亲和力提高较多，这可能是由于 A<苄基海因
分子中的苯环造成了较强的空间位阻效应，而随着
酶分子的固定化，其活性中心可能由于分子空间构
象的变化而有利于底物分子的结合，减弱了这种位
阻效应。
? 5A 固定化酶填充床反应器性能研究
将 E ,F的固定化酶装入 CG 7, H!? 7, 玻璃空
柱内。配制 AG ,F底物溶液（!，"<$"），通过蠕动泵
进行循环反应，夹套保温，考察了底物浓度，反应温
度，体积流速对填充床反应器催化过程的影响，结果
见图 I，E，J。
表 C 固定化前后 !<海因酶米氏常数的变化
K9/1’ C L9&0’8+ .6 #, 9/.:8 6&’’ 9)2 0,,./010*’2 !<=+29)8.0)9>’
米氏常数 D（,,.1·F M C） 固定化酶 游离酶
#, N，F $%& C 5A@ ?G 5E#
O’ B" ? 5IG ?? 5EC
—!—@? P；—#—QA P；—"—?G P
图 I 底物质量浓度 C 4·F M C、流速 C ,F·,0) M C时温度
对填充床反应器催化的影响
%04 5I (66’78 .6 8’,!’&98:&’ .) 79891+>0> 9/.:8 !97R’2&’978.& 98 >:/>8&98’ 7.)7’)8&980.) C 4·F M C 9)2 61.S
&98’ C ,F·,0) M C
—!—G 5@ 4·F M C；—#—G 5E 4·F M C；—"—C 5G 4·F M C
图 E ?G P、流速 C ,F·,0) M C时底物质量浓度
对填充床反应器催化的影响
%04 5E (66’78 .6 >:/>8&98’ 7.)7’)8&980.) .) 79891+>0> 9/.:8
!97R’2结果表明，底物质量浓度增大可明显提高产物
的积累量（图 E），当底物质量浓度为 C 5G ,4·,F M C
时，经 ?G = 转化 (化率为 @Q 5?CU（由于本实验采用的底物是混旋的
$"，其中只有 !<$" 为有效底物，总体转化率是对
总 $"计算得到的）。此外，提高温度对转化过程也
有一定的促进作用，随着温度的升高，这种促进作用
就越明显（图 I），提高温度不仅可以提高反应速率，
·@@· 生物加工过程 第 @ 卷第 @ 期
万方数据
同时也可强化底物和产物的传质，促进 !!"# 的消
旋，可有效提高总转化率（图 $）。流速对转化进程
的影响较为复杂，在 % &’ ()·(*+ , %时可获得产物的
最大积累量（图 -）。
—!—. &’ ()·(*+ , %；—"—% &’ ()·(*+ , %；—#—’ &/ ()·(*+ , %
图 - .’ 0、底物质量浓度 % 1·) , %时流速对填充床
反应器催化的影响
2*1 &- 344567 84 498: ;<75 8+ 6<7<9=>*> ;5<678; <7 .’0 <+C >@?>7;<75 68+65+7;<7*8+ % 1·) , %
经初步优化，确定固定化海因酶填充床的最适
反应条件为：反应温度 D’ 0，底物质量浓度 % &’ 1·
) , %，体积流速 % &’ ()·(*+ , %。经 .% E转化，产物 "!
FE5 质量浓度可达 ’ &DG 1·) , %，转化率可达 DH &.%I。
! 结 论
利用 3@A5;1*7 J./’)为固定化载体，进行了 #!海
因酶的固定化研究，考察了酶液蛋白浓度及固定化
时间对酶活表现率和蛋白固定率的影响，并对其进
行了催化性质的研究；同时，初步优化了填充床酶反
应器的工艺参数。结果表明，考虑到催化效率及经
济因素，在固定化过程中宜使用蛋白浓度较高的酶
液进行固定化反应；此外，为了保证固定化酶良好的
操作稳定性，固定化时间应不少于 G. E。3@A5;1*7
J./’)固定化 #!海因酶的最适反应温度 K’ 0，最适
反应 A#值为 - &’ 左右，固定化酶半衰期可达 /’ C
以上。与游离酶相比，固定化 #!海因酶的米氏常数
明显下降，分别为 % &/D ((89·) , %（对 #，!!"#）和
. &G’ ((89·) , %（对 #，!!L#）。由固定化 #!海因酶
装填的酶反应柱，在最适反应条件下，经 .% E 转化，
底物转化率可达 DH &.%I。
参考文献：
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