全 文 ：氧应力在产朊假丝酵母发酵生产
谷胱甘肽过程中的作用
卫功元，王大慧，王晓峰!
（苏州大学 生命科学学院，苏州 !"#"!$）
摘 要：为了提高产朊假丝酵母合成 %&’的能力，采用外界氧应力刺激的方式对细胞进行处理。稳定期之前添加
’!(!对细胞生长有抑制作用，但稳定期添加 ’!(!对 %&’的合成有促进作用，当 ’!(!添加总浓度为 $) **+,·- . "时，
无论采用一次性添加还是补加策略，都可以提高 %&’ 的合成能力，胞内 %&’ 质量分数提高幅度最大接近于 !)/，
%&’产量最多提高 "0/。%&’分批发酵结果表明，稳定期补加 ’!(!对于产朊假丝酵母细胞来说，要比一次性添加
’!(!对提高胞内 %&’含量并最终增加 %&’产量更为有效，该结果为实现氧应力刺激下 %&’ 的过量合成提供了条
件。
关键词：谷胱甘肽；氧应力；分批发酵；产朊假丝酵母
中图分类号：12343 50 文献标识码：6 文章编号："40! . $407（!))4）)3 . ))!" . )#
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收稿日期：!))4=)4=")
基金项目：工业生物技术教育部重点实验室开放课题（Y-:Z)3)#），苏州大学青年基金项目
作者简介：卫功元（"[0#=），男，安徽肥西人，博士，副教授，主要研究方向：发酵工程；9=*@D,：IGD<>\ M?R@5 GR?5 H;
第 3 卷第 3 期
!))4 年 "" 月
生 物 加 工 过 程
PCD;GMG ]+?L;@, +F ZD+TL+HGMM 9;A+K V !))4
·!"·
万方数据
所有的好氧生物在进行好氧代谢、遇到电离辐
射或当环境中存在重金属或强氧化剂时，都会接触
活性氧化合物（!"#），如 "$·%，&$"$和 &"·等。当
胞内 !"# 浓度超过细胞还原能力时，即形成氧应
力。氧应力会损伤生物大分子，并且已被证实与癌
症、老化及神经变性等疾病密切相关［’］。由于 !"#
的普遍存在，为了保护大分子免受氧化性损害，大部
分好氧生物都进化出相应的防御机制，包括非酶系
统（如 (#&、)*和 )+）和酶系统（过氧化氢酶、超氧化
物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶）［$］。
谷胱甘肽（(#&）是细胞中最重要的非蛋白小分
子硫醇化合物，在酵母以及其它许多微生物中，(#&
可自发地，或在谷胱甘肽过氧化物酶（(,-）催化下
清除体内的活性氧［.］。许多研究均表明，(#& 和
(,-在清除体内氢过氧化物和内源性的脂类氢过氧
化物方面起重要作用［/］。依赖于 (#& 的还原系统
已被证实在大肠杆菌和酿酒酵母抵抗氧应力的过程
中扮演重要作用［0］。另外，又有学者提到巯基化合
物在抵抗氧应力方面的重要性，特别指出基于 (#&
的氧化还原系统在维持胞内氧化还原平衡方面可能
具有关键作用［1］。然而，外界氧应力的刺激是否能
引起细胞合成更多的 (#&，到目前为止还未见详细
报导。本文研究在产朊假丝酵母生物合成 (#& 过
程中，通过改变外界氧应力（以 &$"$为代表）的刺激
方式，考察氧应力对细胞生长和 (#& 合成的影响结
果。
! 材料与方法
’ 2’ 菌 种
产朊假丝酵母（ !"#$%$" &’%(%)）3#& 4$546，江南
大学环境生物技术研究室保藏。
’ 2$ 培养基
斜面、种子和发酵培养基：参见文献［7］。
’ 2. 培养方法
摇瓶培养：044 89 三角瓶中装发酵培养基
04 89，按体积分数为 ’4:的接种量接入种子进行
发酵培养，摇床转速 $44 ;·8<= % ’，培养温度 .4 >，发
酵时间 .4 ?。
发酵罐培养：全自动发酵罐 @A"B+*&50@(C（上
海保兴生物设备工程有限公司，玻璃材料）中装液量
/ 9，接种量体积分数为 ’4:，温度 .4 >，搅拌转速
.44 ;·8<= % ’，通气量 0 24 9·8<= % ’，培养时间 .4 ?。
用 D&电极在线测量 D&，通过自动流加 . 8EF·9 % ’
&$#"/和 . 8EF·9 % ’ GH"&溶液使 D&自动控制在 0 20
左右。
&$"$添加：在发酵培养的一定时间内，向培养体
系中一次或多次添加一定体积 &$"$至所需的初始
浓度。
’ 2/ 分析方法
细胞干重（I*3）、葡萄糖和 (#& 浓度的测定、
胞内 (#&的提取和含量计算以及动力学参数的计
算与分析方法参见文献［6］。
" 结 果
$ 2’ 一次性添加 &$"$对细胞生长和 (#&合成的影
响
根据前期的研究结果［J］，首先在 ! 2 &’%(%) 3#&
4$546 摇瓶培养过程的不同生长阶段，分别向培养体
系中一次性添加一定浓度的 &$"$，以考察外界氧应
力对不同生长时期的细胞干重和 (#& 产量的影响，
结果如表 ’。可以看出，在稳定期之前（ K ’1 ?），
&$"$的添加对于酵母细胞的生长具有一定的抑制作
用，浓度越高则抑制作用越明显；然而在进入稳定期
之后，&$"$的存在虽然导致培养体系具有较强的氧
化性，但对最终细胞干重几乎没什么影响。从另一
角度看，与对照相比，&$"$的添加对于酵母胞内 (#&
含量的提高都具有积极的作用，其中以在稳定期阶
段（$4 ?和 $/ ?）添加 &$"$的效果最好，胞内 (#&质
量分数增加的幅度都在 ’4:以上，在此基础上 (#&
的产量也相应地按比例提高。
为了更深入了解在稳定期添加 &$"$对 ! * &’%(%)
3#& 4$546 细胞合成 (#& 能力的影响，进一步考察
了在不同 &$"$浓度梯度条件下，酵母细胞对氧应力
的响应情况，结果如表 $。可以发现，无论是在 $4 ?
还是在 $/ ? 添加 &$"$，(#& 产量和胞内 (#& 含量
总体上也呈现出以上的规律性，其中当 &$"$浓度为
.4 88EF·9 % ’时，细胞合成 (#& 的能力（以胞内 (#&
含量表示）提高的幅度最大，甚至接近于 $4:。
·$$· 生物加工过程 第 / 卷第 / 期
万方数据
表 ! 在细胞生长的不同时期添加 "#$#对 %&"合成的影响
’()*+ ! ,--+./ 0- "#$# (112/203 03 4*5/(/6203+ 78015./203
531+8 129+8:+ .+** 480;/6 76(:+:
添加时间
< 6
"#$#初始浓度
<（==0*·> ? !）
细胞干重
<（4·> ? !）
%&"产量
<（=4·> ? !）
胞内 %&"
质量分数 < @
A B !# CBD !BE CF ! C#G
A #B !! CHH !B! C! ! C#G
A BA !! CB# !FB C# ! C#D
D B !# C!D !B# CI ! C#B
D #B !! CHF !FH CH ! C#D
D BA !! CFH !FF C! ! C#B
!# B !# CAH !BF C! ! C#H
!# #B !! CHH !BA CB ! C#G
!# BA !! CHF !FG CD ! C#B
#A B !# CFH !DG CA ! CIF
#A #B !# CI# !DG CD ! CID
#A BA !! CHH !DA CB ! CIB
#F B !! CG# !BF C! ! CI!
#F #B !! CBD !B! C! ! CI!
#F BA !# CAH !BH CH ! CI!
#H B !! CED !BE CF ! CII
#H #B !# CI# !BE CF ! C#E
#H BA !# CG# !DA CB ! C#D
对照 !# CAH !FB C# ! C#A
表 # 稳定期添加不同浓度的 "#$#对 %&"合成的影响
’()*+ # ,--+./ 0- 129+8:+ .03.+3/8(/203: 0- "#$# (112/203 (/
:/(/203(8J 76(:+ 03 4*5/(/6203+ 78015./203
添加
时间 < 6
"#$#初始
浓度 <（==0*·> ? !）
细胞干重 <
（4·> ? !）
%&"产量 <
（=4·> ? !）
胞内 %&"
质量分数 < @
#A B !# CAH !BH C! ! CI!
#A !A !# C!D !D! CG ! CII
#A !B !# C#F !BE CH ! CI!
#A #A !# CI# !DD C# ! CIB
#A #B !# CDF !DG CB ! CII
#A IA !# CAH !DB CD ! CIG
#A FA !! CHH !BE C! ! CIF
#A BA !! CHH !BH CB ! CII
#F B !# CAF !DA CB ! CII
#F !A !# C#F !DI CA ! CII
#F !B !# C#F !DF CI ! CIF
#F #A !! CDH !D! C! ! CIH
#F #B !# CAA !D! C! ! CIF
#F IA !# C!D !GA C! ! CFA
#F FA !! CED !DF CE ! CIH
#F BA !# CAF !DG CB ! CIE
对照 !# CFF !FB C# ! C!G
# C# "#$#补加策略对 %&"发酵过程的影响
"#$#是一种强氧化性物质，高浓度 "#$#的一次
性添加可能会导致培养体系的氧化还原环境发生较
大的变化，若分批次添加，将可以产生不同大小的氧
应力。以下根据不同的补加策略，考察 "#$#总添加
浓度为 IA ==0*·> ? !时，酵母细胞生长以及 %&" 合
成的响应情况，结果如表 I。可以看出，在 #A 6 和 #F
6时，无论是一次性添加 "#$#还是分批添加"#$#，
! C "#$%$& K&" A#LAH 对由此产生的氧应力都有响应
并在胞内合成了更多的 %&"，%&" 产量提高幅度最
大可达到 !G@。
表 I 不同 "#$#补加策略下的细胞生长和 %&"合成参数比较
’()*+ I M0=7(82:03 0- 7(8(=+/+8: 03 .+** 480;/6 (31 4*5/(/6203+
78015./203 531+8 129+8:+ "#$# -++1 :/8(/+42+:
"#$#添加时间及浓度 <（==0*·> ? !）
D 6 !# 6 #A 6 #F 6
细胞干重
<（4·> ? !）
%&"产量
<（=4·> ? !）
胞内 %&"
质量分数 < @
IA !A CE# !F! CA ! C#E
IA !! CHH !BB CE ! CI!
IA !# CAF !DG CB ! CIE
IA !! CGD !DB CD ! CF!
!B !B !A CID !IA CA ! C#B
!B !B !A CE# !IE CG ! C#H
!B !B !A CED !F# CI ! CIA
!B !B !! CDH !FH C! ! C#G
!B !B !! CDA !FE CF ! C#E
!B !B !! CHA !DH CH ! CFI
!A !A !A !A CGD !IH CF ! C#E
!A !A !A !! CHA !BG C# ! CII
对照 !! CE# !FF C# ! C#!
# CI "#$#添加对 %&"分批发酵的影响
根据以上针对 ! C "#$%$& K&" A#LAH 摇瓶培养发
酵生产 %&"时的 "#$#补加策略，在发酵罐中考察对
%&"分批发酵的影响，结果如图 !。可以看出，两种
"#$#补加策略下最终 %&" 产量和胞内 %&" 含量均
有明显提高。将 I 种培养方式下的 %&" 分批发酵
过程动力学参数进行总结（如表 F），结果发现虽然
"#$#在稳定期之后的一次性添加和补加都可以实现
%&"的高产以及 %&"合成能力的提高，但补加 "#$#
的策略更为有效，其中胞内 %&" 含量、最大 %&" 比
合成速率以及 %&" 对底物的得率等参数均明显高
于一次性添加 "#$#和对照的情况。
#AAD 年 !! 月 卫功元等：氧应力在产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽过程中的作用 ·#I·
万方数据
图 ! 不同培养方式下的 "#$分批发酵过程
— % —&’ (()*·+ , ! )- $./. 012 13343 5) 564 78)56 15 .9 6；—!—0:56);5 $./. 133:5:)<；
—"— 5)51* $./. =)<=4<5815:)< )- &’ (()*·+ , ! 012 13343 5) 564 =;*5;84 15 .’ 6 1<3 .9 6 1>481?4*@
A:? B! C:(4D=);824 )- 715=6 ?*;5156:)<4 -48(4<515:)< E8)=422 ;<348 3:>4824 =;*5;84 ()342 0:56 1<3 0:56);5 $./. 133:5:)<
表 9 "#$分批发酵过程动力学参数比较
C17*4 9 F)(E18:2)< )- G:<45:= E181(45482 0:56:< 715=6 ?*;5156:)<4 E8)3;=5:)<
参数 时间段 H15=6 ! H15=6 . H15=6 &
初糖质量浓度 I（?·+ , !） .J BKK .& BJL .9 BJ.
细胞干重 I（?·+ , !） !K B.L !M BL’ !J B9’
"#$产量 I（(?·+ , !） .J9 BN .JJ BL .&’ BJ
胞内 "#$质量分数 I O ! BJN ! BMK ! BJ’
平均比葡萄糖消耗速率 I 6 , ! ’ B.K& ’ B.9L ’ B.99
平均比生长速率 I 6 , ! ’ B!JM ’ B!JM ’ B!J9
平均比 "#$生产速率 I（!’ , & 6 , !）
整个过程 ! B99 ! B&K ! B&J
.’ 6之前 ! BMK ! BM! ! BJN
.’ 6之后 ’ B.M ’ B!M ’ B!&
.9 6之后 ’ ’ B’N ’
最大比 "#$生产速率 I（!’ , &6 , !） . BN! & B’! . BM&
细胞对葡萄糖得率 I（?·? , !） ’ BMK ’ BK! ’ BM&
"#$对葡萄糖得率 I（!’ , & ?·? , !） N BLN !’ BLJ N B9’
P)54：H15=6 ! 012 84E8424<515:>4 -)8 &’ (()*·+ , ! $./. 133:5:)< 5) 564 78)56 15 .9 6；H15=6 . 012 84E8424<515:>4
-)8 5)51* $./.=)<=4<5815:)< )- &’ (()*·+ , ! 13343 5) 564 =;*5;84 15 .’ 6 1<3 .9 6 1>481?4*@；H15=6 & 012 564 =)<58)*
! 讨 论
酵母作为一类低等真核微生物，其对氧应力的
抵抗机制一直是近 .’ 1 来微生物生理学领域中的
研究热点。酿酒酵母中已经发现的氧应力防御系统
包括非酶系统和酶系统［!’］，非酶防御系统中最重要
的物质是 "#$。"#$ 的活性巯基被 Q/# 氧化后生
成氧化型谷胱甘肽，后者在谷胱甘肽还原酶的作用
下可还原为 "#$，从而实现清除 Q/#、保护细胞的功
能。缺失 "#$ 合成活性的酿酒酵母突变株对 $./.
高度敏感，但对 $./.具有适应性应力响应［!!］。这种
机制已被证实，在低浓度 $./.诱导下，酵母中负责
转录调节的蛋白诱导 "#$合成酶系基因的转录，从
而合成更多的 "#$抵抗氧应力［!.］。然而，产朊假丝
·.9· 生物加工过程 第 9 卷第 9 期
万方数据
酵母对氧应力具有怎样的响应机制，至今还不太清
楚。
从着力提高产朊假丝酵母合成 !"# 能力的角
度入手，采用外界氧应力刺激的方式在不同生长时
期对细胞进行处理，酵母细胞对外加的 #$%$产生了
响应并合成比正常条件下更多的 !"# 以抵抗这种
氧应力，这与预期的结果比较一致。与此同时，在
#$%$添加总浓度相同的前提下，稳定期补加 #$%$的
策略对于酵母细胞来说，可以提高其胞内合成 !"#
的能力并最终增加 !"#产量，这可能与先期添加的
#$%$对于细胞生长后期 !"# 的进一步合成具有一
定诱导作用有关。尽管如此，还有许多问题诸如细
胞内过氧化氢酶的活性变化、氧应力与 !"# 合成能
力之间的定量关系等还有待于进一步探索，这也是
本课题以后需要研究的内容。
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