全 文 ：第７卷第２期
２００９年３月
生　物　加　工　过　程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．７Ｎｏ．２
Ｍａｒ．２００９
收稿日期：２００８－０６－２３
基金项目：国家自然科学基金资助项目（３０７７２７３１）；江苏省自然科学基金资助项目（ＢＫ２００７０５１）；苏州大学青年教师研究基金资助项目
（Ｑ３１３２６２５）
作者简介：许云峰（１９８３—），男，江苏盐城人，硕士研究生，研究方向：中药生物技术；王剑文（联系人），研究员，Ｅｍａｉｌ：ｊｗｗａｎｇ＠ｓｕｄａ．ｅｄｕ．ｃｎ
内生青霉菌纤维素酶辅助提取槐米总黄酮
许云峰，周建芹，陈晶磊，王剑文
（苏州大学　药学院，苏州 ２１５１２３）
摘　要：研究内生青霉菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍｓｐ．Ｂ ４）胞外纤维素酶在槐米总黄酮提取中的辅助应用。内生青霉菌在起始
ｐＨ４５的综合马铃薯培养基中，１５０ｒ／ｍｉｎ，４０℃下摇瓶，培养７ｄ，具有较高的纤维素酶比活力（３５７Ｕ／ｍＬ）。槐米
干粉投入青霉菌发酵液中进行酶解处理，比较酶料比、酶解温度、酶解时间和酶解液ｐＨ对槐米总黄酮提取率的影
响，发现槐米干粉以酶料比４０∶１（ｍＬ／ｇ）加入粗酶液中，在ｐＨ４５、温度４０℃下酶解处理１ｈ后，黄酮提取率可达
１２２％，比常规提取率增加了３８７％。内生菌纤维素酶辅助提取法为槐米黄酮提取的可行新方法。
关键词：纤维素酶；内生；提取；青霉菌；总黄酮
中图分类号：Ｒ２８４２　　　　文献标志码：Ａ　　　　文章编号：１６７２－３６７８（２００９）０２－００１８－０５
ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｅｌｕｌａｓｅｆｒｏｍｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃＰｅｎｉｃｉｌｉｕｍｓｐ．Ｂ４ｏｎｔｏｔａｌ
ｆｌａｖｏｎｏｉｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｆｒｏｍｆｌｏｗｅｒｂｕｄｓｏｆＳｏｐｈａｒａｊａｐｏｎｉｃａ
ＸＵＹｕｎｆｅｎｇ，ＺＨＯＵＪｉａｎｑｉｎ，ＣＨＥＮＪｉｎｇｌｅｉ，ＷＡＮＧＪｉａｎｗｅｎ
（ＳｃｈｏｏｌｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＳｏｏｃｈｏｗＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｕｚｈｏｕ２１５１２３，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｅｘｔｒａｃｅｌｕｌａｒｃｅｌｕｌａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆａｎｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃＰｅｎｉｃｉｌｉｕｍｓｐ．Ｂ４ｆｒｏｍＡｒｔｅｍｉｓａａｎｎｕａ
ｒｅａｃｈｅｄ３５７Ｕ／ｍＬｗｈｅｎｔｈｅｆｕｎｇｕｓｗａｓｃｕｌｔｉｖａｔｅｄｉｎｒｅｖｉｓｅｄＰＤＡｍｅｄｉｕｍｗｉｔｈｉｎｉｔｉａｌｐＨ４５ａｔ
４０℃ ｏｎａｒｏｔａｒｙｓｈａｋｅｒｉｎｃｕｂａｔｏｒａｔ１５０ｒ／ｍｉｎｆｏｒ７ｄ．Ｔｈｅｃｒｕｄｅｃｅｌｕｌａｓｅｆｒｏｍｔｈｅｃｕｌｔｕｒａｌｍｅｄｉｕｍ
ｗａｓａｐｐｌｉｅｄｆｏｒｔｈｅｆｌａｖｏｎｏｉｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｆｒｏｍｆｌｏｗｅｒｂｕｄｓｏｆＳｏｐｈａｒａｊａｐｏｎｉｃａ．Ｔｈｅｒａｔｉｏｏｆｄｒｙｆｌｏｗｅｒ
ｂｕｄｔｏｃｒｕｄｅｅｎｚｙｍｅｌｉｑｕｉｄ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｔｉｍｅ，ａｎｄｐＨｖａｌｕｅｗａｓｏｐｔｉｍｉｚａｔｅｄｄｕｒｉｎｇｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｃｅｌ
ｌｕｌａｓｅａｓｓｉｓｔｅｄｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ａｆｔｅｒｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｗｉｔｈ４０∶１ｏｆｃｒｕｄｅｅｎｚｙｍｅ（ｐＨ７０）ｔｏｄｒｙｆｌｏｗｅｒｂｕｄｆｏｒ
１ｈ，ｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｗａｓ１２２％，ａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ３８７％ ｔｈａｎｔｈａｔｉｎｒｅｇｕｌａｒ
ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓ．ＲｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｅｌｕｌａｓｅａｉｄｅｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｏｎｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｅｓｏｆＳｏｐｈａ
ｒａｊａｐｏｎｉｃａｉｓｐｒａｃｔｉｃａｌ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｃｅｌｕｌａｓｅｓ；ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍ；ｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｅｓ
　　近年来，酶技术应用于中草药有效成分的分离
提取取得了新的进展，如应用纤维素酶可破坏细胞
壁的致密结构，加速药用有效成分的溶出，提高药
用有效成分的提取率［１］。但纯酶易受外界提取条
件的影响，增加提取的成本，难于进行大规模的工
业应用。寻找低成本和高效的酶源已成为成功应
用酶技术辅助提取的关键。
　　植物内生菌（ｅｎｄｏｐｈｙｔｅ）是指那些在其生活史
的一定阶段或全部阶段生活于健康植物各种组织
和器官内部或细胞间隙的真菌或细菌，它们在和植
物长期共存和进化过程中建立了一种共生关系［２］。
生活在植物内部的内生真菌具有降解一部分植物
木质素和纤维素的能力，具有较高的果胶酶、木聚
糖酶、纤维素酶和多酚氧化酶活性［３－４］，Ｗａｎｇ等［５］
的研究也表明单头孢霉属（Ｍｏｎｏｔｏｓｐｏｒａ）内生真菌
具有较高的漆酶活性。
　　槐米是豆科植物槐（ＳｏｐｈｏｒａｊａｐｏｎｉｃａＬ．）的干
燥花蕾，在中医临床上槐米作为止血药，可治疗痔
疮、子宫出血，并有清肝泻火、治疗肝热目赤的功
效。槐米中含有以芦丁为代表的黄酮类化合物，黄
酮类成分能保持毛细血管正常的抵抗力，降低血管
通透性，是治疗心脑血管疾病药品的主要原料［６］。
但是，槐米中黄酮类物质难溶于水。为进一步挖掘
内生真菌的胞外酶活性以及在中药生物技术中的
潜在应用，本文以槐米总黄酮提取为模型，利用产
纤维素酶的内生青霉菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍｓｐ．Ｂ ４），通过
内生真菌纤维素酶粗提液处理槐米，并优化槐米总
黄酮提取的酶法辅助工艺。
１　材料和方法
１．１　菌种
　　内生青霉菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍｓｐ．Ｂ ４）分离自黄花
蒿（ＡｒｔｅｍｉｓｉａａｎｎｕａＬ．）茎韧皮部，菌种保藏在苏州
大学药学院真菌资源与菌种保藏室。
１．２　培养基
　　综合马铃薯（ＰＤＡ）培养基：马铃薯 ２００ｇ／Ｌ，葡
萄糖 ２０ｇ／Ｌ，琼脂 １０ｇ／Ｌ，ｐＨ自然，用于菌种分离。
　　羧甲基纤维素钠（ＣＭＣＮａ）培养基［７］，用于初
筛纤维素酶。
　　发酵培养基采用综合马铃薯培养基［８］。
１．３　培养条件
　　活化菌种：将青霉菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍｓｐ．Ｂ ４）接种
于ＰＤＡ平板上活化，２６℃培养５ｄ。
　　摇床发酵：培养基为综合马铃薯培养基，装液量
为５００ｍＬ摇瓶装液３００ｍＬ，接种量为５％，摇床转速
为１５０ｒ／ｍｉｎ。于不同时间（０～１２ｄ）和温度下（３０～
６０℃）发酵培养，以确定菌株的最佳产酶培养条件。
１．４　纤维素酶活性筛选
　　以羧甲基纤维素钠为底物，采用刚果红染色法，
粗筛产纤维素酶内生菌［７］。将有脱色圈的菌株挑出，
接种于马铃薯液体培养基中振荡培养５ｄ后，采用羧
甲基纤维素钠盐法测定酶活，以每分钟生成１μｍｏｌ
葡萄糖所需的酶量为一个酶活性单位（Ｕ）［９］。
１．５　总黄酮提取和测定
　　精密称取经过１２０℃干燥成恒质量的芦丁１００
ｍｇ，置于２０ｍＬ容量瓶中，加入体积分数７０％乙醇使
其溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为芦丁对照品溶液。
分别精确吸取对照液（０５ｍｇ／ｍＬ）０、０５、１０、２０、
３０、４０和５０ｍＬ置于１０ｍＬ容量瓶中，用体积分数
７０％乙醇稀释至５０ｍＬ，再分别加入质量分数５％
ＮａＮＯ２溶液０３ｍＬ，摇匀，静置６ｍｉｎ，再加质量分数
１０％ Ａｌ（ＮＯ３）３溶液 ０３ｍＬ，摇匀，静置６ｍｉｎ，再加
质量分数４％ ＮａＯＨ４０ｍＬ，用体积分数７０％乙醇稀
释至刻度，摇匀，静置 １２ｍｉｎ，于 ５１０ｎｍ处测 Ａ
值［１０］，以Ａ为纵坐标，质量浓度 ρ为横坐标进行回
归，得方程Ａ＝０８７９６ρ＋００３４３（ｒ＝０９９９５）。
　　槐米烘干磨碎，过２０目筛，称取５ｇ，以酶料比
（发酵液量／投料量，ｍＬ／ｇ）４０∶１加入粗酶液，摇匀后
３０℃水浴２ｈ，再加入１００ｍＬ蒸馏水后室温放置
２４ｈ，４５００ｒ／ｉｎｉｎ离心并吸取上清液５ｍＬ置于２５
ｍＬ容量瓶，加入体积分数７０％乙醇稀释至刻度，摇
匀，为供试样溶液。取上述制备试样５ｍＬ，再分别
加入质量分数５％ ＮａＮＯ２溶液 ０３ｍＬ，摇匀，静置６
ｍｉｎ，再加质量分数１０％ Ａｌ（ＮＯ３）３溶液０３ｍＬ，摇
匀，静置６ｍｉｎ，再加质量分数４％ ＮａＯＨ溶液４０
ｍＬ，用７０％乙醇稀释至刻度，摇匀，静置１２ｍｉｎ，于
５１０ｎｍ处测Ａ值，根据标准曲线计算试样中总黄酮
含量。槐米中总黄酮提取率 ＝提取液中总黄酮质
量／槐米质量×１００％。
１．６　酶法辅助提取试验
　　内生青霉菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍｓｐ．Ｂ ４）发酵液，经
５０００ｒ／ｍｉｎ离心 １０ｍｉｎ，上清液为纤维素酶粗提
液，测定酶活后 －８０℃保存，使用前测酶活。准确
称取槐米干粉，每份５ｇ，在应用纤维素酶粗提液处
理槐米时，选择不同的处理时间、温度、ｐＨ及酶料
比，分别研究各提取条件对总黄酮提取率的影响。
根据单因素的试验结果，选取 Ｌ９正交表进行正交试
验（表１），并进行极差分析以确定最佳处理条件。
２　结果与讨论
２．１　纤维素酶活性筛选
　　通过羧甲基纤维素钠（ＣＭＣ Ｎａ）培养平板初筛（图
１）发现Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍｓｐ．Ｂ ４具有分解ＣＭＣ Ｎａ的能力，培
养５ｄ后，该菌有较强的纤维素酶比活力（２５３Ｕ／ｍＬ）。
９１　第２期 许云峰等：内生青霉菌纤维素酶辅助提取槐米总黄酮
表１　内生菌纤维素酶辅助总黄酮提取正交试验因素水平表
Ｔａｂｌｅ１　Ｆａｃｔｏｒｓａｎｄｌｅｖｅｌｓｉｎｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｆｏｒ
ｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｅｓｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｗｉｔｈａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆ
ｃｒｕｄｅｃｅｌｕｌａｓｅｆｒｏｍｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃＰｅｎｉｃｉｌｉｕｍｓｐ．
水平
因素
Ａ
温度／℃
Ｂ
ｐＨ
Ｃ
酶料比
Ｄ
酶解时间／
ｈ
１ ３５ ３５ ２０∶１ １
２ ４５ ４５ ３０∶１ ２
３ ５５ ５５ ４０∶１ ３
　　能够产生纤维素酶的微生物包括大部分腐殖
质腐生菌、担子菌门非褶菌目的类群以及反刍动物
瘤胃真菌，木霉菌（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）是纤维素酶活性较
高的生产菌，青霉属的一些类群降解纤维素的能力
也较强［１１］。笔者已从黄花蒿（Ａ．ａｎｎｕａ）中分离到
７２株内生真菌，一些内生真菌具有较强的抗菌和青
蒿素调节等生物活性［１２］，具有纤维素酶的内生青霉
菌为该植物内生菌中的首次报道。内生菌的纤维
素酶活性部分反映了内生菌具有在宿主植物内部
侵染和共生的能力。
图１　Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍｓｐ．Ｂ ４分离（ａ）和纤维素酶活性羧甲基纤维素钠培养平板初筛（ｂ）
Ｆｉｇ．１　ＴｈｅｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃＰｅｎｉｃｉｌｉｕｍｓｐ．Ｂ４ａｎｄｔｈｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｃｅｌｕｌａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｂｙＣＭＣＮａｐｌａｔｅ
２．２　产纤维素酶内生菌的培养条件
　　内生青霉菌的生长曲线如图２所示，发酵至第
７ｄ，真菌生长转入生长中后期，此时纤维素酶比活
力达到最高，为３５７Ｕ／ｍＬ（图２）。培养基的ｐＨ为
４５时，培养温度为４０℃时，内生菌胞外纤维素酶
活性较高（图３）。
图２　Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍｓｐ．Ｂ ４的菌丝生物量和胞外纤
维素酶活性
Ｆｉｇ．２　Ｍｙｃｅｌｉａｂｉｏｍａｓｓａｎｄｅｘｔｒａｃｅｌｕｌａｒｃｅｌｕｌａｓｅ
ａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃＰｅｎｉｃｉｌｉｕｍｓｐ．Ｂ４
图３　培养温度（ａ）和培养基ｐＨ（ｂ）对Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍｓｐ．Ｂ ４
胞外纤维素酶活性的影响
Ｆｉｇ．３　Ｅｆｅｃｔｏｆｃｕｌｔｕｒｅｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（ａ）ａｎｄｐＨｖａｌｕｅ（ｂ）
ｏｆｍｅｄｉｕｍｏｎｅｘｔｒａｃｅｌｕｌａｒｃｅｌｕｌａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ
ｏｆｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃＰｅｎｉｃｉｌｉｕｍｓｐ．Ｂ４
０２ 生　物　加　工　过　程　　 第７卷　
２．３　酶法提取的条件比较
２．３．１　单因素实验
　　当应用内生青霉菌酶粗提液（５～２５ｍＬ）处理
槐米，在４０℃下，ｐＨ为４５，酶解１ｈ后，芦丁提取
率相比未加酶对照组提高了 ４８５％ ～４４３９％，最
佳酶料比为４０∶１（图４）。加酶处理时，温度（２５～
５５℃）、ｐＨ（３～６）和时间（１～４ｈ）单一因子变化对
芦丁提取率影响不显著。
图４　加酶量对纤维素酶作用下总黄酮提取率的影响
Ｆｉｇ．４　Ｅｆｅｃｔｓｏｆｔｈｅａｍｏｕｎｔｏｆｃｒｕｄｅｃｅｌｕｌａｓｅ
ｏｎｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｅｓｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｒａｔｅ
２．３．２　正交实验
　　当考虑因子间的相互作用时，正交试验极差分
析结果表明：酶解时间对总黄酮提取率的影响最
大，其次是 ｐＨ和酶解温度，影响最小的是酶料比
（表２，表３）。结合单因素试验结果，酶法提取槐米
表２　内生菌纤维素酶辅助芦丁提取正交试验结果
Ｔａｂｌｅ２　Ｒｅｓｕｌｔｏｆｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｔｅｓｔｏｎｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｅｓ
ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｒａｔｅｗｉｔｈａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｒｕｄｅｃｅｌｕｌａｓｅ
ｆｒｏｍｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃＰｅｎｉｃｉｌｉｕｍｓｐ．Ｂ４
试验号
因素
Ａ Ｂ Ｃ Ｄ
提取率／％
１ ３（５０） ２（４５） １（２０∶１） ３（３） ９３０４
２ ２（４０） １（３５） ２（３０∶１） ３ ９３００
３ １（３０） ３（５５） ３（４０∶１） ３ ８９８２
４ ３ １ ３ ２（２） ９６９８
５ ２ ３ １ ２ １０２０２
６ １ ２ ２ ２ １０３８８
７ ３ ３ ３ １（１） ９８７２
８ ２ ２ ２ １ １１３８４
９ １ １ １ １ １１１４９
表３　误差分析
Ｔａｂｌｅ３　Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｅｒｒｏｒ
误差来源
因素
Ａ Ｂ Ｃ Ｄ
Ｋ１ ３０５１９ ３０１４７ ３０６５５ ３２４０６
Ｋ２ ３０８８６ ３１０７６ ２９５６０ ３０２８８
Ｋ３ ２８８７４ ２９０５６ ３００６４ ２７５８６
Ｒ ０６７１ ０６７３ ０３６５ １６０７
总黄酮的最佳工艺条件为 Ａ２Ｂ２Ｃ１Ｄ１：即酶解温度
４０℃、ｐＨ４５、酶料比４０∶１、酶解时间１ｈ。以总黄
酮提取率为指标，精确称取等量（５ｇ）的槐米干粉，
采用上述试验确定的最佳工艺条件提取，按该工艺
优化条件进行重复试验３次，总黄酮平均提取率可
达１２２％，与常规水提法（８８％）相比，提取率提高
了３８７％。
　　应用纤维素酶协同常规法进行中药有效成分
提取的相关报道目前已引起重视［１３－１４］，但此类研究
中大多使用的是纯酶，成本较高，易受中药成分或
其他环境因子的影响。
３　结　论
　　本文用内生菌的纤维素酶发酵液作用于槐米
芦丁的提取，并初步优化出酶法提取的最佳条件：
酶解温度４０℃、ｐＨ４５、酶料比４０∶１、酶解时间１ｈ。
在此条件下总黄酮提取率可达１２２％，比常规提取
方法提取率提高了３８７％。实验结果表明：使用微
生物粗酶辅助法是中药材提取的新方法，值得进一
步探讨和工艺优化。
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１２５１２７．
国内简讯
山东专家发现一微生物可将秸秆转生物柴油
木霉主要用来生产纤维素酶和制造生物农药。山东省科学院生物研究所的专家研究发现，在天然培养
基上，木霉可以产生大量的烃类物质及其衍生物，所产生的烃类物质是柴油的主要组成部分，许多烃类衍生
物，如醇、酯等也可作为能源物质使用。这项研究为生物柴油的生产提供了一种新的可能性。此前，制造生
物柴油的途径主要有３条，即利用食用油、甘蔗渣发酵或“工程微藻”生产生物柴油。
武大发现非典病毒致命点基因编码
武大发现ＳＡＲＳ冠状病毒致命点“非结构蛋白 ｎｓｐ１４”的基因编码已刊载在国际权威综合性学术期刊
《美国科学院院报》上。
非典病毒是现在发现的最大的ＲＮＡ（核糖核酸）病毒，“非结构蛋白ｎｓｐ１４”是这个基因传递链条上至关
重要的一节，不仅能够保证病毒不效复制，还给病毒加上一顶特殊的保护性“帽子”。
首先，它为病毒遗传信息乔装打扮，让免疫系统识别不出，采取“特洛伊木马战术”，不知不觉中将大量
病毒送入了要袭击的地方。非典病毒的遗传信息是通过 ＲＮＡ传递的，很不稳定，容易降解，但这项“帽子”
能起到保护作用。此外，它还是将其基因变成病毒生病蛋白的核心，没有这组编码，再多基因也变不成病毒。
该基因编码的发现为筛选抗击非典病毒药物奠定了基础，比如可通过这个系统，找出某种对非典病毒
这一功能有害、但对人体无害的物质，进而研发成小分子药物。
（朱宏阳）
２２ 生　物　加　工　过　程　　 第７卷