全 文 ：第 35 卷第 9 期
2015年 5月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol.35,No.9
May,2015
http: / / www.ecologica.cn
基金项目:国家重点基础研究发展规划资助项目(2013CB733502); 国家自然科学基金资助项目(41371268, 31300447)
收稿日期:2013鄄06鄄18; 摇 摇 网络出版日期:2014鄄05鄄22
*通讯作者 Corresponding author.E鄄mail: lixz@ cib.ac.cn
DOI: 10.5846 / stxb201306181726
刘驰, 李家宝, 芮俊鹏, 安家兴, 李香真.16S rRNA基因在微生物生态学中的应用.生态学报,2015,35(9):2769鄄2788.
Liu C, Li J B, Rui J P, An J X, Li X Z.The applications of the 16S rRNA gene in microbial ecology: current situation and problems.Acta Ecologica
Sinica,2015,35(9):2769鄄2788.
16S rRNA基因在微生物生态学中的应用
刘摇 驰1,2,3, 李家宝1,2, 芮俊鹏1,2, 安家兴1,2, 李香真1,2,*
1 中国科学院环境与应用微生物重点实验室, 成都摇 610041
2 环境微生物四川省重点实验室, 中国科学院成都生物研究所, 成都摇 610041
3 中国科学院大学, 北京摇 100049
摘要:16S rRNA ( Small subunit ribosomal RNA)基因是对原核微生物进行系统进化分类研究时最常用的分子标志物
(Biomarker),广泛应用于微生物生态学研究中。 近些年来随着高通量测序技术及数据分析方法等的不断进步,大量基于 16S
rRNA基因的研究使得微生物生态学得到了快速发展,然而使用 16S rRNA基因作为分子标志物时也存在诸多问题,比如水平基
因转移、多拷贝的异质性、基因扩增效率的差异、数据分析方法的选择等,这些问题影响了微生物群落组成和多样性分析时的准
确性。 对当前使用 16S rRNA基因分析微生物群落组成和多样性的进展情况做一总结,重点讨论当前存在的主要问题以及各种
分析方法的发展,尤其是与高通量测序技术有关的实验和数据处理问题。
关键词:16S rRNA基因; 微生物群落; 多样性; 高通量测序; 生物信息数据处理
The applications of the 16S rRNA gene in microbial ecology: current situation
and problems
LIU Chi1,2,3, LI Jiabao1,2, RUI Junpeng1,2, AN Jiaxing1,2, LI Xiangzhen1,2,*
1 Key Laboratory of Environmental and Applied Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Chengdu 610041, China
2 Environmental Microbiology Key Laboratory of Sichuan Province, Chengdu Institute of Biology, Chinese Academy of Sciences, Chengdu 610041, China
3 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
Abstract: The 16S rRNA (small subunit ribosomal RNA) gene is a universal marker for phylogenetic reconstructions to
approximate the tree of life owing to its presence in all prokaryotes and its high conservation. Sequencing of 16S rRNA genes
amplified directly from environmental samples is commonly used to study microbial community composition and diversity.
Great advances in pyrosequencing technology and bioinformatics in recent years enable us to obtain sequence data from
large鄄scale environmental samples efficiently and cost鄄effectively. However, some critical problems need to be addressed
when the 16S rRNA gene is used for microbial diversity studies, such as horizontal gene transfer (HGT), intragenomic
heterogeneity, PCR amplification efficiency, and sequencing data analysis. In this review, we summarize the state鄄of鄄the鄄art
applications of 16S rRNA gene as a biomarker for microbial ecology studies, and introduce current pyrosequencing
techniques and bioinformatics for large鄄scale data analysis. This review focuses on four aspects. ( i) We introduce the
structure and properties of the 16S rRNA gene, e.g. the primary and secondary structure, HGT and heterogeneities of 16S
rRNA genes. Based on current available microbial genomes, multi鄄copy and intragenomic heterogeneities of 16S rRNA genes
are recognized. These phenomena may seriously bias the estimations of microbial diversity in environmental samples. Some
online tools and databases used for analysis of the 16S rRNA gene sequencing data are also introduced. These tools are used
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to predict horizontal gene transfer, secondary structure, and to align and classify 16S rRNA gene sequences. ( ii) We
introduce some 16S rRNA鄄based techniques commonly used in microbial ecology studies, such as fingerprinting profiling,
hybridization, microarray, and high throughput pyrosequencing methods. We compare the advantages and limitations of
various methods and recommend how to use them properly based on a specific target. Different methods have different
resolutions and detection limitations. Low鄄resolution profiling methods potentially miss some important information and make
it difficult to detail the phylogenetic composition of an environmental sample. Pyrosequencing technique is highly
recommended in the future for microbial ecology study. Several sequencing platforms, e. g. Roche 454, Ion Torrent and
MiSeq, are compared. ( iii) We evaluate the biases that may be introduced during sample preparation and PCR procedures,
e. g. DNA extraction, primer selection, PCR optimization, PCR product purification, and data analysis. Amplicon
sequencing method suffers from a high level of sequencing and amplification artifacts. It is important to select OTU
(operational taxonomic units) classification and chimera removing algorithms. In this case, the Uchime and Uparse are
recommended for microbial amplicon pyrosequencing reads. ( iv) We introduce some bioinformatics tools for pyrosequencing
data analysis, such as chimera check and diversity index calculation. The most popular pipelines for pyrosequencing data
analysis include RDP, QIIME and Mothur. In order to link ecological questions with microbial composition data, the
methods of ecological statistics must be employed to build the relationships of microbial datasets with environmental
variables. Here, we introduce some multiple statistical methods, e.g. PCA and UniFrac analysis. Based on these analyses,
microbial data based on 16S rRNA sequencing are linked to the environmental variables, and fundamental ecological
questions are addressed. Finally, we recommend researchers to consider these problems systematically when using 16S
rRNA鄄based techniques in microbial ecology study.
Key Words: 16S rRNA gene; microbial community; microbial diversity; pyrosequencing; bioinformatics
微生物是地球上数量最多和多样性最高的生物,1g土壤中仅细菌就可能有 109个。 由于大多数微生物尚
不能纯培养,传统的微生物研究方法,如显微镜微形态观察、选择性培养基计数、纯菌种分离和生理生化鉴定
等,在微生物多样性研究中都存在很大的局限性。 基于非培养基础上的分子生物学方法可以使人们快速、系
统地分析环境样品中微生物组成、结构和多样性,极大地促进了微生物生态学的发展。 Zuckerkandl 等首次提
出使用基因序列作为分子钟来分析生物间的亲缘关系[1]。 Woese和 Fox基于 16S rRNA基因序列对原核生物
的系统进化关系进行了分析,提出了著名的“三域学说冶 [2]。 从此,16S rRNA 基因成为了最常用的生物标志
物,广泛应用于微生物的系统进化、分类及多样性研究中。 基于 16S rRNA信息的系统分类结果与基于全基因
组信息的分类结果很相似[3]。 随着测序技术的发展,人们可以更加快捷地获得环境样品中的 16S rRNA 基因
序列,这些序列信息可以和数据库中的已知信息进行比对,以研究环境样品中微生物群落的特点。 本文主要
针对当前使用 16S rRNA基因分析微生物群落结构和多样性的现状进行总结,重点讨论当前技术的发展状况
和存在的主要问题。
1摇 16S rRNA基因的特点
微生物 rRNA在漫长的进化过程中,由于其在碱基组成、核苷酸序列、高级结构及生物功能等方面表现出
高度保守性而有微生物“化石冶之称。 保守性能够反映微生物之间的亲缘关系,为系统发育重建提供线索。
然而 rRNA的序列组成也不是完全保持恒定的,其具有一定的可变性,这种可变性能够反应出不同微生物的
特征核酸序列,可以作为微生物多样性分析的分子基础。 原核微生物的 rRNA 按沉降系数可以分为 5S、16S
和 23S rRNA,大小分别约为 120 bp、1540 bp和 2904 bp左右(以 Escherichia coli为例)。 5S rRNA的基因序列
较短,易于测定,但是由于其缺乏足够的遗传信息,不适用于系统分类研究;相反,23S rRNA 含有的核苷酸序
列较长,分析较困难。 16S rRNA占细菌总 RNA量的 80%以上,基因序列长短适中,其结构中既有保守区域,
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又有变异区域,是较好的生物标志物。 人们根据 16S rRNA基因不同区域序列的可变性将其分为 9 个可变区
和 9 个保守区[4](图 1)。
图 1摇 16S rRNA基因保守区和可变区的分布
Fig.1摇 Conserved and variable regions in the 16S rRNA gene
虽然 16S rRNA基因被广泛应用于微生物多样性分析中,然而对于某些属的菌群分辨效果较差,如 Vibrio、
Pseudomonas 等[5]。 人们一般设定 16S rRNA基因序列相似性³97%的原核生物为同一个种,但很多不同种的
微生物其 16S rRNA基因序列相似性却高于 97%。 另外,许多细菌的 16S rRNA基因是多拷贝的,而且各拷贝
的序列组成存在一些差异;16S rRNA基因也存在着水平转移问题,这些都直接影响着对原核微生物群落结构
和多样性的分析。
1.1摇 基因水平转移(HGT)
人们以前曾普遍认为 16S rRNA基因不存在水平转移现象,然而一些研究发现,在许多细菌中 16S rRNA
基因都出现了水平转移[6鄄7]。 在对 Pseudomonas属的研究中发现,有些种的 V1 区和 V3 区中的 48.3%和41.6%
的 16S rRNA基因序列可能是从另一个距离较远的种通过基因水平转移得到的,因此,应该避免使用这些可变
区对 Pseudomonas进行种间分类[7]。 Choi等在对 Pfam数据库蛋白结构域分析时发现已有的微生物可能发生
过基因水平转移的占 1.1%—9.7%,其中多于一个蛋白结构域基因发生水平转移的古菌占一半以上,而细菌
占 30%—50%,真核生物不到 10%,这说明原核微生物发生基因水平转移的频率远远大于高等生物,他们也通
过对比发现 HGT对于群落 SSU (small subunit) rRNA基因整体的系统发育分析影响不大[8]。 Garcia鄄Valle 等
建立了基因水平转移数据库(HGT鄄DB),收录了多种微生物发生基因水平转移的数据和相关证据[9]。
1.2摇 16S rRNA基因的多拷贝及异质性
很多原核微生物基因组中 rRNA基因是多拷贝的,同一菌种中不同拷贝的基因序列也可能存在差异(异
质性) [10]。 V侑trovsky忆等研究了 1690 种已知的细菌基因组,发现只有 15%的基因组中 16S rRNA基因是单拷贝
的,21%的基因组含有 3—7 个拷贝,最大的拷贝数是 15(Brevibacillus brevis NBRC 100599 和 Photobacterium
profundum SS9),2.4%的基因组中 16S rRNA基因具有 1%以上的序列差异[11]。 在此之前,Pei 等[12]通过对数
据库中的 rRNA序列进行分析时也发现,425个种都具有 2—15个不等的 rRNA基因拷贝数(2.22 依 0.81),如
古菌一般含 2—4 个,氨氧化细菌含 1—2 个,固氮菌一般含 1—3 个;235个基因组中 16S rRNA基因序列异质
性变化在 0.06%—20.38%之间,例如古菌 Haloarcula marismortui 基因组含有的两种 16S rRNA 基因序列差异
性达到了 5%。 多拷贝的存在给微生物群落的定量分析带来诸多问题,使群落的多样性估计和结构分析存在
较大的偏差[13]。 V侑trovsky忆等使用高通量测序法分析土壤细菌时发现具有低拷贝 16S rRNA 基因的类群如
Acidobacteria的丰度会被低估,而具有高拷贝 16S rRNA 基因的类群如 Gammaproteobacteria 的丰度会被高估。
在某些特定情况下,对于拷贝数多或异质性大的菌群可以用其它替代性的单拷贝基因来分析其多样性或进化
关系,如 GroEL 伴侣蛋白,RNA 聚合酶 茁 亚基( rpoB),DNA 回旋酶 茁 亚基( gyrB)和热休克蛋白( dnaK)
等[14鄄15]。 也有人使用 hsp60进行 Enterobacter的系统进化和分类研究[16]。 异质性问题对 16S rRNA 基因高通
量测序研究的影响还需要进一步系统性评估。
1772摇 9期 摇 摇 摇 刘驰摇 等:16S rRNA基因在微生物生态学中的应用 摇
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1.3摇 16S rRNA序列的二级结构
不论种间的 16S rRNA 基因序列差异有多大,在进化过程中 16S rRNA 都保留了相似的二级结构,与
Escherichia coli的二级结构相似性很高[17]。 Thermoanaerobacter tengcongensis含有 4 个 16S rRNA基因,这些基
因的一级结构差别达到了 6.7%,但二级结构却是很保守的[12]。 研究者通过元基因组学方法发现其它细菌
rRNA序列与 Escherichia coli的 16S rRNA序列相似性为 80.9%—99.0%时,它们的 rRNA操纵子可以通用,只
不过代时将会增加,这个研究表明保持二级结构是维持 rRNA 功能的重要前提。 虽然 HGT 对微生物群落多
样性的分析结果影响较小,但如果进行研究的某些微生物类群中 16S rRNA基因发生 HGT 可能性较大,要精
确构建进化树则需根据已有的实验经验综合进行分析。
RNA分子具有降解速度快且难以结晶的特点使得难于通过 X 射线晶体衍射和 NMR(Nuclear Magnetic
Resonance)等方法提高对 RNA分子空间结构的认识,因此利用各种计算方法从理论上分析 rRNA的空间结构
是目前主要的方法。 原核微生物 16S rRNA的二级结构相对于一级结构更加保守,因而研究二级结构对于系
统进化分类很有意义[18],尤其是对于种属的鉴定[19]。 很多序列比对分析软件都考虑了二级结构,如 RDP
aligner、ARB(http: / / www.arb鄄home.de / )、SSU鄄ALIGN (http: / / selab. janelia.org / software / ssu鄄align / )等[20鄄21],使
系统进化分类结果更加快速准确。 rRNA 二级结构分析编辑可使用 ARB[22]和 jphydit ( http: / / plaza. snu. ac.
kr / —jchun / jphydit / index.php)等。 RNA二级结构的预测主要包括 2种方法:最小自由能算法和序列比较分析
方法。 当前核酸数据库日益庞大,数据量呈指数性地增长,在 16S rRNA一级结构的基础上进行二级结构分析
对序列比对、OTU(operational taxonomic units)分类就变得更加重要[23鄄24],因此应该加强二级结构分析预测算
法及软件的研究。
1.4摇 16S rRNA基因序列分析数据库
研究者们已经建立了一些专门针对于 16S rRNA的数据库,储存 16S rRNA基因序列,通过互联网对新测
定的序列进行比对分析,比较著名的数据库有 SILVA(http: / / www.arb鄄silva.de) [25]、RDP(http: / / rdp.cme.msu.
edu / ) [21]和 Greengenes(http: / / greengenes.lbl.gov / ) [26],人们可以从这些数据库中获取高质量的 16S rRNA 基
因序列信息。 rrnDB(http: / / ribosome.mmg.msu.edu / rrndb)数据库专门用于记录细菌和古菌基因组中 rRNA和
tRNA基因的拷贝数[27]。 在 NCBI、DDBJ 和 EMBL 数据库中也有许多 16S rRNA 基因全长和短序列,如 NCBI
Genbank中有几十万条大于 1000 bp的人体微生物群落的 16S rRNA 序列。 某些领域也建立了一些专业的数
据库,如病原微生物 16SpathDB (http: / / 147.8.74.24 / 16SpathDB) 数据库,可用于鉴定对临床重要的细菌 16S
rRNA序列[28];CORE[29]是人体口腔微生物方面的专业数据库。 Comparative RNA Web Site (http: / / www.rna.
ccbb.utexas.edu / ) 是分析 rRNA二级结构的数据库。 EzTaxon鄄e收集了已培养或未培养微生物的 16S rRNA序
列信息,常用于鉴定新分离的菌株[30]。 probeBase可用来检索与 16S rRNA有关的探针[31]。
2摇 16S rRNA基因在研究微生物群落中的应用
常规的微生物分子生物学研究方法如分子杂交、SSCP、DGGE、RFLP、ERIC鄄PCR、FISH及克隆文库法等相
对简单,易于实验操作,但得到的信息量有限,分辨率普遍较低。 近些年来发展起来的高通量测序[32鄄33]和基
因芯片技术[34鄄35]强有力地推进了微生物生态学的研究。 尽管每种方法都有各自的局限性,但这些技术的应
用使人们对环境中的微生物群落有了更深入的认识[35鄄36]。 图 2 勾画出了常用的利用 16S rRNA 基因分析微
生物群落结构和多样性的基本流程。
2.1摇 指纹图谱技术
基于 16S rRNA基因的指纹图谱技术如 DGGE、TGGE、SSCP、ARDRA 和 T鄄RFLP 等被广泛用于微生物群
落的研究中[37]。 由于指纹图谱技术的操作相对较简单,在环境微生物动态监测和分析等方面得到了广泛应
用[38鄄39]。 表 1列出了常见的指纹图谱分析方法的原理和优缺点,并与多基因序列分析(MLSA)进行比较。
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图 2摇 基于 16S rRNA基因的微生物群落多样性分析的主要流程
Fig.2摇 Pipelines for microbial diversity analysis based on the 16S rRNA gene
表 1摇 各种 rRNA分析技术的原理和比较
Table 1摇 Comparisons of fingerprinting profiling techniques
方法
Method
原理
Principle
特点
Characteristic
参考文献
References
核糖体分型
(Ribotyping)
利用限制性内切酶对整个基因组进行
酶切,用标记的 16S rRNA 基因探针与
之杂交,检测相应的 RNA 操纵子的
位置
只与限制性酶切位点的变化相关,需进
行杂交试验,较费时 [40]
扩增性 rDNA 限制性酶切片段
分析(ARDRA)
对 16S rRNA基因扩增或克隆产物进行
限制性酶切片段长度多态性分析 分辨率高,与限制性位点有关,费时 [41]
末端限制性片段长度多态性分
析(T鄄RFLP)
通过 PCR 技术、DNA 限制性酶切技术
和荧光标记技术得到末端带有荧光标
记的限制性多态性片段
方便快捷,灵敏度高,并只与末端限制
性片段的大小有关 [39]
16S—23S内部转录间隔区
(ITS)分型
ITS片段在进化过程中产生更多的变
异,即使是亲缘关系非常接近的 2 个种
都能在 ITS序列上表现出差异
比 16S rRNA 基因序列具有更大的变
异,对亲缘性更近的种属分型更有用 [42]
核糖体 ITS区自动分型
(ARISA)
利用荧光标记微生物核糖体基因间隔
区(ITS)对差异进行分析 分辨率较高 [43]
限制性片段长度多态性分析
(RFLP)
整个 rRNA 基因的限制性片段长度多
态性分析 灵敏度高,操作要求高,分析较复杂 [44]
变性梯度凝胶电泳 (DGGE)
DNA在不同浓度的变性剂中解链行为
不同,导致电泳迁移率发生变化,从而
将片段大小相同而碱基组成不同的
DNA片段分开
检测片段在 500bp以内为宜,中等分辨
率,只能检测优势菌群 [45]
温度梯度凝胶电泳(TGGE) DNA在不同温度梯度环境中解链行为的不同会导致电泳迁移率发生变化
大片段 DNA由于 Tm值较高,检测难度
较大 [46]
单链构象多态性 (SSCP) 单链 DNA的构象差异导致其在凝胶电泳中的迁移率变化
分辨率中等,检测片段小于 400bp 最为
理想 [47]
多基因序列分析(MLSA) 通常对几个长度为 500bp 左右的目的基因进行测序,用于进化分析
能有效地在种水平上鉴定菌株,还可用
于生态型的划分 [48]
摇 摇 ARDRA: amplified ribosomal DNA restriction analysis; T鄄RFLP: terminal restriction fragment length polymorphism; ITS: internally transcribed
spacer;ARISA: Automated ribosomal intergenic spacer analysis; RFLP: Restriction fragment length polymorphism; DGGE: Denaturing gradient gel
electrophoresis; TGGE: Temperature gradient gel electrophoresis; SSCP: Single鄄strand conformation polymorphism; MLSA: Multilocus sequence analysis
3772摇 9期 摇 摇 摇 刘驰摇 等:16S rRNA基因在微生物生态学中的应用 摇
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整体来看,指纹图谱技术通量和分辨率比较低,可以用来对样品进行初步的筛选或评估,例如有时为了减
少测序量,可以先进行 ARDRA 或其它方法分型,然后根据分型结果对有代表性的样品再进一步研究。 某些
情况下如果仅使用 16S rRNA的信息,分辨效果可能不是太好,可使用其它一些分子分析方法作为补充。 相比
16S rRNA和 23S rRNA来说,ITS序列在进化过程中由于面临着较小的选择压力故存在较大的变异,因此 ITS
的长度和序列的多态性能用来区分不同种的原核生物[42]。 在种的水平上,MLSA 也是鉴定菌株非常好的方
法[48],可利用 16S rRNA基因序列和各种指纹技术将未知菌株聚类到一个科或属里,然后根据这一组菌株的
特点选择某些代表性的标记基因进行 MLSA分析,从而进行种、亚种以及生态型的划分。 有时也可参考数据
库 MLST (http: / / www.mlst.net)或 PubMLST (http: / / www.pubmlst.org)进行一些病原微生物的多位点序列分
型方面的信息查询。 某些微生物之间的 16S rRNA基因序列几乎相同,但是 DNA 杂交值却明显低于 70%,因
此它们代表着不同的种。 16S rRNA 基因同源性低于 97%的菌株间其基因组 DNA 的相似性均低于 60%。
DNA鄄DNA杂交(DDH,whole genomic DNA鄄DNA hybridization) 实验操作复杂,不适合进行较大范围的系统分
类研究,因此 16S rRNA序列分析的结果可以说明是否有必要进行 DDH实验。 随着高质量序列数据的快速增
长,ANI(average nucleotide identity)作为一种很精确且方便使用的分类方法,应用越来越广泛[49]。
2.2摇 荧光原位杂交技术(FISH)
FISH技术是一种不依赖 PCR的分子技术,它结合了分子生物学的精确性和显微镜的可视性,可原位监
测和鉴定样品中不同的微生物个体,已经广泛应用于微生物定量分析和群落结构分析[50鄄51]。 FISH 的原理是
根据待测微生物的 16S rRNA基因中的保守序列,设计相应的特异性寡核苷酸探针,并进行荧光标记,通过探
针与环境基因组中的 DNA分子进行杂交,检测该特异微生物种群的存在和丰度。 利用分子遗传上保守性不
同的特异序列,可以在不同的分类水平(如属、种等)上进行检测。 当前的荧光探针安全且具有很好的分辨
力,如果使用具有不同激发和散射波长的荧光染料标记探针,可同时检测多个靶序列[52鄄53]。
FISH技术与其它方法结合能够更好地发挥优势,这些技术包括 microcolony鄄FISH、DVC鄄FISH、in situ PCR鄄
FISH、CPRINS鄄FISH、CARD鄄FISH、MAR鄄FISH等[53鄄54],其中 CARD鄄FISH技术很好地解决了目标微生物数量较
少时信号检测灵敏度低的问题[55]。 Behrens等利用 EL鄄FISH与 NanoSIMS技术进行了微生物群落中单细胞进
化分类和代谢活性的研究[56]。 FISH技术成功应用的关键在于设计和获得具有高灵敏性和专一性的寡核苷
酸探针以减少干扰,可使用 ARB软件包结合 probeBase数据库等多种方法进行探针分析和设计。 综合来看,
应用 FISH技术不仅能研究微生物群落的结构特征和空间分布,还可以跟踪微生物种群的动态变化,此外利
用 mRNA等作为目标分子还可以进行群落代谢方面的研究。
2.3摇 实时定量 PCR(qRT鄄PCR)
qRT鄄PCR是通过对 PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测实现对起始模板定量的分析,
具有特异性强、重复性好、准确快速等优点。 通常使用的荧光化学方法有 TaqMan荧光探针法和 SYBR荧光染
料法等。 许多因素都会影响 qRT鄄PCR 反应在定量上的准确性,如细胞裂解效率、抑制剂的去除程度、SYBR
Green玉的浓度、同源和异源 DNA背景、操作流程设计、目标基因的选择以及 PCR 产物的长度等,因此在操作
时需要优化条件,最大化地减小误差[57鄄60]。 各种 qRT鄄PCR方法都有其自身的优缺点,操作时需要根据实验设
计特点选择。 对于特定类群微生物也可使用一些功能基因代替 16S rRNA基因进行定量,如利用 mcr 基因定
量产甲烷菌[58]。 在绝对定量时,要用到标准样品,可以用带有特定基因的质粒,或者利用直接从环境样品中
扩增的 PCR产物做标准样品。 各种实验操作因素(不同反应批次的差异、加液误差等)对 qRT鄄PCR结果影响
很大,因此在定量多个环境样品时,最好能用 96或 384孔的反应板一次完成。
qRT鄄PCR既可以对微生物群落的总体进行定量分析,也可以对具体的种属进行定量研究。 某些种属的
16S rRNA基因分辨率较低,可使用一些功能基因进行定量,如使用特异的 invA 基因研究 Salmonella 属。 Liu
等设计了一种新的 qRT鄄PCR方法用于定量分析群落 16S rRNA基因的丰度,并分析了 rRNA基因拷贝数等对
定量的影响[13]。 qRT鄄PCR与其它技术相结合使用可更好地研究群落的结构和多样性,如指纹图谱技术、测序
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技术等[61]。
2.4摇 基因芯片技术
基因芯片技术的突出特点在于其高度的并行性、多样化、微型化和自动化。 基因芯片的测定结果与高通
量测序[62]、qRT鄄PCR[63]的结果有很好的一致性。 根据已知的基因序列信息,研究者们设计出了许多基因芯
片进行微生物群落结构和功能的研究,包括基因组芯片、功能基因芯片和系统进化芯片等,主要用于评估多样
性和鉴定病原菌等。 其中系统进化芯片(PhyloChip)是含有与 SSU RNA 基因序列互补的寡核苷酸探针的阵
列,适合于微生物群落结构组成和动态变化分析。 PhyloChip 已应用于研究人的肠道、口腔以及水体、土壤和
植物根系等微生物群落[64鄄66]。 利用微生物的功能基因作为探针开发出的功能基因芯片—GeoChip[67],已广泛
应用于检测各种环境样品中微生物群落的功能基因[68鄄69]。 基因芯片的信号扫描及数据处理有许多商业软件
可供使用,一些开源工具如 Bioconductor 平台( http: / / www. bioconductor. org / ) [70]和 R 语言( http: / / www. r鄄
project.org / )也常用于基因芯片的数据分析中。
在定性分析方面,基因芯片是根据已知的基因序列信息制作的,因此无法检测到未知的基因信息,也可能
检测不到那些丰度较低的基因。 检测范围较广的基因芯片由于探针数目太多易产生假阳性,设计特异性探针
能够克服这类问题,比如近些年来开发出专门用于检测人体微生物相关菌群的 HITChip[71]及用于检测口腔微
生物的 OC Chip[72]等。 在定量分析方面,由于某些菌 rRNA 基因操纵子是多拷贝的,而使测定的信号总量代
表的是 16S rRNA基因的总拷贝数,只有使用改进的算法才能更精确地进行定量分析[73]。 与高通量测序相
比,基因芯片方法实验费用低,数据分析过程相对简单,有时在研究特定的菌群和功能基因时,基因芯片技术
是一个较好的选择。 而高通量测序是一个“开放系统冶,可以探测到环境中新的基因信息,信息更加系统、丰
富,但需要利用生物信息学方法和生物化学知识对序列数据进行深入挖掘。
2.5摇 高通量测序技术
要全面系统地分析微生物的多样性,首先要获取 16S rRNA基因序列,如何快速准确地获取大量的序列信
息就显得很重要。 传统的 Sanger 测序方法操作复杂、通量低,难于解决这个问题。 2005 年,美国 454 Life
Science公司首先推出了革命性的基于焦磷酸测序法的高通量测序系统,将第二代测序技术推向了市场。 此
后,Illumina 公司和 ABI公司相继推出了 Hiseq和 SOLiD等测序平台。 现在利用高通量测序技术研究环境微
生物多样性的报道越来越多,这些系统的主要优点在于通量高,而且利用 Barcoded PCR技术使得在一次运行
中能同时进行多样本的大规模测序,使测序成本大大降低。 基于单分子测序原理的第三代测序技术也在迅速
发展,Helicos Biosciences公司推出了单分子 DNA测序仪 tSMS Performance, PacBio 与 ZSGenetics公司也在大
力研发新一代测序仪[74],第三代测序技术的进步将使测序更加快速准确,且能大大增加读长,而且可以直接
对 RNA测序。 表 2总结了几种最常用的高通量测序仪的主要技术参数。
表 2摇 目前常用的高通量测序平台的主要技术参数
Table 2摇 Main technical specifications of several pyrosequencing platform
测序仪类型
Platform
运行时间
Run time
读长 (bp)
Length (bp)
运行通量
Throughput
错误类型
Error type
Roche
454 GS FLX Titanium XL+
454 GS FLX Titanium XLR70
23h
10h
<1000
<600
臆700 Mb
臆450 Mb
Indel
Indel
Illumina
GAIIx
HiSeq 2000
MiSeq
14d
11d
65h
2伊150
2伊100
2伊300
臆95 Gb
臆600 Gb
13.2—15 Gb
Substitution
Substitution
Substitution
Life technologies
SOLiD 5500xl 8h 75伊35 PE <300 Gb (nanobeads) A鄄T bias
Ion Torrent
PGM 316 chip v2 4.9h 400 臆1 Gb Indel
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摇 摇 基于测序技术进行微生物多样性研究的方法主要有两种:一种是基于 16S rRNA基因的扩增子测序,另一
种是基于环境基因组 DNA的宏基因组测序,两种方法各有优缺点[75鄄76]。 相比之下,基于 16S rRNA基因的高
通量测序技术更加常用,并且消除了克隆问题,可以综合研究各个可变区,分析方法也相对成熟,不过在具体
的实验分析中也存在着一些问题需要解决,例如 PCR扩增的偏差、扩增错误、测序错误等都可能影响群落 琢鄄
多样性的准确估计[77鄄79]。 在 16S rRNA基因扩增子测序中, Roche GS FLX+测序平台理论读长最高可以达到
1000 bp,一块 PTP 板可获得超过 80 万条序列,而 Illumina 测序平台具有通量高的优点[80],使得 Miseq 和
Hiseq系列测序仪广泛用于微生物生态学研究中。 宏基因组测序无需 PCR扩增,既可以研究微生物的群落组
成和多样性,也可以反映群落的很多代谢特征,但数据分析相对复杂。
3摇 16S rRNA基因实验操作过程中的问题
3.1摇 核酸提取
环境基因组总 DNA的提取效率影响着对微生物群落组成的准确鉴定和定量分析。 核酸提取主要分为细
胞破碎、核酸沉淀以及后续纯化三个环节。 环境样品 DNA提取过程中,不完全的细胞裂解、基质对 DNA的吸
附、酶抑制剂的共提取以及提取过程中 DNA 或 RNA 的降解是主要的一些问题[81],尤其是土壤样品,提取
DNA或 RNA过程中往往浸提出腐殖酸物质,抑制 PCR 或反转录反应。 商业化的试剂盒(比如 MP 公司的
FastDNA Kit for Soil、Mo Bio公司的 PowerSoil DNA Isolation Kit等)能够部分解决此问题,不过价格较贵。 其它
成本较低的方法包括 SDS 裂解法、酶解法、玻璃珠破碎法及超声波破碎法等,这些方法提取的 DNA往往需要
后续再纯化以满足实验需要。 对于抑制物含量较高的土壤 DNA,可以用水稀释或利用 CTAB 方法进一步纯
化后再扩增。 研究表明,初步提取的 DNA利用 CTAB或 /和 PVPP 可以有效去除大部分抑制剂或杂质[82]。 针
对不同的环境样品,应该根据文献报道的相关结果对 DNA提取方法进行优化。 Canto等在研究污泥微生物时
使用不同的细胞直接裂解方法,获得了一种实用有效的 DNA提取方法[83];Kuczynski等建议在研究复杂微生
物群落时应使用多种方法进行细胞裂解[84];Flores等研究了一种新的直接 PCR法以简化 DNA提取步骤[85]。
对于粘性土壤,可以加入 skim milk 以提高 DNA 的提取效率[86]。 用试剂盒提取的 DNA,进行 qRT鄄PCR 实验
时的平行性往往优于自配试剂的提取方法。 在进行样品总 RNA 提取过程中,要特别注意污染和降解问
题[87],一些 RNA 酶抑制剂可以用于样品运输过程中的保存,以防止 RNA 降解,如 RNA later 和 Methanol /
HEPES溶液[88]等。 必须注意的是,要使结果分析重复性和精确性较高,在提取以及后面的操作过程中都要
严格控制污染问题,因为相比在测序和分析过程中引入的偏差,实验污染等问题可能对结果影响更大。
3.2摇 引物的选择
16S rRNA基因不同区域的保守度是不一样的,因此扩增区域的选择会影响多样性的分析结果[89]。 研究
者们从各个方面对引物的选择问题进行了分析,主要有引物长度、扩增长度选择、引物覆盖度等。 Cai 等发现
污泥微生物多样性分析与扩增区域有很大的关系,测序深度会影响低丰度细菌的鉴定[90]。 利用 27F / 338R
(V1—V2)引物,人们发现 Verrucomicrobia 类群在研究的土壤中数量相对较少,但改用 515F / 806R(V4)引物
后,发现土壤中该类群的丰度变大[91]。 理想的引物是能够尽量多地将环境样品中的基因扩增出来,同时又要
能够区分出不同的种属。 为了提高对环境样品 DNA扩增的覆盖度,可以设计简并性通用引物,即使这样,也
不能覆盖所有的菌群[92],而且,增加位点的非特异性可能会增大扩增偏差的概率。 表 3[93鄄101]列出了一些常用
的 16S rRNA基因的引物,不同的引物对不同种属的覆盖度不一样,某些引物对细菌有很高的覆盖率,某些专
门针对古菌,还有些是细菌和古菌通用的引物。
有的学者建议细菌与古菌群落应该分别用专用引物进行分析[102],而其他一些学者则直接使用细菌与古
菌通用引物[95鄄96]。 因此,在实验设计时需要考虑到实验目的而有针对性地进行选择,对不同的通用引物的覆
盖能力要有个大致的了解。 利用 454 GS FLX平台,测序长度可以达到 800bp,然而 PCR产物短时,得到的序
列数量多、质量好,所以一般选择 400 bp左右的扩增子进行测序。 目前看来引物的选择很大程度上还是要根
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据经验,没有统一的标准,V3—V5 区引物应用较多。 要根据测序平台的测序长度而选择适当的引物对,如
Miseq测序仪使用 V2 试剂盒时的测序长度在 250—300 bp 左右,通用引物 515F / 806R 是一个较好的选
择[103],但该引物得到的古菌序列数要比通用引物 515F / 909R低。
表 3摇 常用于扩增 16S rRNA基因的高通量测序引物对
Table 3摇 Some primer pairs for 16S rRNA gene amplification
适用的菌
Category
引物名称
Names
引物序列
Sequences
覆盖区域
Positions
参考文献
References
Universal U341F CCTAYGGGRBGCASCAG V3—V4 [93]
细菌和古菌 U806R GGACTACNNGGGTATCTAAT
Universal U515F GTGYCAGCMGCCGCGGTA V4—V5 [33]
细菌和古菌 U806R GGACTACHVGGGTWTCTAAT
Universal U515F GTGYCAGCMGCCGCGGTA V4—V5 [94]
细菌和古菌 U909R CCCCGYCAATTCMTTTRAGT
Bacteria细菌 B8F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG V1—V3 [95]
B533R TTACCGCGGCTGCTGGCAC
Bacteria细菌 U341F CCTACGGGRSGCAGCAG V3—V4 [96]
B785R TACNVGGGTATCTAATCC
Bacteria细菌 U341F CCTAYGGGRBGCASCAG V3—V5 [95]
B907R CCGTCAATTCMTTTGAGTTT
Bacteria细菌 B343F TACGGRAGGCAGCAG V3 [97]
B534R ATTACCGCGGCTGCTGGC
Bacteria细菌 U347F GGAGGCAGCAGTRRGGAAT V3—V4 [98]
U803R CTACCRGGGTATCTAATCC
Bacteria细菌 U519F CAGCMGCCGCGGTAATWC V4—V5 [99]
B926R CCGTCAATTCMTTTRAGTT
Archaea古菌 A349F GYGCASCAGKCGMGAAW V3—V4 [100]
A806R GGACTACVSGGGTATCTAAT
Archaea古菌 A344F ACGGGGYGCAGCAGGCGCGA V3—V5 [101]
A915R GTGCTCCCCCGCCAATTCCT
3.3摇 PCR扩增
PCR条件的选择对高通量测序结果影响很大。 在准备高通量测序用的 PCR 产物时,最好能用 HPLC 纯
化的引物,以减少非特异性扩增或短片段,现在很多商业公司多用 PAGE 纯化的引物。 PCR扩增时使用的模
版浓度、PCR的循环数、不同的聚合酶对微生物多样性结果也有影响[104]。 相比其它聚合酶,Finnzymes 生产
的 Phusion誖 High鄄Fidelity DNA Polymerase保真性高,常用于高通量测序时的 PCR 扩增;其它酶如 Agilent 公
司的 pfuUltraII的持续合成能力较强,产生的扩增产物变异较少,但价格较高。 降低扩增循环数(通常不超过
30 个循环)及使用高保真聚合酶可以减少扩增偏差。 通常对一个样品进行 PCR时要做技术重复并进行混合
跑电泳回收以减小扩增效率影响。 用带有 Barcode的高通量测序引物做 PCR时,通常会产生一些非特异性的
杂带,所以要对每个样品的 PCR 产物进行切胶纯化,这样才能保证不同 barcode 的 PCR 产物混合时定量准
确,以使不同样品获得的序列数大致相同。 市场上出售的很多胶纯化试剂盒都能满足纯化要求。 修补 PCR
(Reconditioning PCR),即第一轮 PCR在 20 个循环的扩增后,取少量模板,其它条件不变,再进行 5 个循环的
修补扩增,由于引物相对模板的浓度较大, 可以减少异源双链和嵌合体的产生[105]。
3.4摇 测序问题
样品量少、测序深度要求不高的情况下,传统的 16S rRNA克隆文库结合 Sanger 测序技术可以准确、快捷
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地产生结果。 目前常用的高通量测序法不需构建克隆文库,适用于样品量大或测序深度要求高的情况。 如果
利用罗氏公司的 454 GS FLX+平台,一般 400 bp左右的 PCR产物测序效率较高,质量较好,也能够满足系统
分类的要求。 一个 454 GS FLX+测序反应可测定多达 196 个样品,从而大大降低了单个样品的测序成本。 一
个反应一般测定 100—160 个左右的样品,每个样品理论上可以得到 5000—8000 条左右的序列,能满足大多
数环境样品的测序深度要求。 但是,由于溶液样品转移的误差和一些不明原因,往往有些样品得到的序列数
量过多或过少,对序列数过少的样品必需补测。 利用 Illumina 公司的 HiSeq 或 MiSeq 测序仪及 Ion Torrent 的
PGM研究微生物群落与最初的 454测序方法的过程基本一样。 Illumina公司的 HiSeq和MiSeq测序仪具有更
高的通量,读长则相对较短,新型的 MiSeq 测序仪可以产生 300 bp 以上的序列长度,一次可以测定 200 个以
上的扩增子样品,每个样品可以得到 2 万条以上的序列数,在微生物多样性研究中具有很大的应用潜力。
测序的精确性对数据的分析结果会产生不可忽略的影响[79],研究者们分别从测序错误对下游数据分析
的影响、检测错误的方法、定量控制方法、不同平台的错误类型等方面进行了综合研究。 虽然仍存在同聚物测
序易出错以及整体错误率相对较高的问题,但随着质量检测方法的改进、数据分析方法的优化及测序技术的
进步,高通量测序精度得到了很大的提高[79, 106]。 利用不同的测序引物从两端测序,以增加重叠区长度也可
减少测序错误[107鄄108],然而,即使这样仍有 40%—50%的测序产物不能准确地拼接。 Miller 等开发了一种算法
EMIRGE,可用于拼接 Illumina测序仪产生的短序列,从而组装出长的 16S rRNA基因片段,他们发现这种方法
可重复性好,分析群落变化时准确度较高[109]。
4摇 高通量测序数据的处理
高通量测序产生出了海量的 DNA序列数据,如何对这些数据进行生物信息学处理来提取有生物学意义
的信息是一个关键过程。 通过生物信息学处理,可以得到微生物群落的组成、结构、多样性及其与环境因子的
关系等方面的信息。 现在已经开发了一些专门针对 16S rRNA高通量测序数据处理的生物信息平台。 有些平
台允许上传数据,利用公共的服务器及相关在线工具进行运算。 但对于大容量数据,只有在本地计算机上运
算。 很多免费软件都是基于 Linux操作系统编写的,Perl、Python、R语言在生物信息学中也很常用,所以要求
操作者对这些知识有一些基本了解。
4.1摇 数据前期处理
高通量测序数据一般包含序列信息和测序质量数据,数据应该首先进行质量检查,去除质量不好(读长
异常、碱基识别模糊等)的序列,然后进行嵌合体检查,如果有叶绿体和线粒体序列的污染,应该先把这部分
序列剔除,随后二次随机采集相同数量的序列数,用来进行序列同源比对聚类[110]等,最后根据 OTU矩阵和赋
予的种属关系进行统计分析(图 3)。
每一步运算都有一些软件供选择使用,比如可用来进行序列比对的有 PyNAST、SINA、MUSCLE、ClustalW、
MAFFT、Blastn等[111鄄113],它们软件的算法各有特色,而且都在不断地得到改进。 ARB、BioEdit、DNAstar 等软件
包常用来进行序列编辑。 检测测序错误的算法主要有 PyroNoise、DeNoiser和 SeqNoise等[114鄄115]。
由于微生物群落组成复杂,产生的数据量巨大,因此不同的软件会被研究者们选择性地组合成软件包以
直接对原始数据进行更加方便系统性的分析,如 RDP忆s Pyrosequencing Pipeline[21]、QIIME[116]、Mothur[117]、
STAP pipeline[75]等,这些软件包各有优缺点,使用时需学习相应的操作命名、文件格式和使用特点,在进行具
体实验数据分析比较时也可根据需要合理地进行软件组合,这需要研究者们对软件的算法、计算机处理能力、
统计方法等有所了解。 如果使用克隆文库分析方法,在 16S rRNA基因克隆文库构建完成后,就可以对文库中
的克隆进行测序,使用 SeqMan、Sequencher 等软件可进行序列拼接。 BioEdit 是一个免费下载软件,可以在
Windows下使用,对处理一般序列数据包括高通量测序数据都很有帮助。 熟知各种生物信息学软件的特点才
能更合理高效地处理测序数据和数据的深度挖掘[78]。
4.2摇 去除嵌合体
高通量测序的数据中会存在一些嵌合体,数据处理时一定要去除这部分序列。 以往常用的嵌合体去除方
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图 3摇 利用 RDP平台分析环境样品高通量测序数据的技术流程
Fig.3摇 Pyrosequencing data analysis pipeline based on RDP platform
PCoA: principal coordinate analysis; CCA: canonical correspondence analysis; VPA: variation partition analysis
法如 RDP、Bellerophon[118]均不适用于高通量测序所产生的大量短序列。 近年来发展了一些新算法和程序,例
如 ChimeraSlayer[119]、Perseus[115]和 UCHIME[120]等都可用于嵌合体的预测。 嵌合体的识别主要是通过将短读
长序列与高质量参考序列进行比对来实现[115, 119鄄120]。 UCHIME适用于预测短读长高通量测序数据,其检测效
率高、运行速度快,是当前处理高通量测序数据较好的方法。 利用 UCHIME 识别 454 GS FLX+测定的土壤
16S rRNA序列(400 bp)中的嵌合体,发现大约有 1%—18%的序列为嵌合体。 在利用计算机软件识别嵌合体
时,自然界中 16S rRNA基因通过水平转移产生的嵌合体也可能被误认为是实验过程中产生的嵌合体而被去
除,PCR过程中产生的异源双链和突变序列也会对检测造成影响,因此应该不断更新数据库信息,优化实验
条件和软件算法,尽量减小偏差。
4.3摇 OTU计算
样本中 OTU数量和相对丰度代表实际观察到的多样性,因此计算不同样品中 OTU 的分布,是高通量测
序数据处理中一个非常重要的步骤。 计算 OTU之前,序列要进行比对(alignment)。 比对的算法有很多,聚类
(clustering)的方法也有多种,不同的软件所选择的算法各有不同,如 ESPRIT 平台应用成对比对法(pairwise
alignment) [121],RDP 利用 Infernal alignment 比对计算距离和完全连锁聚类法(complete linkage cluster)进行
OTU聚类,MUSCLE软件利用逐步比对方法(progressive alignment) [122]。 Barriuso等比较了各种方法计算多样
性的优缺点,发现 ESPRIT和 RDP 能够给出较一致和准确的结果[123]。 对于 OTU 计算分类,Uparse(http: / /
drive5.com / uparse / )是目前较好的方法[124],相比其它 OTU分类方法,其计算更快速,结果更准确,可以将该软
件组合到 QIIME分析流程中,也可以单独使用。目前来看,OTU计算复杂、运算速度较低并且需要较大的储存
空间是一大难题,因此需要对计算方法进一步改进[125鄄126]。
4.4摇 系统进化分类
常用的系统进化分类数据库有 RDP、Greengenes、SILVA和 NCBI等,国际著名数据库 RDP 中的分类系统
是最常用的。 分类的基本过程是将测定的序列与数据库中已知的序列进行比对,确定其系统进化分类的位
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置[127鄄128],这种方法具有效率高、稳定性好的优点。 也可以先根据整个测序数据中的各个序列之间的相似性
程度进行 OTU 聚类[117, 121],之后根据不同 OTU 的代表序列使用 RDP classifier 等工具进行数据库搜
索[116, 129],对 OTU进行种属分类,然后进行后续分析。 OTU 的划分与分类水平之间的关系是很难准确界定
的,通常是将相似性大于 97%的序列归为一个 OTU,不同类型菌群的相似性阈值也存在差异[130鄄131];另外使用
其它不同的标志基因进行系统分类时 OTU阈值的设定也各不同。 系统分类研究是进行各种微生物学研究的
基础,通过各种方法对原核生物精确分类和确定典型菌株具有重要意义[132],不断更新的 LTP (All鄄Species
Living Tree Project)搜集了大量的来自于典型菌株的序列数据并提供了根据已有的 SSU rRNA 基因序列所重
建出的系统进化树作为参考[133],这些数据可被下载到 ARB程序包中以方便序列比对、序列编辑等操作。
4.5摇 进化树构建
微生物群落的多样性分析有时要用进化树来显示。 构建进化树的主要过程包括获取序列数据、确定进化
距离模型、进行多序列比对、根据比对结果提取信息、选择建树算法与参数构建进化树。 进化树的构建基于距
离的方法有 UPGMA (unweighted pair鄄group method using arithmetic averages)、ME (minimum evolution method,
最小进化法)和 NJ(neighbor joining,邻接法)等,其它的方法包括 MP(maximum parsimony,最大简约法)、ML
(maximum likelihood,最大似然法)以及 Bayesian推断等方法。 一般来讲,如果模型合适,ML 的效果较好,但
相对耗时。 对于相似度很低的序列,NJ往往出现长枝吸引现象。 对近缘序列,可选择 MP,其用的假设最少,
MP 一般不用在远缘序列上。 基于 16S rRNA 基因的研究常用的参数模型有 Kimura2、Jukes鄄Cantor 等。 虽然
有研究者对各种进化树构建方法的准确性进行了探讨[134],然而进化树分析相当复杂,很难精确地比较,经常
要根据经验选择合适的参数模型和建树方法。 有时可用不同的方法构建进化树,如果所得到的进化树结构相
似,说明结果较为可靠。 表 4列出了常用的与进化树构建相关的软件和特点,其它进化树构建软件可参考网
站(http: / / evolution.genetics.washington.edu / phylip / software.html)。
表 4摇 部分进化树构建软件的特点
Table 4摇 Some tools for phylogenetic tree constructions
软件
Software
算法
Algorithms
特点
Characteristics
网址
Website
ARB NJ,MP,ML 多功能软件包,系统进化分析功能齐全,可进行比对、编辑等,多种算法可供选择 http: / / www.arb鄄home.de
Fast Tree ME,ML,NJ 建树速度较快 http: / / www.microbesonline.org / fasttree
MAC5 Bayesian 基于贝叶斯方法的建树工具,后验概率对先验概率的设置比较敏感 http: / / www.agapow.net / software / mac5
Mayas Bayesian 可以将核酸序列以及形态学观察结果等整合到数据文件中进行综合分析 http: / / mrbayes.csit.fsu.edu
MEGA NJ,MP 图形化软件,可以通过网络进行序列的比对和数据搜索 http: / / www.megasoftware.net
PAML ML 进化参数估计、进化假说检验、分歧时间估计、正选择估计等 http: / / abacus.gene.ucl.ac.uk / software / paml.html
PAUP MP,ML 通用的构建系统进化树的商业软件 http: / / paup.csit.fsu.edu
PHASE ML, Bayesian 参数模型考虑了 rRNA的二级结构 http: / / www.bioinf.man.ac.uk / resources / phase
PHYLIP NJ, MP, ML 命令行格式,功能强大 http: / / evolution.genetics.washington.edu / phylip.html
PHYML ML 最快的 ML建树工具 http: / / www.atgc-montpellier.fr / phyml
通常构建完进化树后需要做 Bootstrap检验,如果检验值过低,所构建进化树的拓扑结构可能存在问题。
对于丰度很高的微生物群落,如果得到的序列数太多,就很难建树,也难以对结果进行图形化显示以及总体分
类特点的比较[121],有时即使能够构建出复杂的进化树,也会因为分支太多而无法分析[135],因此图形化显示
复杂系统的物种进化关系一直是个难点[136]。 VITCOMIC( http: / / mg.bio.titech.ac.jp / vitcomic / )能够分类显示
基于大量 16S rRNA基因序列分析基础上的群落组成特征[137],相比其它工具,其最独特的功能是可直观地比
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较样品间分类组成上的差异。
4.6摇 微生物群落数据的生态学统计分析
传统的基于分类关系的群落数据分析主要有:琢鄄多样性分析(Chao1, Simpson index, Shannon index,
rarefaction curves等)、物种丰度差异分析、样品物种分布、茁鄄多样性分析(Cody index, Sorenson index, Bray鄄
Curtis index, Morisita鄄Horn index)等。 结合群落结构和系统进化信息的 琢鄄多样性分析有 Faith 系统发育多样
性(Faith忆s phylogenetic diversity) 、平均成对系统发育距离(MPD)、平均最近类群距离(MNTD)、物种多样性
矩阵、二次熵、 系统发育关联性回归等;茁鄄多样性分析包括了 phylogenetic Sorenson index, UniFrac distance
metric, 群落间 MPD和 MNTD计算[138鄄140]等。 研究环境因子和群落关系的分析方法有稀疏曲线分析、 物种鄄
环境回归分析、多元统计分析等。
多元统计分析方法已广泛应用于多种分子生物学技术的数据分析中,如指纹图谱、基因芯片、高通量测序
等[39]。 多元统计分析方法中探索性的方法有聚类分析、主成分分析(PCA)、对应分析(CA)、去趋势对应分析
(DCA)、非度量多维标度(NMDS)等,NPMANOVA、ANOSIM 等可用于检验样品组间的差异显著性;解释性的
方法有冗余分析(RDA)、典范对应分析(CCA)、线性判别分析、方差分解分析(VPA)、Mantel test 等[141鄄142]。
各种方法在实际研究中都有其使用条件,需根据不同的研究目的、环境因子及实验设计选用合适的方法,例如
当环境梯度中 OTU类别相差较大时或主成分不能解释大量变异时,PCA可能不适合,可考虑 CA或 NMDS 等
其它方法。 对于基于距离矩阵的方法来说,距离度量方法的选择有时可能要比排序方法的选择更为重
要[143]。 在微生物生态学研究中要正确使用这些方法需要熟知方法的原理、特点及输入的数据类型[141]。 对
群落组成数据进行统计分析时需正确运用统计方法,比如要检验 茁鄄多样性形成和维持因素的假说时,若数据
不满足多元正态假设就不能使用依赖于多元正态假设的显著性检验,而有时需对数据进行转换以满足正态
假设。
在微生物生态学研究中,基于系统进化信息的多样性研究比单纯的分类多样性、功能多样性分析信息量
更大,从而得到了更广泛的应用[140, 144鄄145]。 基于系统发育信息的数据分析方法中常使用 UniFrac 分析[146],输
入的数据可以是不同序列的存在与否的数据(定性)或不同序列的丰度数据(定量,weighted) [147]。 UniFrac 方
法也在不断地发展,如 Fast UniFrac[135]在数据处理的许多方面都进行了优化,加入了很多新功能;VAW鄄
UniFrac在加权方法上进行了改进[148]。 在具体的数据分析中需根据目的选择软件和方法,例如要调查微生
物群落特征与环境因子的关系,首先要将各环境参数标准化,然后可以计算不同样品间 Euclidean 距离等,形
成相似性系数矩阵。 可利用 R或 PASSaGE软件包中的 Partial Mantel tests方法计算 UniFrac距离与环境因子
参数的关系[149]。 利用 CCA、RDA等鉴定对微生物组成重要的环境因子,用于方差分解分析,以估算不同环境
因子对群落变化的贡献率,这些运算程序可以在 vegan 程序包(http: / / vegan.r鄄forge.r鄄project.org / )中找到,在
R环境中运行。 其它还有很多统计分析软件如 SONS、Tree Climber、CANOCO等[150鄄151]以及其它复杂数据的分
析方法如偏最小二乘路径模型、网络分析和机器学习[152鄄153]等,可以根据需要灵活应用。 准确的实验设计和
数据分析方法对于生态理论的阐述至关重要,因此,在研究微生物生态学领域的理论问题如物种分布格局、多
样性时所获取的数据一定要准确合理,统计方法使用得当,这样才能分析出正确的生态学结果。
5摇 总结与展望
微生物生态学的研究领域非常广泛,本文主要讨论了 16S rRNA基因在微生物群落生态学领域中的应用,
微生物独特的生理生化特点使得微生物生态学领域的数据获取和分析相比其它生态学领域要复杂很多[154]。
虽然基于 16S rRNA基因的微生物多样性研究已经取得了巨大的进展,不过仍存在一系列问题,如数据库中部
分序列数据不够准确,同一基因组中含有多拷贝 16S rRNA 基因和序列异质性的问题,生态理论模型发展不
足,实验操作存在诸多影响因素等,正确分析这些问题才能更好地指导我们进行微生物生态学研究。 虽然基
于 16S rRNA的环境微生物学研究方法最为常用,但是以 16S rRNA 基因为基础的分子生物学技术并不能完
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全代替其它的微生物生态学研究方法。 综合利用这些技术和方法,更加有助于揭示微生物群落的重要特征,
加深我们对难培养微生物功能特点的认识。 未来的研究方向可能会集中在以下几个方面,(1)新技术新方法
的应用:纵观生物学发展史,许多新技术的产生都给生命科学带来革命性的进步。 基于高通量测序技术发展
起来的宏基因组和宏转录组技术等为微生物生态学研究提供了强大的手段。 对于当前的二代测序技术的应
用来说,优化实验步骤仍然是一重点,当然生态模型的研究也不可或缺;(2)各种研究方法的有机结合:微生
物生态学研究进入了多学科交叉阶段,要获得较大突破需要许多学科的共同进步,因此应该大力发展交叉学
科,特别是生物信息学,并将其成果广泛应用于微生物生态学研究中[155]。 自然生态环境的取样研究、定位观
测与实验室中的控制实验相结合[154]能更好的进行生态理论上的探索研究;(3)大规模综合性研究:继续开展
类似 HMP 计划[156]、EMP 计划[157]等大规模的与微生物多样性有关的综合性研究对于探讨微生物多样性所蕴
含的生物学意义相当重要,将微生物群落特征、环境因素和生态学模型等结合起来,借鉴已有的植物和动物生
态学理论[158],能为了解微生物群落结构的普遍模式和发展新的微生物生态学理论提供重要的指导思想。
参考文献(References):
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