全 文 ：第 ! 卷第 # 期
#$%% 年 & 月
生"物"加"工"过"程
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收稿日期"#$%$ 6$! 6#$
基金项目"暨南大学自然科学基金资助项目#%$!$8(70$$8&$
作者简介"凌辉生#%!3%$&男&江西贵溪人&硕士研究生&研究方向"蛋白质工程(李任强#联系人$&教授&@FPBQE"AOaEQfeCI*JKI*HC
修饰血红素提高血红蛋白类过氧化物酶活性
凌辉生&李"阳&封"琳&李任强
#暨南大学 生物工程学系&广州 %$7&#$
摘"要"利用苯酚或对羟基联苯对血红蛋白的血红素辅基进行化学修饰&将修饰后的血红素与脱辅基血红蛋白进
行重组得到新的血红蛋白 以光吸收扫描分析修饰血红素和重组血红蛋白&证明新的重组血红蛋白构建成功 酶
活力测定表明&修饰血红素得到的重组血红蛋白的类过氧化物酶活性都比天然血红蛋白的酶活力高&用对羟基联
苯修饰血红素得到的重组血红蛋白的酶活提高明显&约是天然血红蛋白的 %j7 倍
关键词"化学修饰(血红素(血红蛋白(过氧化物酶(酶活力
中图分类号"+0""""文献标志码"Y""""文章编号"%78# 6&783##$%%$$# 6$$73 6$0
)J942W./; 9042G.H510F6.b05:E.W.EM 27-0J2;62K./KM 40:2JK././;
-0J2;62K./31./; :-0J.:56M J2H.7.0H-0J0
U,-W.IQ(=JCM& U,]BCM& [@-WUQC& U,bJCaQBCM
# J^)BOAPJCADN\QDAJH=CDEDMX&TQCBC SCQZJO(QAX&WIBCM<=DI %$7&#&9=QCB$
*K1E45:E"d=J)=JCDEDO0F;Q)=JCXEDELB(I(JK ADPDKQNXA=J=JPJ*d=JPDKQNQJK =JPQC MODI) LB(OJHDPF
;QCJK LQA= B)DF=JPDMED;QC AD)OJ)BOJCDZJEBOAQNQHQBE=JPDMED;QC*Y;(DO)AQDC ()JHAOBE(HBC KJPDC(AOBAJK
A=BAA=JBOAQNQHQBEOJHDP;QCJK =JPDMED;QC(LQA= PDKQNQJK =JPJLJOJD;ABQCJK*@G)JOQPJCABEOJ(IEA(
(=DLJK A=BAA=J)JODGQKB(JFEQcJBHAQZQAXDNPDKQNQJK =JPDMED;QC(LB(JC=BCHJK HDP)BOJK LQA= A=BADN
CBAQZJ=JPDMED;QC*YCK A=JJC
L0M I24H1"H=JPQHBEPDKQNQHBAQDC( =JPJ( =JPDMED;QC( )JODGQKB(J( JC
体内&是细胞内过氧化物的清除剂&具有保护细胞)
抗氧化)抗衰老等作用&在食品和化妆品的添加剂
及生化试剂等领域有着广泛的应用 此酶易变性
失活&反应条件苛刻&天然酶价格昂贵&因此&关于
此酶模拟酶的研究和利用成为了关注点
血红蛋白#.;$存在于许多动物血液中&含量
高&来源丰富 此类蛋白是一种含血红素蛋白&在
生物体内起着传输氧)分解 .
#
5
#
)传递电子等与氧
和能量代谢有关的重要生理作用&也具有一定的类
过氧化物酶的活性 对血红蛋白的研究已较深入&
对其结构)输氧功能以及蛋白质分子与电极之间电
子转移过程的机制等都有很多研究&也有少量涉及
其类过氧化物酶活性*% 6#+和关于提高血红蛋白类过
氧化物酶活性的研究
在含血红素的酶的研究利用中&对酶的辅因子
进行化学修饰是改变酶生物功能的一种很好的途
径 例如&.BXB(=Q等*& 60+用人造功能基团修饰血红
素丙酸基侧链而提高肌红蛋白的过氧化物酶活性(
4DCM等*+通过化学修饰血红素丙酸基侧链而提高
辣根过氧化物酶的催化活性以及在有机溶剂中的
稳定性(dDOJ(等*7+报道了化学修饰血红素侧链提
高血红蛋白在有机溶剂中的亲和力 在这些研究
的基础上&本研究拟探讨通过血红蛋白辅因子化学
修饰法对血红蛋白进行分子水平的改造&利用苯酚
和对羟基联苯对血红蛋白的血红素辅基上的羧基
基团进行化学修饰&以期能得到类过氧化物酶活性
增强的模拟酶
C?材料与方法
CNC?材料与仪器
材料"实验兔#用于取血红蛋白$&暨南大学实
验动物中心(氯化血红素&4QMPB公司(苯酚)对羟基
联苯&广州化学试剂厂(双环己基碳二亚胺# 9^9$)
0 二甲氨基吡啶#^` Y>$&阿拉丁试剂#上海$有限
公司($j$03 h$j$8 PP硅胶粉&青岛海洋化工厂分
厂(4J)=BKJGW # 凝胶&北京鼎国生物技术有限公
司(其他试剂均为国产分析纯
仪器"WDEK 4)JHAOIPEB; 0 型紫外分光光度计&
上海棱光技术有限公司(4JZJC@B(X型酸度计&梅特
勒 托力多仪器#上海$有限公司(.^ #$$% \ 9
型核酸蛋白检测仪&上海嘉鹏科技有限公司(\b0Q
高速冷冻离心机&d=JOPDJEJHAQDC公司
CN@?方法
%j#j%"脱辅基血红蛋白#Y)D.;$的制备
参照文献*8+的方法进行 取一定量的兔血红
蛋白&加入过量 %j&倍的_
&
[J#9-$
7
&缓慢搅拌约 %$
PQC&制备得高铁血红蛋白 # J`A.;$ 取 &j PU
J`A.;&用稀.9E调 ).至 #j%&加入等体积的预冷丁
酮萃取血红素&离心去除含血红素的丁酮后又加丁酮
直至上层丁酮无色为止 得到蛋白溶液分别用
PPDE:U-B.95
&
).
#
5和 %$$ PPDE:U磷酸缓冲液
透析&除去.9E和丁酮 最后于 0 k) 3 $$$ O:PQC离
心 %$ PQC&取上层清夜&即得Y)D.;
%j#j#"血红素衍生物的制备#化学修饰血红素$
按文献* 67+的方法进行 已修饰的血红素
经真空干燥浓缩得到固体血红素 一种为苯酚修
饰&另一种为对羟基联苯修饰
%j#j&"血红蛋白的重组装
参照文献* 67+的方法进行&将适量的血红素
衍生物溶解于 %$ PPDE:U)含 #g无水二甲氨基甲酰
胺#^` [$的磷酸缓冲液中&轻轻搅拌并缓慢滴加
Y)D.;到血红素溶液中&0 k下持续搅拌 & = 后用
试样对 %$$ PPDE:U磷酸缓冲液进行透析&除去未结
合的血红素及 ^` [ 经部分浓缩后将重组装血红
蛋白上样到 4J)=BKJGW # 层析柱中提纯&用 %$$
PPDE:U磷酸缓冲液洗脱&收集试样 本实验获得 &
种不同血红素的重组装血红蛋白&一种为苯酚修饰
血红素重组装血红蛋白&以 )=JCDEF.; 表示(一种为
对羟基联苯修饰血红素重组装血红蛋白&以 0F;QF
)=JCXEDEF.; 代表(另一种是对照品&使未经修饰的
氯化血红素与Y)D.;重组装&为未修饰血红素重组
装血红蛋白&用9EF.;表示
%j#j0"过氧化物酶#>5^ $活性测定
采用邻苯二胺#5>^ $法*3+并据本实验实际情
况进行 一支试管中加入% PU)&$g .
#
5
#
(另一支
试管加入 # PU)#$ PPDE:U的邻苯二胺和待测试样
%$
"
U(将 # 支试管溶液混合摇匀&立即倒入 % HP的
比色皿中 在 0#7 CP处进行时间扫描&读取 $ h&
PQC时的吸光值&并计算它们的差值
(
9o9
&
69
$
和
每分钟产物形成的量#9:PQC$ 待测试样包括天然
血红蛋白#.;$)未修饰血红素重组装血红蛋白#9EF
.;$))=JCDEF.; 和0F;Q)=JCXEDEF.; 每个试样的测
定做多次重复 酶活以比酶活表示&即以单位质量
的酶蛋白在单位时间内催化底物形成产物的量来
表示&单位为S:#PQC!PPDE$蛋白&各血红蛋白试样
的浓度测定方法如下"血红蛋白试样 % PU&加入 %
PU水和 $j3 PU吡啶&与 %j# PU%PDE:U的 -B5.
混合后&加少许连二亚硫酸钠固体&摇匀使试样呈
红色&置于比色皿中测定在波长 88 CP处的吸光度
9&按4o9x&0 p0 经验公式算出血红蛋白的浓度
#实为血红素的浓度$
@?结果与讨论
@NC?*92"K的制备
在酸性条件下&结合于血红蛋白分子中的血
红素很容易从蛋白分子中分离出来 利用高铁
血红素在丁酮中的溶解度大大高于在水中溶解
度的性质&用多次丁酮萃取法将血红素从蛋白分
子中分离出来 得到的脱辅基血红蛋白的吸收
光谱如图 % 所示 由图 % 可知"血红蛋白中血红
素在波长约 0%$ CP处的特征吸收峰已基本消
失&说明血红素已脱离蛋白分子&Y)D.; 制备
成功
!7"第 # 期 凌辉生等"修饰血红素提高血红蛋白类过氧化物酶活性
图 C?脱辅基血红蛋白和血红蛋白的紫外 可见吸收光谱
U.;=C?
@=@?血红素的化学修饰
经过化学修饰的血红素和氯化血红素的吸收光
谱如图 #所示 由图 #可知"由于修饰的是卟啉环的
侧链基团&对血红素吸收光谱的影响有限&故修饰前
后血红素的吸收光谱变化不是太明显&但还是可看出
修饰前后在波长约 &0 CP处稍有差别(对每一波长
点读数&发现氯化血红素的最大吸收峰在 &3! CP处&
而苯酚和对羟基联苯修饰的血红素的最大吸收峰分
别是 &37 CP和 &38 CP&发生了移动 这些都表明苯
酚或对羟基联苯对血红素已产生了修饰
图 @?修饰与未修饰血红素的紫外 可见吸收光谱
U.;=@?
@=O?血红素衍生物和*92"K的重组装
以未修饰血红素与脱辅基血红蛋白重组装后&
其血红素在波长约 0$ CP处有特征吸收峰&而纯血
红素分子的吸收峰是在约 &!$ CP处&所以重组装血
红蛋白是否成功可由纯血红素光吸收峰的变化而
看出 各重组血红蛋白的紫外 可见吸收光谱如图
& 所示 由图 & 可知"& 个重组装血红蛋白都在约
0$ CP处有吸收峰&且吸收峰波长基本一致&表明
修饰后的血红素衍生物进入到了 Y)D.; 的血红素
空腔中*!+ &重组装成功
图 O?各重组装血红蛋白的紫外 可见吸收光谱
U.;=O?
@=P?类过氧化物酶活性的测定
天然和各重组血红蛋白在水相中的类过氧化
物酶活力测定结果列于表 % 由表 % 可知"天然血
红蛋白的酶活比重组血红蛋白的要高&但若血红素
经修饰后再重组&则血红蛋白酶活得到了提高(以
苯酚修饰血红素得到的重组血红蛋白酶活的提高
并不太明显&而用对羟基联苯修饰血红素得到的重
组血红蛋白则酶活提高明显&约是天然血红蛋白酶
活的 %j7 倍
表 C?天然和各重组血红蛋白试样的酶活
D5K60C?X042G.H510F6.b05:E.W.EM 27/5E.W05/H
40:2JK./0H-0J2;62K./1
试样
4:
#PPDE!U
6%
$
(
9
比酶活:
#S!PQC
6%
!PPDE
6%
$
.; $j$#% %j$0 %#*!8
9EF.; $j$#8 %j%&! %%j%0
)=JCDE.; $j$# %j#! %0j%%
0F;Q)=JCXEDE.; $j$%! %j0%! #$j80
@=Q?讨论
血红蛋白分子具有类过氧化物酶活性主要依
赖于其活性中心的血红素&所以&对血红素进行化
学修饰就有可能提高其酶活力 本研究分别以苯
酚和对羟基联苯对血红素进行化学修饰&并用修饰
后的血红素衍生物与脱辅基血红蛋白重组装得到
新的血红蛋白分子&酶活力测定结果表明新的血红
蛋白的类过氧化物酶活性发生了改变&基本达到了
研究目的 酶活性中心常为酶分子的凹穴&此处多
为非极性或疏水性的氨基酸或辅基 本实验重组
装血红蛋白时在活性中心引入一个大体积的疏水
$8 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
性苯环结构&增加了活性位点的疏水性&因此&就可
能增加了疏水性底物在活性中的分配系数&即增加
了底物与活性中心的亲和性&从而提高了酶的催化
活性*%$+ 类似推论在血红蛋白*7+ )肌红蛋白*%% 6%#+
和辣根过氧化物酶*+的辅因子修饰研究中也有报
道 本实验中&重组血红蛋白催化性能得以改善&
明显的原因是由对羟基联苯修饰的血红素作为辅
基&可能对羟基联苯修饰的血红素衍生物的疏水性
更强&或它的结合使整个酶活性中心的疏水性增
强&但个中机制还需要探讨
O?结论
通过化学修饰使苯酚或对羟基联苯与血红素
辅基上的羧基基团反应获得血红素衍生物&将它们
与脱辅基血红蛋白重组装&光谱分析等说明已成功
获得变异血红素的重组血红蛋白 酶活力测定表
明&利用苯酚或对羟基联苯修饰血红素得到的重组
血红蛋白的类过氧化物酶活性都比天然血红蛋白
的酶活力高&特别是用对羟基联苯修饰血红素得到
的重组血红蛋白酶活提高明显&约是天然血红蛋白
的 %j7 倍
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的研究* +^*广州"中山大学&#$$3*
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%8"第 # 期 凌辉生等"修饰血红素提高血红蛋白类过氧化物酶活性