全 文 ：第4卷第3期 生物加工过程 Aug．2006
2006年8月 chineseJ0umalofBi叩IDcessE画neering ·“33．
大杯伞华农2号菌株液体培养产生漆酶条件的研究
韩君莉1’2，郭丽琼2，周伟坚2，林俊芳1’2，柳哗2
(1．华南农业大学 生物质能研究中心 广州510642；2．华南农业大学食品学院 广州510642)
摘 要：大杯伞(cf岫，懈iM)华农2号菌株具有分泌漆酶的能力，与静止培养相比，以110r，nlin摇床培养能明
显促进大杯伞华农2号茵株漆酶的分泌。以25∥L可溶性淀粉为碳源，2．O∥L酪蛋白胨为氮源，铜离子添加量为
0．1mm出L进行液体培养，有利于大杯伞华农2号菌株漆酶的分泌，最高酶活可达到713u／L。
关键词：大杯伞；漆酶；液体发酵
中图分类号：Q554 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2006)03—0033一05
optiInizationofHqllidcuItureo明：lditionsforlaca弱eproduction
0fbasim伽nyceteC跏c：归口m觚切mstrainsc跏一2
HANJun．1一GUon．qi伽孑，ZHouWeⅫan2，uNJun．胁91”，uuYe2
(1．CenlerforBionlassE【燃帮ReseaIch，Sou出C11inaA鲥culturalUniv商ty，GuaIlgzhou510642，Ckna；
2．伽egeofFbodscience，Soutll蕊|】aA卯c山t蒯嘣veIs蚵，Guangzbl510642，嘶na)
Abs咖ct：“quidc ltuI℃conditionswe弛optirni蒯florthe1accasepIoductionusingai舂Dc，惋m∞初碱strain
se朴2．Resultsindica_础thatshake—naskculturewim110√m洒couldaccel麟娅laccasepn碣uctionsi伊ifi—
cantlycompa捌tothestationa叮cultul℃．强e胧Ⅸimumlaccasectivityof713U／Lwasachievedun erthe
conditio璐of25∥L0fsolublestarchascarbons叫I℃e，2．0∥Lofcaseinas itmgensource，0．1n蛐【0l／Lof
c叩perionas蒯additive．
Key删稠s：cj如Dc拍g眦耽im口；t丑ccase；1iquidulture
漆酶(kcase，EC1．10．3．2)是一种含铜的多酚
氧化酶，和植物中的抗坏血酸氧化酶、哺乳动物的血
浆铜蓝蛋白同属蓝色多铜氧化酶(blue咖lti．c叩per
oxidase)家族[11。漆酶广泛分布于真菌分泌物、高等
植物[圳、少量细菌障6]和昆虫171中。按其来源主要
分为漆树漆酶、真菌漆酶和细菌漆酶协J。漆酶具有
较强的氧化还原能力，例如漆树漆酶能够催化木质
素的聚合过程，而真菌漆酶则能催化木质素的降解、
去除有毒化合物的毒性作用、促进真菌色素的合成
等，因此，真菌漆酶在环境保护、生物检测、造纸工
业、食品工业等领域具有广泛的潜在应用前景[9]。
大杯伞(眺￡硼em似锄)是80年代驯化成功
的食用菌新品种，隶属于担子菌纲，伞菌目，口蘑科，
杯伞属[10I。大杯伞又名大漏斗菌，菇体口感清香脆
嫩、营养丰富，是一良好的菌类蛋白源，必需氨基酸
含量占总氨基酸含量的43％，尤其第一限制氨基酸
(蛋氨酸)含量明显高于蘑菇，平菇，香菇，草菇等菌
种㈨。
本课题组从实验室现有菌株及野外采集的华南
地区特色菌株共200多种菌株中筛选出具有较强分
收稿日期：2006聊姐
基金项目：广东省科技攻关项目(2003c3120r7，2004820101001)；广东省自然科学基金课题(5006680)
作者简介：韩君莉(1981．)，女，山东烟台人，硕士研究生，研究方向：生物转化和生物加工。
联系人：林傻芳，教授，博士生导师，Bm鲥：lj彬@seⅫ．如．∞
万方数据
·34· 生物加工过程 第4卷第3期
泌漆酶能力的大杯伞华农2号菌株，本文以大杯伞
华农2号菌株为研究对象，着重研究了液体培养条
件对大杯伞华农2号菌株漆酶分泌的影响。
l材料与方法
1．1 菌种
大杯伞(cfi蜊e，麟i懈)华农2号菌株由华南
农业大学食品学院生物工程系生物转化和生物加工
实验室从许多菌株中筛选获得。
1．2培养基
1．2．1PDA种子培养基(1L)
新鲜马铃薯200g，煮沸30IIlin，用纱布过滤，冷
却后再加入葡萄糖20g，KH2P04l g，Mgs04·7H201
g，V。，10嘴，琼脂20g，加蒸馏水定容到lL，12l℃
灭菌20rnin，冷却。
1．2．2漆酶菌种初筛培养基(1L)[121
P【)A培养基中添加质量浓度0．04％的愈创木
酚。
1．2．3产酶培养基(1L)n3]
葡萄糖10g，酵母膏2．0g，KH2P040．17g，
M荫04。7H200．44g，CaCl2‘2H20O．37g，吐温80O．5
mL，微量元素溶液80lTlL。121℃灭菌20“n，冷却。
微量元素溶液(1L)M萨04·7H203．0g，MnS04·
H20O．5g，CoCl2。6H2O0．1g，ZnS04。7H2O0．1g，
CuS04。5H200．1g，KAl(S04)2。12H2010Illg，HB031
mg，Na2M004。2H2010Ⅱ唱o
1．3实验方法
1．3．1漆酶菌种的初筛
用PDA—Bavend黜·方法进行漆酶菌种的初筛，
在初筛培养基中接种活化的带有菌丝的琼脂块，30
℃避光培养，观察有无红褐色晕圈生成[12J。
1．3．2产酶培养
在无菌超净台中，用打孔器取直径为O．8锄的
菌丝块6块，于250rIlL三角瓶中(含有100lllL产酶
培养基)，每个梯度两个重复，30℃培养4d后测定
漆酶活性，之后每隔1d取样1次测定漆酶活性。
1．3．3漆酶活性的测定
1．3．3。1最大吸收波长的确定
将酶液与AB偈的反应液于uV．2450紫外可见
分光光度计200—800咖范围内进行扫描，确定反
应液的最大吸收波长。
1．3：3．2漆酶活性的测定[141
以0．5nllTlol，LA瞵作为反应底物，在pH4．5
柠檬酸一柠檬酸钠缓冲体系中，加入适量酶液，30
℃反应5min。予紫外分光光度计上420砌处测定
反应吸光值的变化。定义每分钟转化1伽均l的底
物所需的酶量为一个酶活力单位。根据吸光度法测
出的吸光度变化值，取吸光值变化的线性部分，运用
以下酶活力计算公式计算漆酶的酶活力。
漆酶活力(u，L)=瓦{鬟‰×酶液稀释倍数
式中：e伽(AⅨ晤)=3．6×104mol／cm
△￡——1min：
△0D——1rnjn内，吸光度DD的变化值；
¨——酶反应中，反应液的总体积，3
InL：
坎——酶反应中，酶液的体积(mL)。
2结果与分析
2．1 菌种初筛
用PDA—Ba_vendamn方法进行大杯伞华农2号菌
株漆酶分泌的初筛结果如图l所示，有红褐色晕圈
生成，表明大杯伞华农2号菌株生长过程中是分泌
漆酶的。
嗣l大杯伞华农2号菌株漆酶分泌的初筛图
Fig．1Guaiacol8sindicatortes蛀fycf彘呵挺，船∞打嬲
sn试ns咖-2lacca8epI妣tion
2。2最大吸收波长的确定
将大杯伞华农2号菌株分泌的粗酶液与AB偈
的反应液于UV．2450紫外可见分光光度计200．800
m范围内进行扫描，如图2所示。
由图2可得，大杯伞华农2号菌株分泌的漆酶
与AB佟反应液在420nrn处有最大吸收，因此本实
验选择420啪处进行漆酶活性的测定。
万方数据
2006年8月 韩君莉等：大杯伞华农2号菌株液体培养产生漆酶条件的研究 ·35．
2．3摇床和静止培养方式对大杯伞华农2号菌株
漆酶分泌的影响
在接种量和其他培养条件相同的情况下，采用
摇瓶培养(10∥lIlin、30℃)和静止培养(30℃)两种
培养方式进行大杯伞华农2号菌株的液体培养，测
得漆酶活性变化曲线如图3所示。
√ l
2／＼。／—、／、’
260 400 600 800
A／nm
图2大杯伞华农2号菌株分泌漆酶与ABTS反应的最大吸
收波长
Fig．2The嫩菇nmmab§豳创吐w驸eleng吐lofA嬲+gen嘲州by
o)【i‰onwi出1accasef梳CZ扛Dc池ⅣlcL鬈i，nostrainsc叫-2
≤
己
《
妲
蹴
媸
2 6 10 14 18 22 26 30 34
培养天数／d
一◆一摇床培养；一6一静止培养
圈3摇瓶培养和静止培养对大杯伞华农2号
菌株漆酶分泌的影响
ng．3雎＆t《statica11dshakecuItuI镪on国∞叼枇
m8鬈折弛stminscau-21accasepIDduction
由图3可得，静止培养和摇瓶培养大杯伞华农
2号菌株，其分泌的漆酶最高酶活相差不大(摇瓶培
养245u，L，静止培养236u，L)，但是摇瓶培养能明
显提前酶活高峰的出现时间，摇瓶培养比静止培养
缩短了12d。大杯伞华农2号菌株为好氧菌，培养
方式对漆酶分泌影响显著。与静止培养相比，摇瓶
培养能够提高培养基内溶解氧量，强化液体培养体
系内的传质作用，更适于菌体的快速生长和漆酶的
合成与分泌。
2．4不同碳源对大杯伞华农2号菌株漆酶分泌的
影响
大杯伞华农2号菌株能利用多种碳源，本实验
选用5种碳源(葡萄糖、可溶性淀粉、麦芽糖、蔗糖、
麦芽提取物)，30℃、110r，耐n进行摇瓶液体培养，
考察不同碳源对大杯伞漆酶分泌的影响，实验结果
如图4所示。
拿
3
蓍
妲
避
避
堵养_久数／d
一◆一葡萄糖；一口一淀粉；一n一麦芽糖
一×一庶糖；一*一麦芽提取物
图4不同碳源对大杯伞华农2号菌株产漆酶的影响
Fig．4EⅡ色ctofdi妇feremca畦的nsourcesona洳响
，nn石imostrainscau一2laccaseproduction
一般认为，淀粉是有利于漆酶分泌，本试验结果
与报道一致口引。从图4可以看出，以淀粉和麦芽提
取物为碳源其漆酶活性的峰值基本一致，但以麦芽
提取物为碳源大杯伞华农2号菌株漆酶活性下降速
度相对于淀粉较快，而以淀粉为碳源，漆酶活性能保
持在200u，L以上，比较稳定。可以认为，淀粉是液
体培养大杯伞华农2号菌株产漆酶较合适的碳源选
择。 !、
2．5不同碳源添加量对大杯伞华农2号菌株漆酶
分泌的影响
大杯伞华农2号菌株对葡萄糖的利用率比较
高，本实验选择葡萄糖作为碳源，设置了5个葡萄糖
添加量梯度(5，10，15，20，25∥L)，实验结果如图5
所示。
从图5可以看出，从整体趋势看，不同葡萄糖添
加量对大杯伞华农2号菌株产酶量的影响并不显
著，各种葡萄糖添加量条件下大杯伞华农2号菌株
分泌漆酶活性趋势基本一致，达到峰值的时间也相
差不多，最高酶活均维持在240u，L左右。
O
O
O
O
O
O
O
如
筋
加
：2
m
，
万方数据
·36· 生物加工过程 第4卷第3期
d
3
￥
掣
爆
璇
避
培养天数／d
～◆一5∥L；一口一10∥L；一△一15∥L
一×一20g，L；一米一25∥L
图5葡萄糖添加量对大杯伞华农2号菌株分泌
漆酶活性的影晌
F培5Ⅸeetofglucoseconeerltrationoncz蠡叼加，rm打糯
s嘶nscau-21accasep"0duction
2．6不同氮源对大杯伞华农2号菌株漆酶分泌的
影响
用胰蛋白胨，酪蛋白胨，酵母膏，酵母提取物，硝
酸铵作为氮源(各2∥L)，以可溶性淀粉(25∥L)为
碳源。在接种量和其他培养条件一致的情况下摇瓶
培养，测漆酶活性，将最高酶活做柱形图，结果如图
6所示。
善
己
童
赡
溢
避
{追
皿睦
不同氮源
一口一最高酶活
图6不同氮源对大杯伞华农2号菌株漆酶分泌的影响
Fig．6肼ect0fdi任蕊ntIlitIDgensourceonCl泐c拍e
，榭咖口sIminscau-2laccaseproduction
从图6中明显可以看出，不同的氮源对大杯伞
华农2号菌株分泌漆酶的最高酶活影响显著，有机
氮源高于无机氮源，最佳的氮源是酪蛋白胨，其次是
酵母膏，产酶酶活最低是硝酸铵。
2．7不同铜离子浓度对大杯伞华农2号菌株漆酶
分泌的影响
漆酶为一种含铜的多酚氧化酶，本实验于发酵
培养第7d添加100mmol／L硫酸铜，改变液体发酵
培养基中铜离子的含量，达到铜离子的终浓度分别
为(0，0．1，0．2，0．5，1．0，2．0mmol，L)，考察铜离子对
大杯伞华农2号菌株合成漆酶的影响。实验结果如
图7所示。
d
o
≤
趟
烬
溢
缝
4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
培养天数／d
一◆—-om洲L；一u—_0．1mol，L；一△—巾．2rnol，L
一×—0，5mol／L；一*一1．0mol／L；一●一2．0rn洲L
图7铜离子浓度对大杯伞华农2号菌株产漆酶活性的影响
Fig．7隧ectof 叩per0nCZ咖惋撇咖
s嘣nsc{uJ．2laccaseinduction
从图7可以看出，与对照(不添加铜离子)相比，
当铜离子浓度为0．1mmol／L时，产漆酶活性峰值是
各个浓度条件下峰值最大的，最高漆酶活性是对照
的3倍。当铜离子浓度比较大的时候，由于铜离子
作为金属元素对于大杯伞华农2号菌株的生长具有
一定的毒害作用，铜离子过高反而不利于漆酶的分
泌。因此，本试验得出，培养基中添加铜离子浓度达
到o．1r砌ol，L时，有利于大杯伞华农2号菌株漆酶
的分泌。
3讨论
大杯伞华农2号菌株为好氧菌，培养方式对于
漆酶分泌影响显著，摇床培养能够加快产酶的速度，
缩短最高酶活出现的天数，比静止培养更有利于大
杯伞华农2号菌株漆酶的分泌。摇床培养能够提高
培养基内溶解氧量，强化液体培养体系内的传质作
用，有利于适于菌体的快速生长及漆酶的合成。
碳源是构成微生物细胞代谢的营养物质，可溶
性淀粉作为碳源有利于大杯伞华农2号菌株分泌漆
酶。但是，碳源添加量对于大杯伞华农2号菌株分
泌漆酶影响不显著，本次实验结果与2002年D曲itS
报道葡萄糖对鼢弛6施靴协分泌漆酶具有抑制作
用的结果不一致u6。，这可能是因为不同碳源对于不
O
O
0
O
O
O
O
O
0
∞"如笱加”m，
∞
∞
∞
∞
0
8
6
4
2
万方数据
2006年8月 韩君莉等：大杯伞华农2号菌株液体培养产生漆酶条件的研究 ．37．
同菌株漆酶分泌的代谢调控机制的差异导致。
氮源对漆酶活性的影响很大，这可能是漆酶的
催化能力受到其自身催化反应活性中心位点附近的
氨基酸配体影响，而培养基中的氮源物质则是合成
氨基酸配体的原料，本实验得出有机氮源优于无机
氮源，酪蛋白胨>酵母膏>酵母提取物>
胰蛋白胨>硝酸铵。
漆酶为含铜的多酚氧化酶，铜离子对大杯伞华
农2号菌株漆酶分泌的影响明显，这与漆酶的结构
有很大关系。PetrBal越an等认为，铜离子不仅能够
诱导漆酶基因的表达，而且也能增强漆酶的稳定
性f17|。此外，蹦II】i甜G等认为，铜离子还能明显抑
制一种胞外蛋白降解酶POSl的活性，从而提高漆酶
的稳定性[18|。铜离子本身具有毒性，过量铜离子会
抑制菌株生长，从而影响漆酶的产量。因此要选择
适合的铜离子添加量，本实验中得出最适铜离子添
加量是O．1mfI】【ol见。
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章丘圣泉利用玉米秸秆造乙醇取得重大突破
随着乙醇汽油的推广，市民对乙醇的认知度也越来越高。与众多国内企业利用玉米造乙醇不同，章丘
一家企业则在研究玉米秸秆造乙醇上取得了突破，被农民废弃的秸秆将成制造乙醇的原料。章丘圣泉与清
华大学展开全面技术合作，通过原创和引进相结合的方式，研发以糠醛渣为原料生产纤维素乙醇的技术，现
在已取得了阶段性成果，计划于今年10月份前完成小试，年底前完成中试，明年完成5万t乙醇生产项目的
建设。公司利用玉米秸秆生产糠醛和乙醇并热电联产的研究和生产应用技术工艺，每年可减排C0210万t
左右，符合国际cDM(清洁发展机制)要求，正在积极申报国际cDM项目。
(李 晖)
万方数据