全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&% 年 月
生"物"加"工"过"程
-:@CE0E]BHFC,.BDY@B1FBIE00TCJ@CEEF@CJ
bB.2! +B2#
]H.K$%&%
GB@"&%2(/*/6_2@00C2&*$ =(*!2$%&%2%#2%%
收稿日期"$%&% =%( =%)
基金项目"威海市海洋研究院课题#%%#&(#$%/%)$
作者简介"朱启忠#&/)&$男山东单县人教授研究方向"生物化学和酶工程TRA,@.":99X9c0GH2EGH2IC
壳聚糖载体的改性及其用于固定化漆酶的研究
朱启忠杨万芹
#山东大学威海分校 海洋学院威海 $*#$%/$
摘"要"利用有机酸改性壳聚糖并用交联法制备酸化的壳聚糖载体然后用改性壳聚糖载体固定漆酶( 甲酸)乙
酸改性壳聚糖的最适条件"壳聚糖与甲酸)乙酸的质量摩尔比#J6AB.$分别为 &%%p&)&%%p&d)戊二醛的质量分数为
&i缓冲溶液的 14分别是 #d#))d%反应时间为 ( :%壳聚糖与酒石酸)草酸的质量摩尔比#J6AB.$分别为&%%p%d))
&%%p$戊二醛的质量分数为 $i缓冲溶液的 14分别是 (d*)#d$反应时间为 #d) :( 不同有机酸改性的壳聚糖用
于漆酶的固定其酶活都有不同程度的提高尤其用酒石酸改性的壳聚糖载体效果最好其酶活提高了 )i(
关键词"壳聚糖%固定化%漆酶%有机酸
中图分类号"7!&#d$""""文献标志码"5""""文章编号"&*$ =(*!#$%&%$%# =%%(( =%*
_2I.7.:5F.2/27:-.F215/:544.04724.GG2J.6.H5F.2/2765::510
P4W7@R9:BCJL5+O[,CRX@C
#-B.EJEBD>IE,CB.BJK [E@:,@-,A1H0BDQ:,CGBCJWC@\EF0@?K[E@:,@$*#$%/-:@C,$
*J1F45:F"-:@?B0,C Z,0ABG@D@EG Z@?: BFJ,C@I,I@G ,CG IFB00R.@ChEG 8K,I@G@D@I,?@BC2V,II,0EZ,0@AABR
8@.@9EG BC ?:EIFB00R.@ChEG I:@?B0,C I,F@EF2T^1EF@AEC?,.1,F,AE?FE0ZEFE,0DB.BZ0" BFJ,I@C ,I@G0ZEFE
DBFA@I,I@G ,CG ,IE?@I,I@G AB.,FF,?@B0BDI:@?B0,C ?B,I@G ZEFE&%%p&#J6AB.$ ,CG &%%p&d) #J6AB.$
?:EIBCIEC?F,?@BC BDJ.H?,F,.GE:KGEZ,0&i ?:E14\,.HE0ZEFE#d# ,CG )d% FE,I?@BC ?@AEZ,0( :2MC
I,0EBD?,F?,F@I,I@G ,CG B^,.@I,I@G I:@?B0,C ?B,I@G F,?@B0ZEFE&%%p%d)#J6AB.$ ,CG &%%p$#J6AB.$
J.H?,F,.GE:KGEIBCIEC?F,?@BC Z,0$i 14\,.HE0ZEFE(d* ,CG #d$ FE,I?@BC ?@AEZ,0#d) :2f:E
,I?@\@?@E0BD@AAB8@.@9EG .,II,0EZEFE@A1FB\EG 8K\,F@EG IBCG@?@BC02f,F?,F@I,I@G ABG@D@I,?@BC 0:BZEG
?:,??:E,I?@\@?K@CIFE,0EG 8K)i2
K0A L24I1"I:@?B0,C% @AAB8@.@9,?@BC% .,II,0E% BFJ,C@I,I@G
""壳聚糖#I:@?B0,C-fQ$是甲壳素的脱乙酰化产
物无毒无味具有良好的生物相容性可用于生物
降解因此在食品)环保)医药等领域具有广阔的应
用前景( 作为储量巨大的天然资源-fQ 的开发与
应用越来越引起人们的重视*& =(+ ( 但由于溶解性不
高在很大程度上限制了它的应用( 根据 -fQ 分子
内的&>4和&+4
$
具有易于被化学修饰的特
点*# =!+ 引入功能性基团增加其溶解性和功能性
以拓宽-fQ的应用范围是-fQ 应用开发的主要方
向之一(
""漆酶是一种多酚氧化酶#1B.K1:ECB.B^@G,0ET-
&d&%d(d$$最早从漆树分泌物中被发现*/+ 它广泛
存在于多种生物体内包括植物)真菌)甚至昆虫体
内( 漆酶作为一种氧化还原酶被广泛应用于催化
氧化还原反应中它的机制是利用分子氧产生的
副产物只有水因此被称为-生态友善的酶.( 近年
来漆酶在多方面得到应用具有广阔的应用前
景*&% =&#+ ( 但是目前有效利用漆酶的主要障碍是催
化效率低)利用成本过高从而严重阻碍了漆酶的
广泛应用酶的固定化技术为提高酶的使用效率)
降低成本等提供了可能性( 固定化漆酶与溶液酶
相比具有许多突出的优点"可回收)易分离)可多次
反复使用)使用效率高)成本低等(
""漆酶的固定化研究进行得较晚近几年来国内
外学者包括笔者都曾进行过研究*&) =&*+ ( 但改性
-fQ作为载体对漆酶固定目前还未见报道( -fQ 分
子中存在着大量的&>4和&+4
$
基团它们都会
与&->>4 发 生 羧 化 反 应 而 引 入 羧 酸 基 团
#
&
- >$同时它们又会形成各种氢键这就可以改
善壳聚糖的性能( 因此采用几种有机酸对壳聚糖
进行改性然后用于漆酶的固定探讨有机酸改性
固定化漆酶的条件为漆酶的应用提供理论根据(
D?材料及方法
D=D?主要试剂与材料
""壳聚糖#脱乙酰度 /%i&!
"
A$)$)i戊二醛
#中国医药集团上海化学试剂公司$甲酸#济南试
剂总厂$乙酸#天津市科密欧化学试剂开发中心$
草酸#山东省原平市化工有限责任公司$酒石酸
#浙江省临安市宏山化工厂$以上试剂均为分析
纯%漆酶#自制"真菌生产的粗酶液$(
D=B?方法
&2$2&"酸化壳聚糖载体的制备
&2$2&2&"甲酸酸化壳聚糖载体的制备
""取 %d) J壳聚糖加 14#d# 的+,
$
4;>
#
柠檬酸
缓冲溶液 &( AV)& AB.6V的甲酸溶液 ) AV磁力搅
拌器上搅拌反应 ( :加入 &%i的戊二醛溶液$ AV
#戊二醛的质量分数为 &i下同$%d) : 后缓慢地
加入 $ AB.6V的 +,>4中和至中性使酸化的壳聚
糖沉淀下来对沉淀进行抽滤并不断洗涤 #至中
性$将沉淀烘干得到的固体就是经甲酸改性的壳
聚糖载体最后将其研磨备用(
&2$2&2$"乙酸酸化壳聚糖载体的制备
""取 14)的+,
$
4;>
#
柠檬酸缓冲溶液&%d) AV
加 & AB.6V的乙酸溶液 d) AV其他物质的用量与实
验方法同甲酸(
&2$2&2("酒石酸酸化壳聚糖载体的制备
""取 %d) J壳聚糖加 14(d* 的+,
$
4;>
#
柠檬酸
缓冲溶液 &(d) AV加 & AB.6V的酒石酸溶液
$d) AV磁力搅拌器上搅拌反应 #d) :加 &%i的戊
二醛溶液 # AV%d) :后缓慢地加 $ AB.6V的+,>4
中和至中性使酸化的壳聚糖沉淀下来对沉淀进
行抽滤并不断洗涤至中性将沉淀烘干得到的固
体就是经酒石酸改性的壳聚糖载体最后将其研磨
备用(
&2$2&2#"草酸酸化的壳聚糖载体的制备
""取 14#d$ 的+,
$
4;>
#
柠檬酸缓冲溶液* AV
加 & AB.6V的草酸 &% AV其他的物质用量与实验方
法同酒石酸(
&2$2$"未经酸处理的壳聚糖载体的制备
""取 %d) J壳聚糖加 14#d# +,
$
4;>
#
柠檬酸的
缓冲溶液 &! AV 磁力搅拌器上搅拌反应 ( :加
&%i的戊二醛溶液 $ AV%d) : 后加 $ AB.6V的
+,>4中和至中性使壳聚糖沉淀对沉淀进行抽滤
并不断洗涤再将其烘干最后将得到的固体即壳
聚糖载体研磨备用(
&2$2("固定化漆酶的制备
""分别取载体 %d$ J加 14#d# 的 +,
$
4;>
#
柠
檬酸的缓冲溶液 ) AV加粗酶液 & AV然后放进
#% e水浴恒温反应 # :同时不断搅拌然后将其置
于# e的条件下冷却静置 $ :最后反复洗涤沉淀
得到的即是固定化的漆酶(
&2$2#"酶活力测定
""将文献*&+方法稍加改动"在所得固定化漆酶
中加 14#d* 的+,
$
4;>
#
柠檬酸缓冲溶液(d) AV
然后再加 (d(* AB.6V的邻联甲苯胺 %d) AV) A@C
后测 )/) CA的光吸收值9
)/)
#以每分钟光吸收值增
加 %d%& 为 & 个酶活力单位#W$$(
B?结果与讨论
B=D?壳聚糖与酸量比对固定化酶的影响
$2&2&"甲酸)乙酸用量对固定化酶活力的影响
""用 %d) J壳聚糖与 $d)))d%)d))&%d% AV的
& AB.6V的酸作用其中甲酸的反应体系 14为 #d#
而乙酸 14为 )d%在磁力搅拌器上搅拌反应 ( :再
加戊二醛使其质量分数为 &i继续反应 %d) :制
得载体固定漆酶实验结果如图 & 所示(
""从图 & 可以看出"当用 )AV&AB.6V的甲酸改性
壳聚糖即壳聚糖与甲酸的质量摩尔比#J6AB.$为
&%%p&时所得固定化漆酶的酶活最大%而乙酸用量
为 d) AV即壳聚糖与乙酸的质量摩尔比#J6AB.$
为 &%%p&d) 时所得固定化酶的酶活最大(
#( 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
图 D?甲酸)乙酸用量对固定化酶活力的影响
N.;=D?#70:F127Z263G027724G.:5:.I
5/I5:0F.:5:.I2/F-05:F.Z.FA 27
F-0.GG2J.6.H0I0/HAG0
$2&2$"酒石酸)草酸用量对固定化酶活力的影响
""分别用 %d) J壳聚糖与不同体积的 & AB.6V的
酸 #酒石 酸 的 体 积 梯 度 为" %) $d)) )d%) d))
&%d% AV草酸为 $d)))d%)d))&%d%)&$d) AV( 其
中酒石酸的反应体系 14为 (d*草酸的反应体系
14为 #d$($ 分别在磁力搅拌器上搅拌反应 #d) :
然后加戊二醛使其质量分数变为 $i继续反应
%d) :以此制得的载体来固定漆酶所得固定化酶
酶活如图 $ 所示(
图 B?酒石酸)草酸用量对固定化酶活力的影响
N.;=B?#70:F127Z263G027F54F54.:5:.I
5/I2[56.:5:.I2/F-05:F.Z.FA 27
F-0.GG2J.6.H0I0/HAG0
""从图 $ 可以看出"当用 $d) AV)& AB.6V的酒石
酸改性壳聚糖载体即壳聚糖与酒石酸的质量摩尔比
#J6AB.$为 &%%p%d)时所得固定化漆酶的酶活最大%
当草酸用量为 &% AV即壳聚糖与草酸的质量摩尔比
#J6AB.$为 &%%p$时所得固定化酶的酶活最大(
""影响酸用量的多少有 $ 种因素"一是羧基的多
少这可以通过图 & 与图 $ 中的甲酸与酒石酸的结
果比较得出甲酸是单个&->>4而酒石酸有 $
个&->>4所以在相同质量浓度的情况下甲酸的
用量是酒石酸的 $ 倍%另一个因素是酸的解离度在
酸度)反应时间相同的情况下酸的解离度越大所
用酸的量就会越少这可以通过比较图 & 与图 $即
比较甲酸与乙酸或比较酒石酸与草酸与壳聚糖反
应的不同实验结果推出(
B=B?缓冲溶液的9"对固定化酶活性的影响
$2$2&"甲酸)乙酸改性壳聚糖时 14对固定化酶活
力的影响
""分别用 %d) J壳聚糖与 & AB.6V的甲酸 ) AV)
& AB.6V的乙酸 d) AV反应甲酸与壳聚糖反应的缓
冲溶液 14设为 $d*)(d$)(d!)#d#))d%乙酸的缓冲溶
液 14设为 (d$)(d!)#d#))d%))d*分别在磁力搅拌器
上搅拌反应 ( :然后加戊二醛使溶液质量分数为
&i让壳聚糖在这样的条件下交联 %d) :以此制得
的载体固定漆酶所得固定化漆酶酶活如图 (所示(
图 M?甲酸和乙酸改性壳聚糖时缓冲液9"
对固定化酶活力的影响
N.;=M?#70:F1279"27F-0J37042/F-0
5:F.Z.FA 27F-0.GG2J.6.H0I0/HAG0
L-.6031./; G0F-5/05:.I5/I5:0F.:
5:.IF2 G2I.7A F-0:-.F215/
""从图 ( 可以看出"当 +,
$
4;>
#
柠檬酸缓冲溶
液的 14为 #d# 时甲酸改性壳聚糖载体固定漆酶
的酶活最大而乙酸改性壳聚糖载体固定漆酶缓冲
溶液 14为 )d% 时酶活最大(
$2$2$"酒石酸)草酸改性壳聚糖时 14对固定化酶
活力的影响
""用 %d) J壳聚糖与 $d) AV& AB.6V的酒石酸)
&% AV& AB.6V的草酸在缓冲溶液 14为 (d%)(d*)
#d$)#d! 时分别作用磁力搅拌器上搅拌反应
#d) :然后加戊二醛使其质量分数变为 $i 交联
%d) :以此制得的载体固定漆酶所得的固定化酶
活如图 # 所示(
)("第 # 期 朱启忠等"壳聚糖载体的改性及其用于固定化漆酶的研究
图 @?酒石酸)草酸改性壳聚糖时缓冲液9"对
固定化酶活力的影响
N.;=@?#70:F1279"27F-0J37042/F-0
5:F.Z.FA 27F-0.GG2J.6.H0I0/HAG0
L-.6031./; F54F54.:5:.I5/I2[56.:
5:.IF2 G2I.7A F-0:-.F215/
""从图 # 可以看出"酒石酸改性壳聚糖14为
(d* 时固定化漆酶的酶活最大在 14大于 (d* 时
随着 14的增大而减小%而草酸改性壳聚糖的 14为
#d$ 时酶活最大在 14大于 #d$ 时随着 14的增
大而减小( 从图 # 还可以看出"缓冲溶液的 14对
含有单个&->>4的有机酸改性的壳聚糖载体比
对含有 $ 个羧基的有机酸改性的壳聚糖载体影响
大这主要是因为 $ 个&->>4的有机酸有 $ 个解
离常数所以在一定条件下14对其影响不大(
B=M?戊二醛质量分数对固定化酶的影响
$2(2&"甲酸)乙酸改性壳聚糖时戊二醛质量分数对
固定化酶活力的影响
""制备载体时壳聚糖与甲酸的质量摩尔比
#J6AB.$为 &%%p&14为 #d#壳聚糖与乙酸的质量
摩尔比#J6AB.$为 &%%p&d)14为 )d%搅拌器上反
应 ( :分别向各反应体系中加戊二醛使反应体系
的戊二醛质量分数梯度都为 %d)i)&d%i)&d)i)
$d%i此条件下交联 %d) :以此制得的载体固定漆
酶所得的固定化酶酶活如图 ) 所示(
""从图 ) 可以看出"经过甲酸或乙酸改性的壳聚
糖交联戊二醛的质量分数为 &d%i时所得载体的
固定化漆酶的活性最大%小于 &d%i时固定化酶活
随着戊二醛质量分数的增大而增大%大于 &d%i时
所得的固定化酶活随着戊二醛质量分数的增大而
减小并且戊二醛的质量分数对乙酸改性的壳聚糖
的影响较大(
$2(2$"酒石酸)草酸改性壳聚糖时戊二醛质量分数
对固定化酶活力的影响
""制备载体时壳聚糖与酒石酸的质量摩尔比
图 P?甲酸)乙酸改性壳聚糖时戊二醛质量
分数对固定化酶活力的影响
N.;=P?#70:F127F-0G51145F.2 27;63F5456I0-AI0
2/F-05:F.Z.FA 27F-0.GG2J.6.H0I0/HAG0
L-.6031./; G0F-5/05:.I5/I5:0F.:5:.I
F2 G2I.7A F-0:-.F215/
#J6AB.$为 &%%p%d)壳聚糖与草酸的质量摩尔比
#J6AB.$为 &%%p$酒石酸反应的缓冲液 14为 (d*)
草酸的 14为 #d$搅拌器上反应 #d) :分别向各反
应体系中加戊二醛使反应体系的戊二醛质量分数
梯度为 %d)i) &d%i) &d)i) $d%i) $d)i交联
%d) :以此制得的载体固定漆酶其固定化酶活如
图 * 所示(
图 Q?酒石酸)草酸改性壳聚糖时戊二醛质量分数对
固定化酶活力的影响
N.;=Q?#70:F127F-0G51145F.2 27;63F5456I0-AI0
2/F-05:F.Z.FA 27F-0.GG2J.6.H0I0/HAG0
L-.6031./; F54F54.:5:.I5/I2[56.:5:.I
F2 G2I.7A F-0:-.F215/
""从图 *可以看出"经过酒石酸或草酸改性的壳聚
糖交联戊二醛的质量分数为 $d%i时所得载体的固
定化漆酶的酶活最大在戊二醛的质量分数小于 $i
时固定化酶活随着戊二醛质量分数的增大而增大%
但大于 $d%i时所得的固定化酶活随着戊二醛质量
分数的增大而减小( 说明适当的戊二醛增强了壳聚
*( 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
糖的机械稳定性和耐酸性酶的活力可达到最高( 但
高浓度的戊二醛并不利于酶的固定化这可能是由于
过量的戊二醛使壳聚糖分子内的氨基交联使壳聚糖
的孔隙减小增大了固定化酶的空间位阻或使酶蛋白
变性失活从而降低了固定酶的活性(
B=@?酸化时间对固定化酶的影响
$2#2&"甲酸)乙酸与壳聚糖的反应时间对固定化酶
活力的影响
""制备载体时将壳聚糖与甲酸质量摩尔比
#J6AB.$定为 &%%p&乙酸为 &%%p&d)两酸反应体系
的缓冲液 14分别为 #d# 和 )d%搅拌器上反应时间
梯度为 &d))(d%)#d))*d% :到时间后分别向各反应
体系中加戊二醛并使其质量分数为 &i再反应
%d) :( 用所得载体固定漆酶其固定化酶活如图
所示(
图 R?甲酸)乙酸与壳聚糖反应时间对固定化
酶活力的影响
N.;=R?#70:F127F-0405:F.2/F.G027G0F-5/0
5:.I 5:0F.:5:.I5/I:-.F215/2/F-0
5:F.Z.FA 27F-0.GG2J.6.H0I0/HAG0
""从图 可以看出"用甲酸或乙酸改性壳聚糖载
体时酸与壳聚糖的反应时间是 ( :所得的固定化
漆酶的活性最大%小于 ( :时固定化酶活随着反应
时间的增大而增大%但反应时间超过 ( : 时所得的
固定化酶活随着反应时间的增大而减小并且这种
减小的趋势很明显(
$2#2$"酒石酸)草酸与壳聚糖反应时间对固定化酶
活力的影响
""制备载体时将壳聚糖与酒石酸的质量摩尔比
#J6AB.$定为 &%%p%d)壳聚糖与草酸的质量摩尔比
为&%%p$两酸反应体系缓冲液的 14分别为 (d* 和
#d$搅拌器上反应时间梯度为 &d))(d%)#d))*d% :
然后分别向各反应体系中加戊二醛#质量分数为
$i$再反应%d) :后用所得载体固定漆酶其固定
化酶活如图 ! 所示(
图 >?酒石酸)草酸与壳聚糖反应时间对固定化
酶活力的影响
N.;=>?#70:F127F-0405:F.2/F.G027F54F54.:
5:.I2[56.:5:.I5/I:-.F215/2/F-05:F.Z.FA
27F-0.GG2J.6.H0I0/HAG0
""从图 ! 可以看出"用酒石酸或草酸改性壳聚糖
载体时酸与壳聚糖的反应时间为 #d) :所得的固
定化漆酶的酶活最大%小于 #d) : 时固定化酶活随
着反应时间的增大而增大%但反应时间大于#d) :
时所得的固定化酶活随着反应时间的增大而减小(
B=P?未经改性的壳聚糖载体与改性的壳聚糖载体
固定化漆酶的比较
""未经酸改性的壳聚糖载体与经各种有机酸#甲
酸)乙酸)酒石酸)草酸$在各自的最适条件下改性
的壳聚糖载体同时固定漆酶结果图 / 所示(
&&未经改性的壳聚糖%$&甲酸改性的壳聚糖%(&乙酸改性的壳聚糖%
#&酒石酸改性的壳聚糖%)&草酸改性的壳聚糖
图 ]?不同处理的壳聚糖对固定化漆酶活力的比较
N.;=]?,2G9541.G27I.7040/FF405FG05F127
:-.F215/2/F-05:F.Z.FA 27F-0.GG2J.6.H0I
65::510.GG2J.6.H0I0Z0AG0
""从图 / 可以看出"经各种不同有机酸改性的壳
聚糖对固定漆酶的酶活都有不同程度的提高尤其
用酒石酸改性壳聚糖载体的效果最好其酶活提高
("第 # 期 朱启忠等"壳聚糖载体的改性及其用于固定化漆酶的研究
了 )i( 所以可选用酒石酸来改性壳聚糖以获得
更大的固定化漆酶的活性应用于生产(
M?结?论
""壳聚糖通过有机酸改性可以改变其结构特点
和部分性质有利于与酶的结合( 从本研究结果可
以看出用不同有机酸处理的壳聚糖固定漆酶其
酶活虽然都有不同程度的提高但处理的最佳条件
不尽相同同时酶活提高的幅度有很大的差别( #
种酸中以酒石酸处理的壳聚糖效果最好可以作为
固定化酶的一个良好载体( 但壳聚糖与有机酸作
用后产生的结构变化尚待进一步研究(
参考文献"
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*+"刘其凤任慧霞2壳聚糖的结构修饰及其应用*]+2生命的化
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!( 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"