全 文 ：第９卷第５期
２０１１年９月
生 物 加 工 过 程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．９Ｎｏ．５
Ｓｅｐ．２０１１
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－３６７８．２０１１．０５．００２
收稿日期：２０１１－０３－３１
基金项目：国家自然科学基金资助项目（２０９０６０４８）
作者简介：谢柏盛（１９８６—），男，湖北仙桃人，硕士研究生，研究方向：生物化工；贾红华（联系人），副研究员，Ｅｍａｉｌ：ｈｈｊｉａ＠ｎｊｕｔ．ｅｄｕ．ｃｎ
金属框架结构材料 ＭＯＦ １９９对漆酶的
固定化及其性质
谢柏盛，贾红华，谢迎春，韦 萍
（南京工业大学 生物与制药工程学院，南京 ２１０００９）
摘 要：以金属框架结构材料ＭＯＦ １９９为载体对漆酶进行固定化，并对固定化酶的性质进行初步研究。首先，以
３氨基丙基三乙氧基硅烷对载体ＭＯＦ １９９进行表面氨基化修饰，再用戊二醛对载体进行活化，最后对漆酶进行
固定化。固定化条件优化结果表明：在漆酶质量浓度０３ｇ／Ｌ，戊二醛用量１％（体积分数），ｐＨ４８下固定７ｈ，制
得固定化酶活性最高。对固定化酶的研究发现：最适反应温度为４０℃，最适ｐＨ为５２，在连续操作７次后，固定化
酶的活力仍能保持在５１％。固定化漆酶热稳定性，ｐＨ耐受性，贮存稳定性均明显高于游离漆酶。
关键词：固定化；ＭＯＦ １９９；漆酶
中图分类号：Ｑ８１４．２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２０１１）０５－０００６－０５
ＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｌａｃｃａｓｅａｎｄｉｔｓｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｂｙｍｅｔａｌｏｒｇａｎｉｃｆｒａｍｅｗｏｒｋＭＯＦ１９９
ＸＩＥＢａｉｓｈｅｎｇ，ＪＩＡＨｏｎｇｈｕａ，ＸＩＥＹｉｎｇｃｈｕｎ，ＷＥＩＰｉｎｇ
（ＣｏｌｅｇｅｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＰｈａｒａｍａｃｅｕｔｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＮａｎｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１０００９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｌａｃｃａｓｅａｎｄｔｈｅｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｔｈｅｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｌａｃｃａｓｅｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄ．
ＬａｃｃａｓｅｗａｓｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｂｙｍｅｔａｌｏｒｇａｎｉｃｆｒａｍｅｗｏｒｋＭＯＦ１９９ａｓｔｈｅｃａｒｉｅｒａｎｄ３ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｅｔｈｏｘ
ｙｓｉｌａｎｅｗａｓｍｏｄｉｆｉｅｄｏｎｔｈｅｓｕｒｆａｃｅｏｆｔｈｅｃａｒｉｅｒ，ｔｈｅｎｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅａｓｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇａｇｅｎｔ．Ｔｈｅｌａｃｃａｓｅ
ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｏｎＭＯＦ１９９ｗｅｒｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｔｏａｃｈｉｅｖｅｔｈｅｍｏｓｔｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ
ｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ：ｌａｃｃａｓｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｗａｓ０３ｇ／Ｌ，ｌｏａｄｏｆｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅｗａｓ１％ （Ｖ／Ｖ），ｔｈｅｖａｌ
ｕｅｏｆｐＨｉｓ４８，ａｎｄｔｈｅｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇｔｉｍｅｉｓ７ｈ．Ｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｌａｃｃａｓｅｏｐｔｉｍｕｍ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｉｓ４０℃，ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｐＨｉｓ５２，ａｆｔｅｒ７ｔｉｍｅｓｉｎｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｏｐｅｒａｔｉｏｎ，ｔｈｅｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙ
ｓｔｉｌｒｅｍａｉｎｅｄａｔ５１％，ｔｈｅｔｈｅｒｍａｌｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｌａｃｃａｓｅ，ｐＨｔｏｌｅｒａｎｃｅ，ｓｔｏｒａｇｅｓｔａｂｉｌｉｔｙｗｅｒｅ
ｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅｆｒｅｅｌａｃｃａｓｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ；ＭＯＦ１９９；ｌａｃｃａｓｅ
漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，可以降解环境
中大量的酚类、含氯污染物以及许多致癌的多环芳
香化合物［１］。漆酶在造纸工业、纺织工业、环境保
护、生物资源利用、有毒环境污染物转化和新能源
开发等诸多领域具有潜在的应用价值［２］。但由于
游离漆酶的稳定性差、无法重复利用等缺点，限制
了它在工业方面的应用。固定化漆酶可重复利用，
并能有效地提高漆酶的稳定性以及对环境的耐受
性，具有游离漆酶无法比拟的优势［３］。
ＭＯＦ １９９是一种新型的多孔材料。ＭＯＦ １９９以
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Ｃｕ２＋与有机配体为原料，利用分子组装和晶体工程
的方法制得［４］，具有较大的比表面积 （超过
１０００ｍ２／ｇ）和良好的吸附能力［５－６］。ＭＯＦ １９９结
构中的 Ｃｕ２＋可在一定程度上促进漆酶的酶活。
Ｘｉａｏ等［７］以四氨基酞菁铜（ＣｕＴＡＰｃ）包覆在Ｆｅ３Ｏ４纳
米粒子表面，通过交联戊二醛的方法固定化漆酶；
蓝虹云等［８］以聚马来松香乙二醇酯 Ｃｕ（Ⅱ）配合物
固定化漆酶，重复使用６次后，酶相对保留活力为
５５０％。由于 ＭＯＦ １９９的孔径达到纳米级，与这
些文献报道的固定化漆酶的载体相比，ＭＯＦ １９９
具有更大的比表面积，能固定化更多的酶，更容易
与底物发生反应，因此ＭＯＦ １９９有很好的应用
前景。
笔者选择金属框架结构材料 ＭＯＦ １９９为载
体，并以 ３ 氨基丙基三乙氧基硅烷对载体
ＭＯＦ １９９进行表面氨基化修饰和以戊二醛对载体
进行活化。对固定化条件和固定化漆酶的性质进
行研究，以期为开发新的固定化漆酶打下基础。
１ 实验部分
１１ 主要实验材料和仪器
漆酶，诺维信公司；ＭＯＦ １９９，自制；２，２ 联
氮 二（３ 乙基 苯并噻唑 ６ 磺酸）二铵盐
（ＡＢＴＳ），Ｓｉｇｍａ公司；７５２Ｓ紫外可见分光光度计，上
海棱光技术有限公司；ＧＬ ２１Ｍ高速冷冻离心机，
上海市离心机械研究所；二甲基甲酰胺（ＤＭＦ），南
京科正化工有限公司；Ｓ ３４００ＮＩ扫描电子显微
镜，Ｈｉｔａｃｈｉ公司。
１２ ＭＯＦ １９９的制备
按文献［９］，称取１０ｇ的均三苯甲酸和２０ｇ
的Ｃｕ（ＮＯ３）２·３Ｈ２Ｏ，按照 Ｖ（ＤＭＦ）∶Ｖ（Ｃ２Ｈ５ＯＨ）∶
Ｖ（Ｈ２Ｏ）＝１∶１∶１的比例一同加入５１ｍＬ的二甲基甲
酰胺的溶液中，超声溶解。将溶液装在锥形瓶中于
８５℃烘箱中反应２０ｈ后，过滤洗涤。将产物于１００
℃烘箱中烘干约４ｈ，得到产物ＭＯＦ １９９。
１３ 载体活化
参照文献［１０］将ＭＯＦ １９９氨基化：将１０ｇ处
理后的载体加入到１０ｍＬ３ 氨基丙基三乙氧基硅
烷与４０ｍＬ甲苯的混合物中，搅拌，１１０℃下加热回
流８ｈ，冷却、抽滤，用甲苯浸泡，洗涤３次，再用乙醚
洗去甲苯，真空干燥，得到烷基胺载体。
参照文献［１１］活化烷基胺载体：将２ｇ烷基胺
载体加入至１００ｍＬ一定浓度的戊二醛溶液，７５℃
下振荡９０ｍｉｎ，用大量醋酸钠 醋酸缓冲液浸泡清
洗，直至无戊二醛残留，离心。
１４ 漆酶的固定化
将０１ｇ活化后的载体加入５ｍＬ含有漆酶的
醋酸钠 醋酸缓冲液中，在摇床中以１８０ｒ／ｍｉｎ的转
速振荡７ｈ，离心分离出载体，用大量的缓冲液洗涤
除去载体表面游离的漆酶，真空干燥后在４℃下干
燥保存。
１５ 酶活力的测定
分别将一定量的游离漆酶或固定化漆酶溶于
２ｍＬｐＨ３４的醋酸钠 醋酸缓冲液，再加 ｌｍＬ的
１ｍｍｏＬ／ＬＡＢＴＳ溶液启动反应，用紫外 可见分光
光度计测定反应体系３ｍｉｎ内４２０ｎｍ处的吸光度
变化，求出反应初速率。ＡＢＴＳ的消光系数为３６０００
Ｌ／（ｍｏｌ·ｃｍ）。定义１ｍｉｎ内氧化１μｍｏｌＡＢＴＳ的酶
量为１个酶活力单位（Ｕ）。同组实验以酶活的最大
值为１００％进行数据分析。
２ 结果与讨论
２１ ＭＯＦ １９９的表征
图１为 ＭＯＦ １９９的扫描电镜图。由图 １可
知：ＭＯＦ １９９的晶体结构为正八面体，与文献［６］
报道的结构一致。
图１ ＭＯＦ １９９的扫描电镜照片
Ｆｉｇ．１ ＳＥＭ ｐｈｏｔｏｏｆＭＯＦ１９９
２２ 漆酶固定化条件的优化
２２１ 固定化时间对漆酶固定化的影响
固定化时间对漆酶酶活的影响见图２。由图２
可知：随着固定时间的增加，固定化漆酶酶活逐渐
增加，到７ｈ时达最高。这主要是载体对漆酶的交
联量随时间延长而不断增加，从而提高了载体对酶
的固载量。随着固定化时间的延长，载体交联酶量
增加的同时，戊二醛对漆酶的抑制作用也显现出
７ 第５期 谢柏盛等：金属框架结构材料ＭＯＦ １９９对漆酶的固定化及其性质
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来，通过研究二者共同作用的结果，本实验选择最
佳固定化时间为 ７ｈ。
图２ 固定化时间对酶活的影响
Ｆｉｇ．２ Ｅｆｅｃｔｏｆｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｔｉｍｅｏｎ
ｌａｃｃａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ
２２２ 戊二醛用量对漆酶固定化的影响
戊二醛的用量对漆酶的影响，结果见图３。由
图３可知：一定体积分数的戊二醛可以使酶的固定
化效率有很大的提高；当戊二醛体积分数超过１％
后，固定化漆酶的相对活性快速下降。这是因为戊
二醛既是固定化反应的交联剂，同时又是可以使酶
失活的变性剂。随着反应体系中戊二醛含量的增
高，载体上固定化酶的量也不断增高，酶活升高，当
戊二醛体积分数超过１％后，它对酶的变性作用占
主导地位，固定化酶的活性开始下降。因此选择体
积分数为１％的戊二醛活化氨基化载体。
图３ 戊二醛用量对酶活的影响
Ｆｉｇ．３ Ｅｆｅｃｔｏｆｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎ
ｌａｃｃａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ
２２３ 缓冲液ｐＨ对漆酶固定化的影响
固定化漆酶酶活受 ｐＨ的影响很大，因为酶作
为一种蛋白质，ｐＨ超过一定的范围，结构会发生变
化，从而影响酶的活力（图４）。由图４可知：固定化
漆酶的相对酶活随着 ｐＨ的升高而升高，当 ｐＨ为
４８时，固定化漆酶的相对酶活达到最大值，之后快
速下降。因此最佳缓冲液ｐＨ选择为４８。
图４ ｐＨ对酶活的影响
Ｆｉｇ．３ ＥｆｅｃｔｏｆｐＨｏｎｌａｃｃａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ
２２４ 初始酶浓度对漆酶固定化的影响
固定化酶的酶活和载体的漆酶固定量的关系
如图５所示。由图５可知：固定化酶的酶活和载体
的漆酶固定量随初始酶浓度的增大而提高，但当初
始酶浓度增加到一定程度后，固定化酶的活力开始
下降，载体的漆酶固定量上升不再明显。这是因为
固定化载体可固定的酶量是有限的；但是若酶液浓
度过高，则会造成酶分子相互聚集成团，致使酶的
活性降低。当初始酶液质量浓度为０３ｇ／Ｌ时，固
定化酶的酶活最高。因此选择最佳初始酶液质量
浓度为０３ｇ／Ｌ。
图５ 初始化酶浓度对酶活的影响
Ｆｉｇ．５ Ｅｆｅｃｔｏｆｅｎｚｙｍｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｌａｃｃａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ
２３ 固定化漆酶的性质
２３１ 米氏常数
分别以不同浓度的 ＡＢＴＳ为底物，由 Ｌｉｎｅｗｅａｖ
ｅｒＢｕｒｋ双倒数法处理（图６），其中 ｖ－１为表观初始
催化速率，ｃｓ为底物浓度，由图６求得的游离漆酶和
固定化漆酶的米氏常数 Ｋｍ 分别为 １９２和 ２７０
ｍｍｏｌ／Ｌ。Ｋｍ值的增加说明固定化漆酶的亲和力降
低了，这是因为固定化后漆酶分子的结构发生变
化，从而影响漆酶与底物的亲和力。
２３２ ｐＨ对酶活力的影响
图７给出了在不同ｐＨ的反应体系中游离漆酶
８ 生 物 加 工 过 程 第９卷
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图６ 游离漆酶和固定化漆酶的米氏常数
Ｆｉｇ．６ Ｍｉｃｈａｅｌｉｓｃｏｎｓｔａｎｔｏｆｆｒｅｅａｎｄｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｌａｃｃａｓｅ
和固定化漆酶酶活的变化。从图７可以看出：漆酶
固定化后对底物作用的最适ｐＨ基本不变，在４４～
６０之间。相比游离漆酶，固定化漆酶在 ｐＨ４４～
５５这个漆酶常用操作范围内，表现出更高的活力
且比固定化漆酶在 ｐＨ４４～６０之间活力相对
稳定。
图７ ｐＨ对游离漆酶和固定化漆酶的影响
Ｆｉｇ．７ ＥｆｅｃｔｓｏｆｐＨｏｎｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｆｒｅｅ
ａｎｄｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｌａｃｃａｓｅ
图８ 游离漆酶和固定化漆酶的热稳定性
Ｆｉｇ．８ Ｔｈｅｒｍａｌｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｆｒｅｅａｎｄｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｌａｃｃａｓｅ
２３３ 游离酶和固定化酶的热稳定性
图８为温度对固定化漆酶和游离漆酶的影响。
由图８可知：游离漆酶的最适反应温度为２８℃，固
定化漆酶的最适反应温度为４０℃，２０～３０℃的温
度范围内，固定化漆酶保持了较高的活力，随着温
度的增加酶活逐步下降。在４０～６０℃，与游离漆酶
相比，固定化漆酶的酶活下降相对缓慢，这表明固
定化漆酶具有较好的温度适应性。
２３４ 固定化酶操作稳定性和储存稳定性
表１反映了固定化酶的操作稳定性，随着反应
次数的增加，固定化酶的活力缓慢下降，重复利用５
次后，酶的活力还能保持在初始酶活的８２％，经过７
次重复操作仍保持５１％，表明固定化酶具有良好的
操作稳定性。
表１ 固定化漆酶的操作稳定性
Ｔａｂｌｅ１ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｌａｃｃａｓｅ
次数 １ ３ ４ ５ ６ ７
相对酶活／％ １００ １００ ９０ ８２ ６５ ５１
游离酶在４℃冰箱中放置１１ｄ后酶活基本丧
失，而固定化酶的活力依然保持在８５％以上，表明
固定化酶的储存稳定性明显优于游离酶。
３ 结论
利用 ＭＯＦ １９９为载体固定漆酶，在漆酶０３
ｇ／Ｌ，戊二醛用量１％（体积分数），ｐＨ４８下固定７
ｈ，制得固定化酶活性最高。制得的固定化酶不仅
有较高的活力回收，固定化酶的最适反应温度比游
离酶提高了１２℃，固定化后漆酶的ｐＨ稳定性明显
提高了，重复利用 ７次后仍能保持初始活力的
５１％，且在４℃下保存仍能有较高活力的保持，有利
于酶的运输和贮存。ＭＯＦ １９９结构中具有金属
Ｃｕ２＋，而且本身比表面积大，固定化过程简单。因
此，ＭＯＦ １９９为漆酶的固定化提供了一种新型的
载体材料，为其工业化应用提供可行性。
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９ 第５期 谢柏盛等：金属框架结构材料ＭＯＦ １９９对漆酶的固定化及其性质
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ｓｔｕｄｙｏｆｃｏｎｔｒｏｌｅｄｐｏｒｅｇｌａｓｓ，ｓｉｌｉｃａｇｅｌａｎｄＰｏｒａｖｅｒ ｆｏｒｔｈｅｉｍ
ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｕｒｅａｓｅｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｕｒｅａｉｎａｆｌｏｗｉｎｊｅｃｔｉｏｎｃｏｎ
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（８）：
櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒
８１３８２１．
国内简讯
我国科学家在番茄表皮毛形成调控分子研究方面获进展
美国《国家科学院院刊》（ＰＮＡＳ）上在线发表了华中农业大学一项最新研究成果———番茄表皮毛形成及
胚胎致死的调控机制（Ａｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｇｅｎｅｉｎｄｕｃｅｓｔｒｉｃｈｏｍｅｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｅｍｂｒｙｏｌｅｔｈａｌｉｔｙｉｎｔｏｍａｔｏ）。该研究通
过图位克隆的方法分离并鉴定了番茄多细胞表皮毛形成的关键基因 Ｗｏｏｌｙ（Ｗｏ），并深入研究了该基因参
与番茄表皮毛形成的调控途径，即Ｗｏ通过蛋白互作的方式促进细胞周期相关基因———ＳｌＣｙｃＢ２的表达，从
而促使细胞从Ｇ２期向Ｍ期的转换，最终促进表皮毛的形成。该文报道的研究结果显示：番茄表皮毛形成的
调控模式不同于拟南芥表皮毛，是一种新的调控机制。该机制的发现对于揭示植物细胞命运调控的多样性
具有十分重要的价值。
我国首个自主研制的小分子靶向抗肿瘤药上市
我国首个自主研制的小分子靶向抗肿瘤药盐酸埃克替尼正式上市，盐酸埃克替尼是靶向表皮生长因子
受体酪氨酸激酶的新一代靶向抗癌药，该药第一个适应证是晚期非小细胞肺癌。
（胡晓丽）
０１ 生 物 加 工 过 程 第９卷
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