全 文 ：第5卷第4期
2007年11月
生物加工过程
ChineseJoumalofBioprocessE“gineering
Nov．2007
·19·
木霉LaTr01菌株产漆酶发酵的条件
郑晓冰1，郭丽琼L2，付小燕1，刁惠萍1，林俊芳h2
(1．华南农业大学食品学院生物工程系，广州510640；
2．华南农业大学 生物质能研究所，广州510640)
摘要：从华南地区采集土样，采用愈创术酚平板筛选产漆酶茵株，获得了一棒短周期产漆酶的小型丝状真茵。通
过观察茼落特征、生长情况以厦显微镜下茵丝和孢子的形态，初步鉴定访茵株为木霉属的一个种(7挑d椰m
^Pp)，命名为木霉LaTr01菌株。通过单因素方法研究该茵产漆酶的发酵条件，结果表明：14Tr们的产酶培养基咀
麦芽糖为最佳碳源；以酵母提取物为最适氪源；培养24h后加入cu2+比培养开始加八cu2+【dnOl产酶活高出约
】倍。采用麦芽糖、酵母提取物、cu2+浓度k(33)的正交试验优化漆酶发酵条件，结果表明，氮潭是影响该茵产漆
酶的最重要因素，碳源次之，cu2+浓度影响较小；L日Tr01菌株产生漆酶的最佳条件为：5g／L酵母提取物、20∥L麦
芽糖、1．5姗出Lcu¨，cun加入时问为培养24h后。在优化的培养条件下，该茵酶活可达480．556u／L。
关键词：木霉；漆酶；漆酶产酶条件：正变试验
中围分类号：Q554 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2007)04—0019—06
optimization0fIaccaseproductionconditio吣ofanewlyisolated
删c矗。如珊口跟p．strainLaTr01fromsouthemChina
zHENGxiao_bin91，Guo“．qion一”，Fux ao—yanl，DIAoHui—pin91，uNJun-fangl’2
(1．D印anmeⅡt0fB10engine叩ng，cou。geofF制sci nce，Guar孵hou510“2，chi吐；
2．Insdtule0fBiomasBE11e。gyResea工曲；‰thChi啊A础ulnⅡalUni代一竹，Gu粕础ou510“2，Chi蛆)
Abstract：Anovelmycel湖fungLlsstminpmducinglacc晒ewaBi帅latedhm蚰uthemchina．11Ie8tmin
km’01w越identmed鹊乃证b如胁ⅡtPp．bymorphology．Its1acca epmductioncondjtjoⅡswereopd-
mized．Mon0．factorialexpe men丘Ire8ultsshowedthatmalto∞and丫eastextractweretheoptimalc rbon
sourcemldnitrogensource，陀8pec石ve】y，fortheIaccas8producti叩0fstminI甜l01．TheigheractiV卸
oflaccaBeDroductionwasachievedwit王ltheadditionofCu2+inthemediumafter：24hincubationofstrain
LdTr01．0rth090nalexp鲥mentresultsindicatedtllaInitrogensource，yeaste】(tractw粕themostimPo卜
诅nt砌uencingfactor甜ld5∥Lyeastextract，20g／Lmaltose，1．5mm出Lcu¨inthemedium，山e
addi60nofCu¨int}Iemediumaner24hincuba石onofstrainLaTr01w日stheoDdmalconditionfor1们．
caseproduction0fstl由n【皿Tr01．
Keywords：n撕。出丌船{Pp．；laccas8；l卵caseproducti∞conditjons；orthogonaldesign
收稿日期：20盯·04-18
基盒项目：田末自然科学基空资助项目(30671457．30371000)；广东省科技攻关资助项目(2004820Iol001)；广东省自然科学基金资助
项目(50066∞，032239)
作者简介：郑晓冰(1982一)，女，广东汕击人．项士研究生，研究方向：应用截生物。
联幕人：林傻芳，研究贞，博士生导师，E·m枷：hqf@就虮educn
万方数据
·20· 生物加工过程 第5卷第4期
漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，与植物抗坏血
酸氧化酶和哺乳动物血浆铜蓝蛋白同属于铜蓝蛋
白家族。漆酶广泛存在于担子菌、多孔菌、子囊菌、
脉孢菌、柄孢壳菌和曲霉菌等真菌中。漆酶具有强
的氧化还原活性，因此，在环境保护、食品加工、生
物检测、造纸工程等方面具有很好的应用前景”。21。
目前，漆酶在产酶条件方面已有比较广泛的研
究。碳源和氮源的选择在不同菌株的研究中有不
同的结果。在微量元素的添加方面，铜作为漆酶活
性基团的组成成分，它对漆酶的活化作用得到了研
究结果的普遍支持；另外，添加Mn2+离子对部分菌
株(例如m拓6iⅡ6Ⅻ蠡印rⅡ)产酶具有活化作用，但对
另外部分菌株(如，D汹。m☆msg础ms)却没有作用
或作用不大”o。漆酶的诱导剂多为结构和木质素
有关的低分子芳香化合物或木质素降解的碎片化
合物卜“。
目前，真菌漆酶的主要生产菌株是大型丝状真
菌担子菌中的白腐菌，这些担子菌的漆酶生产菌株
普遍存在生长速度过慢的问题，使得漆酶的工厂化
生产受到限制。本研究从华南地区的土壤中分离
到一株产漆酶的小型丝状真菌，本文报道了该菌株
的特点及最佳产漆酶条件。
l材料与方法
1．1供试菌株
供试菌株源白1—69号土样，取自华南地区的
菜地、草地、树木园、湖边淤泥中及湖边枯木堆中。
1．2培养基
筛选培养基：PDA固体培养基中加o．04％的愈
创木酚。基本产酶培养基(g／L)：可溶性淀粉20，酵
母提取物2，KH2P040．17，M萨04·7也0O．44，cacl2·
2心OQ37，吐温踟Q50ⅡI【／L，微量元素80rrlL／L；pH
自然。微量元素(g／L)：Mgs04·7H203．0，Mns04·
H，00．5，CoCl2·6H20O，1，ZnS04·7H200．1，
KAl(s04)2·12H20n01，HB 3，0l，Na2M004·
2H20n 1。
1．3产漆酶菌种的筛选
通过在固体培养基中添加指示剂——愈创木
酚的方法进行菌种初筛，产漆酶的菌株会在固体培
养基上显示特定的褐色斑圈。将所采集土样1—69
号分别取lg溶于无菌水中，稀释100倍，混匀。吸
取稀释的土样悬液1mL接种于培养基上，28℃下
培养2d后，观察菌落周围培养基颜色变化情况。
将有褐色菌圈出现的菌种挑出，在筛选培养基
上再次筛选，在PDA培养基上反复分离纯化。斜面
PDA保藏定性筛选出的产漆酶纯菌种。
1．4产漆酶菌株的鉴定
利用PDA培养基，28t培养24h后，每天观察
菌落特征及其培养特性。从PDA培养基上挑取少
许菌丝在光学显微镜下观测菌丝体、分生孢子梗及
分生孢子的形态特征。采用Gams＆Bissen分类系
统，从形态学角度对hn0l菌株进行分析鉴定”1。
1．5菌株产漆酶条件单因素试验
取活化后的L丑Tr叭菌种2块(∞．5mm)在产
酶培养基中进行摇瓶发酵培养(250mL三角瓶，培
养基体积100mL)，培养温度28℃，摇床转
数180r／min。
1．5．1cu“对菌株产漆酶的影响
设置开始培养时加入1mmoL／Lcu“和培养
24h后加入1mmol／Lcu“的实验处理，考察不同时
间加入cu“对菌株产漆酶的影响；在确定了最适
Cu“加人时间后，在培养基中添加硫酸铜溶液，使
其cu2+终浓度分别为0，0．5，1．o，1．5，2．o和2．5
mmoL／L，考察不同cu“浓度对菌株产漆酶的影响。
1r5．2诱导剂对菌株产漆酶的影响
在基本产酶培养基中分别添加0．1mmoL，L的
ABTs、愈创木酚、鞣酸作为诱导剂，以确定诱导剂对
菌株产漆酶的影响。
1．5．3氦源对菌株产漆酶的影响
分别用以下9种氮源代替基本产酶培养基中的
酵母提取物成分，配制成9种不同氮源的产酶培养
基，在培养24h后加人1mmoL／L的Cu“，考察不同
氮源对菌株产漆酶的影响。9种氮源为：酪蛋白胨
(3．o∥L)、酵母浸膏(3．0g／L)、酵母提取物(3．O
g／L)、硫酸铵(3．0g／L)、酒石酸铵(3．09／L)、酪蛋
白胨(1．5g／L)+酵母提取物(1．5g／L)、酪蛋白胨
(1．5吕／L)+酵母浸膏(1．5g／L)、酪蛋白胨(1．5
g／L)+硫酸铵(1_5g／L)、酩蛋白胨(1_0g／L)+酵
母浸膏(1．0g／L)+硫酸铵(1．og／L)。
1．5．4碳源对菌株产漆酶的影响
分别用蔗糖、麦芽糖、麦芽提取物、葡萄糖代替
基本产酶培养基中的可溶性淀粉成分，其添加质量
浓度均为20∥L，配制成含基本培养基在内56种不
同碳源的产酶培养基，在培养24h后加入lmm出L
的cu“，考察不同碳源对菌株产漆酶的影响。
万方数据
2007年11月 郑晓冰等：木霉LaTr01菌株产漆酶发酵的条件 ·2l·
1．6正交试验
在单因素试验的基础上，选择氮源、碳源、Cu“
浓度3个因素，分别设定氮源质量浓度2，5，8s／L，
碳源质量浓度15，20，25∥L，Cu“浓度0．5，1．0，
1．5mmol／L为3个水平(以Kl，K2，K3表示，cu2+
在培养24h后加入)，应用SAS8，1软件，设计正交
矩阵k(33)。
1．7漆酶活力测定方法
用ABTS作为底物测定漆酶酶活”]。测定方法
详见文献[8]。
2结果与讨论
2．1产漆酶菌株筛选结果
在众多的土样中筛选到2株菌落周围出现典型
的红褐色菌罔的小型丝状真菌(见图1，图未全附)，
将其中一株命名为LaTr01。LaTr01在PDA平板上
生长迅速，培养48h长满平板(凹，0era)，与目前产
漆酶的白腐菌菌株相比，生长速度至少快3倍。
图1 LaTr01平板筛选结果
Fig．1ThescreeningresultofLaTr01
2．2 LaTr01菌株鉴定
LaTr01在PDA平板上28℃培养24h后，菌落
为白色，呈圆形，低凸起，棉絮状，规则，放射状，边
缘圆滑；培养48h后，菌落中央变为绿色，白色棉絮
变厚实；培养72h后，整个菌落呈绿色，中央部分呈
暗绿色，菌落边缘呈深绿色，白色絮状菌丝铺于平
皿底部。LaTr01菌株的菌丝透明无色，有明显的隔
膜和分支(图2a)；LaTr01菌株的分生孢子梗对生
或互生分支(图2b)；LaTr01菌株的分生孢子为球
形或者椭圆形，孢子边缘圆滑无刺突，颜色为淡绿
色(图2c)。根据LaTr01菌落特征、生长情况以及
显微镜下茴丝和孢子的形态观察结果，初步鉴定该
菌株属于半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，
木霉属。
2．3 14n01产漆酶条件的单因素试验
2．3．1 Cu“加入时间对LaTr01产漆酶活性的
影响
培养刚开始时加入cu2+和培养24h后加入
cu2+对LaTr01产漆酶活性的影响结果见图3。图
3显示，培养刚开始时添加cu2+的实验处理，LaTr
01在摇瓶培养的24—48h间酶活不断上升，在培养
48h时酶活达到高峰，为108U／L，之后酶活一直下
降。而培养24h后加入cu2+的实验处理，酶活达到
高峰的时间较迟，但酶活较高；酶活在培养54h时
达到210．9U／L的峰值。这可能是过早加入cu“
抑制了LaTr0l的生长，使其漆酶的产生或分泌受
阻。这一结果与TavaresAPM等”。⋯报道的关于
Cu2+对自腐真菌产漆酶的诱导效果相符。
2．3．2Cu“浓度对LaTr01产漆酶活性的影响
不同cu“浓度下LaTr01产漆酶活性的测定结
果如图4。图4表明，当Cu“终浓度为0．5mmol／L
时，漆酶的酶活力最高，为251．35U／L。随着cr+
浓度的增加，漆酶活力反而降低。当Cu“浓度达到
1．5mmol／L时，漆酶的活力低于空白。可以推论，
漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，当cu“浓度在一定
范围内可以促进LaTr01产出漆酶，而当cu“浓度
过高时却对LaTr01产漆酶有抑制作用。
2．3．3不同诱导剂对LaTrol产漆酶活性的影响
不同诱导剂对LaTr01产漆酶活力的影响见图
5。从图5可以看到，没有添加诱导剂的实验处理，
LaTr01的产漆酶活性最高；添加鞣酸的实验处理，
LaTr01产漆酶活性几乎为零；添加ABTS或愈创木
酚的实验处理，LaTr01的漆酶酶活不但明显低于未
加诱导剂的空白参照，而且漆酶活性高峰的出现时
问也明显延滞。此结果与MadhaviS等”“”1前人在
多种白腐真菌上的研究结果不同。这可能是由于
LaTr01菌株对0．1mmot／L的愈创木酚、ABTS、鞣
酸的生物毒性敏感、生长受到抑制，使得漆酶活性
降低。
2．3．4不同氮源对LaTr01产漆酶活性的影响
不同氮源对hTr01产漆酶活性的影响见图6。
从图6可以看到，LaTr01在各种氮源中均在培
养36h后开始产漆酶，在培养48h时漆酶酶活达到
最高水平。LaTr01在各种氮源中的漆酶活性差异
显著，以酵母提取物为氮源的酶活力较高，其他氮
源的酶活力都很低；复合氮源的漆酶活力较低，单
万方数据
万方数据
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·24· 生物加工过程 第5卷第4期
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美国用生物柴油副产品制造饲料
美国农业研究服务机构(A画culturalResearchService)的科学家BrianKe r和WilliamDozier正为生物燃
料生产过程中产生的副产品寻求一条既环保叉经济的利用途径。他们发现，天然甘油所提供的热量等于甚
至超过玉米谷类的热量。含有质量分数10％甘油的饲料对母鸡产卵和肉鸡增肥只有极小的、甚至毫无副作
用。摄入同样含甘油饲料对猪也不产生、或仅有轻微副作用。
日本toyo工程公司计划在菲律宾建造年产20万t的生物柴油工厂
日本toyo工程公司计划在菲律宾建造一家基于椰子油的生物柴油工厂，产能预计达到20万t／a。据菲
律宾椰子局(PCA)官员称，最初预计这家工厂需要60万km2的椰子种植园来满足原料供应。但是按照现在
的计划产能，加上高产椰子的比例提高，目前可能只需要30万km2椰子种植园。官员称，这家公司的目标是
使用高产的种子，将椰子单产提高到每公顷3t，而目前菲律宾的平均椰子单产只有1t／kin2左右。日本每年
需要2．5×105L的生物柴油，以便实现在常规柴油中掺混5％生物柴油的目标。
巴西燃料乙醇平均价格已接近车用天然气
巴西国家石油管理局公布的最新数据显示，巴西燃料乙醇的平均价格为每升1．361雷亚尔(1美元约合
1．954雷亚尔)，比2006年同期下降了15．94％，已经与车用天然气的价格基本持平。巴西车用天然气的价
格I．337雷亚尔／m5，仅比每升燃料乙醇便宜0．024雷亚尔。而在去年同期，每立方米车用天然气的价格要
比每升燃料乙醇便宜0．353雷亚尔。根据巴西汽车生产商协会的统计，2007年1至7月巴西国内生产的
165万辆汽车中，这样的混合燃料车的数量超过了100万辆。
(张春鹏)
万方数据