全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&& 年 && 月
生"物"加"工"过"程
)8DEAJA+B=@EG>BC-DBU@BXAJJ0EFDEAA@DEF
fB>;! ,B;#
,Ba;$%&&
IBD%&%;!#!2P;DJJE;$ <#43;$%&&;%#;%%$
收稿日期%$%&% <%# <&4
基金项目%国家重点基础研究发展计划"!4 计划#资助项目"$%%4)-4&1%##&国家重点基础研究发展计划"!4 计划#前期研究专项资助项目
"$%&%)-((%&1#&国家杰出青年基金资助项目"$%#$(#&!#&国家自然科学基金重点资助项目"$%3#%%#&中央高校基本科研业务费
专项资助项目"+RYe9%!%&#
作者简介%祝玉洪"&!3(#$男$山东济宁人$硕士研究生$研究方向%发酵工程&李江华"联系人#$副教授$ 0*HGD>%>D*PDGEF8=GgJB8=;XBH
不透明红球菌转化合成
!
酮异己酸培养基优化
祝玉洪&$刘"龙&$周景文&$房"峻&$李江华&$堵国成&$陈"坚$
"&;江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室$无锡 $&1&$$&
$;江南大学 食品科学与技术国家重点实验室$无锡 $&1&$$#
摘"要%利用基于统计学的方法对不透明红球菌"."$/$0$00),$10),# /YT1$(% 转化合成
!
酮异己酸" O^)#的培
养环境进行优化( 采用 9>GXWA?*-=@HGE "9-#设计筛选获得对 O^)产量具有显著影响的关键营养因子%
",N
1
#
$
Y[
1
)麦芽膏和,G,[

( 通过最陡爬坡实验)-B`*-A8EWAE实验设计和 YLY软件回归分析建立了 O^)产量关
于 个关键营养因子的二次多项式模型$并以模型求解确定最佳培养条件"F2.#%",N
1
#
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Y[
1
%c$$麦芽膏 $c1$$
,G,[

&c1( 在此培养条件下$ O^)的理论最高产量为 $c!3 HF2.$在验证实验中 O^)最高产量为$c! HF2.$比
优化前"c4$ HF2.#提高了 #c1 倍(
关键词%
!
酮异己酸&优化&不透明红球菌&统计学分析
中图分类号%5!!c!4""""文献标志码%L""""文章编号%$ <#43"$%&&#%# <%%%# <%(
R0G.3I29F.I.S5F.2/724J.21L/F-01.127
!
HT0F2.12:59425F0JL
0"$1$2$22),$32),U!R VQBWC
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GIBU?AI CB@?8AJX@AAEDEFBCWAVE=?@DAE?CGX?B@JDEC>=AEXDEF
!
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K0L M24G1%
!
*WA?BDJBXGU@BG?A& BU?DHD7G?DBE& ."$/$0$00),$10),& J?G?DJ?DXJGEG>VJDJ
""
!
酮异己酸" O^)#是生物体内一种具有重要
作用的支链
!
酮酸$在新陈代谢和氧化还原状态
的维持过程中起着中心作用*& <1+ ( O^)能够抑制蛋
白质的降解*&+ $抑制胰高血糖素的分泌*$+ )糖原异
生)减缓肌肉蛋白的分解以及促进胰岛素的分
泌*+ $这些有利于生物体蛋白质的沉积)改善血浆
内氨基酸的平衡和蛋白质的合成( O^)可以节省机
体内氮的利用$在肌肉合成方面起重要作用*1+ (
O^)还可作为食品调味剂$是发酵香肠的主要风味
物质*(+ ( 因此$ O^)在医药)饲料)食品等行业有着
重要的应用前景(
国外采用氰化物化学合成法制备 O^)*#+ $工艺
路线复杂( 采用生物转化技术制备 O^)$国内外尚
处于起步阶段$生产工艺研究较少( 本文利用
9>GXWA?*-=@HGE"9-#设计$筛选获得对不透明红球
菌生长过程具有显著影响的关键营养因子$再通过
最陡爬坡试验逼近响应面区域$最后利用响应面分
析"eYT#和 YLY 软件回归分析建立 O^)产量的关
键营养因子的二次多项式模型$并通过模型求解确
定最佳培养条件*4 <3+ $以提高 O^)的产量和生产
强度(
D?材料与方法
DND?菌株
不透明红球菌"."$/$0$00),$10),#/YT1$(%$
购于美国标准菌种收藏所"Lb))#(
DNB?培养基
斜面培养基"F2.#%酪蛋白胰腺提取物 &(c%$大
豆胰腺提取物 (c%$,G)>(c%$琼脂 &(c%(
种子培养基"F2.#%酪蛋白胰腺提取物 &4c%$大
豆胰 腺 提 取 物 c%$ 葡 萄 糖 $c($ ,G)>(c%$
^
$
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1
$c((
发酵培养基"F2.#%葡萄糖 &%c%$酵母膏 (c%$
胰蛋白胨 (c%$^
$
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1
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#
$
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1
c%$- 丙氨酸 &c%(
DNQ?培养方法
菌株经斜面活化后$接种于装有 &%% H.种子培
养基的 (%% H.摇瓶中$摇床振荡培养 &( 8 "% l)
&(% @2HDE#$然后将种子液按 (h的接种量接至装有
(% H.发酵培养基的 $(% H.摇瓶中$摇床振荡培养
$1 8 "%l)&(% @2HDE#( 发酵结束后取发酵液于
1 l下冷冻离心"3 %%% @2HDE)( HDE#$离心结束后
用蒸馏水洗涤 & 次$收集菌体(
DNV?转化方法
取 %c( F湿菌体$加入 $ H.3% HHB>2.的b0L2
N)>缓冲液"UN4c##重悬$再加入 $ H.&% F2.的
- 亮氨酸底物溶液$% l反应 % HDE$然后加入
& H.三氯乙酸溶液"&%% F2.#终止反应( 将转化液
在 1 l)&% %%% @2HDE 下离心 &% HDE$取上清液测
定 O^)(
DNW?K),的测定
采用高效液相色谱法测定 O^)( 取 $ H.的转化
液$用 %c1(
$
H孔径的滤膜过滤$滤液即为待测试样(
色谱条件%LFD>AE?&$%% 型高效液相色谱仪$LFD>AE?
Y-*L_色谱柱 "1c# o$(% HH$(
$
H#$流动相为
%c%& HB>2.的",N
1
#
$
N9[
1
"UN$c(%#和甲醇的混
合溶液"两者的体积比为 !%p&%#$流速%c3 H.2HDE$
柱温 ( l$进样量 $%
$
.$检测波长$% EH(
DN@?实验设计
&c#c&"9>GXWA?*-=@HGE试验设计
根据发酵培养基配方的 3 种组分进行 &$ 次实
验"5m&$#(
&c#c$"最陡爬坡试验
根据筛选出的影响 O^)产量的显著因素的正
负效应值$确定各因素的爬坡方向和变化步长$最
快逼近响应值的最佳区域(
&c#c"响应面分析法
采用-B`*-A8EWAE 设计法$对显著因素进行进
一步研究$以获得影响 O^)产量的最佳培养
基*! <&%+ ( 根据相应的试验设计表进行试验后$用响
应面试验结果$建立二次多项式回归模型$对数据
进行二次回归拟合$分析各因素的主效应和交互效
应$最后在一定水平范围内求取最佳值( 响应面方
法已成功应用于许多生物过程培养基和操作条件
的优化*&& <&$+ (
B?结果与讨论
BND?,源对K),发酵过程的影响
分别以 &% F2.的葡萄糖)果糖)半乳糖)麦芽
糖)蔗糖)乳糖)糊精)可溶性淀粉)玉米淀粉和麦芽
糊精作为)源$筛选最适)源$实验结果见图 &( 由
图 & 可知$果糖为最适)源(
BNB?$源对K),发酵过程的影响
以果糖作为)源$分别以 ( F2.的牛肉膏)蛋白
胨)胰蛋白胨)酵母膏)麦芽膏)玉米浆),G,[

)
",N
1
#
$
Y[
1
),N
1
)>和 ,^[

作为 ,源进行最适 ,
4"第 # 期 祝玉洪等%不透明红球菌转化合成
!
酮异己酸培养基优化
&葡萄糖&$果糖&半乳糖&1麦芽糖&
(蔗糖&#乳糖&4糊精&3可溶性淀粉&!麦芽糊精
图 D?,源对K),产量的影响
O.;=D?#70:F127:54J2/1234:012/K),942G3:F.2/
源的筛选$实验结果见图 $( 由图 $ 可知$发酵产
O^)的最适,源为玉米浆$麦芽膏次之(
BNQ?X65:T0FH834I5/试验
在最适)),源的基础上$选用 5 m&$ 的 9-试
验设计( 为了增加准确性$设置 $ 个空白作为误差
分析项$对影响 O^)产量的 3 个因素进行考察( 每
个因素取高"j&#和低"<&#$ 个水平$$ 个水平的差
"""""
&牛肉膏&$蛋白胨&胰蛋白胨&1酵母膏&(麦芽膏&
#玉米浆&4,G,[

&3",N
1
#
$
Y[
1
&!,N
1
)>&&% ,^[

图 B?$源对K),产量的影响
O.;=B?#70:F127/.F42;0/1234:012/K),942G3:F.2/
值不能过大$以防掩盖了其他因素的重要性$高水
平是低水平的 &c$( 倍*&+ ( 试验设计及结果如表 &
所示( 运用 YLY 软件分别计算各因素的效应值$并
对各因素效应进行 7检验$选择置信度较高的因素
作为显著因素进一步考察$结果见表 $( 由表 $ 可
知$对 O^)发酵过程有显著影响"置信度大于 !(h#
的因素有",N
1
#
$
Y[
1
)麦芽膏和,G,[

(
表 D?X65:T0FH834I5/试验设计及响应值"4YDB#
E5J60D?#Z904.I0/F56G01.;/5/G40192/10A5630127X65:T0FH834I5/"4YDB#
序号
"
"因素#2"F!.<&#
=
&
果糖
=
$
玉米浆
=

麦芽膏
=
1
误差项
=
(
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1
#
$
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1
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#
,G,[

=
4
误差项
=
3
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3 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
表 B?X65:T0FH834I5/试验主效应分析
E5J60B?*/56L1.127F-0I5./070:F724X65:T0FH834I5/
因素 7 大于7的概率 重要性排列
果糖 &c433 $$ %c$1 (!& 4
玉米浆 <&c1#! %c3% 1( 3
麦芽膏 <3c!%$ 4$ %c%4& $& $
误差项 1c1 $$# %c&11 %#4
",N
1
#
$
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1
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,G,[

<3c1(# !3 %c%41 !$!
误差项 <(c1#( $& %c&&( $&&
^
$
N9[
1
<#c&&3 ## %c&% &1 (
TFY[
1
)G)>
$
<4c#!3 3# %c%3$ $ 1
BNV?最陡爬坡试验
响应面拟合模型只有在考察的临近区域里才能
充分近似真实情况$所以应先逼近最大产量区域后再
建立有效的拟合模型*&1+ ( 根据9-法筛选出的显著
因子效应大小设计它们的步长$进行最陡爬坡试验设
计$寻找最大区域( 试验设计及结果如表 所示( 由
表 可知%最大产酸区在第 1次实验附近$故以实验 1
的条件为响应面实验因素水平的中心点(
表 Q?最陡爬坡试验设计及结果
E5J60Q?U01.;/5/G40136F1271F00901F5::0/F0Z904.I0/F1
序
号
"
"麦芽膏#2
"F!.
<&
#
"
"",N
1
#
$
Y[
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"F!.
<&
#
"
",G,[

#2
"F!.
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#
"
" O^)#2
"HF!.
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#
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$ ( %c( $c% &#c%
1 %c1 &c# &3c44
1 %c &c$ $%c($
( $ %c$ %c3 &4c$3
# & %c& %c1 &#c$
BNW?响应面分析试验设计筛选重要因素的最优浓
度水平
$c(c&"响应面分析试验
根据得到的最大响应值区域$对影响 O^)产量的
个显著因素进行响应面试验设计$以",N
1
#
$
Y[
1
)麦
芽膏和,G,[

个重要因素为自变量$ O^)产量为应
变量( 响应面试验设计及结果见表 1(
表 V?响应面试验设计及结果
E5J60V?,0/F456:2I921.F0G01.;/5/G:2440192/G./; 40136F1
实
验
号
=
&
"
"",N
1
#
$
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1
#2
"F!.
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#
=
$
"
"麦芽膏#2
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#
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#
& <&"%c$# <&"$# %"%c3# $%c(3
$ <& &"1# % &4c$4
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! <& %"# <& $%c14
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&& <& % & $&c4
&$ & % & &1c&&
& % % % $$c&%
&1 % % % $$c(
&( % % % $c11
$c(c$"二次回归模型拟合
以试验结果建立描述响应量与自变量关系的
二次多项式回归模型$运用 YLY 软件对试验数据回
归拟合$得到二次多项式回归模型%
@m<1&c&1 ( j&(%c&33 &=
&
j&c3% $=
$
j
1$c3 4(=

<(#c$# #=
$
&
j&3c!& 3$=
&
=
$
<
&(c&! 1!=
&
=

<$c%1 #(3=
$
$
<#c4&% 33=
$
=

<
4c#11 &#$=
$

"&#
4m%c&%& 3 q%c&$失拟不显著( 模型的决定
系数.$为 %c!$ $说明回归方程的拟合程度较好(
所以$该模型可以用于 O^)产量响应值变化的预测
和分析(
$c(c"响应面分析及最优培养基成分确定
利用 YLY软件对回归模型进行响应面分析$考
察所拟合的响应曲面的形状$得到各响应面立体分
析图和相应等高图$见图 k图 (( 由图及软件分析
可知$回归方程存在稳定点( 通过岭嵴分析"@DIFA
GEG>VJDJ#得到极大值所对应的各主要因素"=
&
)=
$
)
=

#的编码值分别为 "<%c(3)<%c!1) %c#! #$即
",N
1
#
$
Y[
1
)麦芽膏和 ,G,[

的最佳质量浓度分别
为 %c$)$c1$ 和 &c1 F2.$在此条件下 O^)的理论
最高产量为 $c!3 HF2.(
!"第 # 期 祝玉洪等%不透明红球菌转化合成
!
酮异己酸培养基优化
图 Q?"$"
V
#
B
!+
V
与麦芽膏交互影响K),产量的
曲面和等高线
O.;=Q?#70:F127"$"
V
#
B
!+
V
5/GI56F0ZF45:F
2/K),942G3:F.2/
图 V?"$"
V
#
B
!+
V
与$5$+
Q
交互影响K),产量的
曲面和等高线
O.;=V?#70:F127"$"
V
#
B
!+
V
5/G$5$+
Q
2/K),942G3:F.2/
图 W?麦芽膏与$5$+
Q
交互影响K),产量的
曲面和等高线
O.;=W?#70:F127I56F0ZF45:F5/G$5$+
Q
2/K),
942G3:F.2/
为验证所建立模型的有效性$在优化条件下进
行验证实验( O^)产量为 $c! HF2.$与理论预测
值基本吻合$表明本文所建立的模型是合理有效
的$可用于 O^)发酵过程的分析与预测(
Q?结论
对不透明红球菌转化合成 O^)的培养基进行了
优化研究$最佳培养条件"F2.#%",N
1
#
$
Y[
1
%c$$麦
芽膏 $c1$$,G,[

&c1( 在此培养条件下$ O^)的理
论最高产量为 $c!3 HF2.$在验证实验中 O^)最高
产量为 $c! HF2.$与理论预测相符$同时与优化前
相比"c4$ HF2.#$ O^)产量提高到 #c1倍(
参考文献%
* & +"/GEDA>M$TGXWAE7DAS$0>D7G6A?8 /$A?G>;0CAX?JBC
!
*WA?BDJBXG*
U@BG?AGEI BC>A=XDEABE ED?@BFAE HA?G6B>DJH UBJ?BUA@G?DaAUG*
?DAE?J*++;L@X8 -DBX8AH-DBU8VJ$&!3&$$!!"&#%(4*#$;
* $ +"NADJJDFN$R@6GE ^L$NGJ?AI?^ $A?G>;TAX8GEDJHBC?8ADEJ=*
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*WA?BDJBXGU@BG?AGEI @A>G?AI
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*WA?BGXDI
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* +"NB>7AY$9GE?AE R;Y?=IDAJBE ?8A@B>ABC6A?G*XA>HA?G6B>DJHDE
?8ADEJ=>DEB?@BUDXACAX?BCG>U8G*WA?BDJBXGU@BDXGXDI*++;-DBX8DH
-DBU8VJLX?G$&!4!$(33"$#%$&&*$&3;
* 1 +",DJJAE Y$]GDI>AVb/$ZDHHA@HGE /e;)B>BJ?@G>HD>W CG?UA@*
XAE?GFAGEI UDFUA@CB@HGEXAG@AAE8GEXAI 6VCAAIDEF?8A>A=XDEA
HA?G6B>D?A6A?G*8VI@B`V*6A?G*HA?8V>6=?V@G?A?BJB\J*++;+LEDH
YXD$&!!1$4$%$&*$4;
* ( +".G@B=?=@A*b8DaAV@G?)$TBE?A>T);0CAX?JBCAEaD@BEHAE?G>CGX*
?B@JBE >A=XDEAXG?G6B>DJH6V!%5$607&%+)81+,0+0$#*++;OE?+
]BBI TDX@B6DB>$$%%$3&"#%&44*&31;
* # +"祝馨怡$苏桂琴$张伟强$等;
$
酮酸)
$
酮酸酯及
$
酮酰胺
的合成进展*++;合成化学$$%%&$!"(#%!%*!#;
* 4 +"欧宏宇$贾士儒;YLY 软件在微生物培养条件优化中的应用
*++;天津轻工业学院报$$%%&"&#%&1*&3;
* 3 +" G^>D>Y +$TG=FA@D]$eBI@DF=AJTO;eAJUBEJAJ=@CGXAGEG>VJDJGEI
JDH=>G?DBE GJG?BB>CB@6DBU@BXAJJIAJDFE GEI BU?DHD7G?DBE*++;
9@BXAJJ-DBX8AH$$%%%$(%(!*((%;
* ! +"]A@AD@GY .)$-@=EJe0$]A@AD@GNY$A?G>;-B`*-A8EWAE IA*
JDFE%GE G>?A@EG?DaACB@?8ABU?DHD7G?DBE BCGEG>V?DXG>HA?8BIJ*++;
LEG>V?DXG)8DHDXGLX?G$$%%4$(!4%&4!*&3#;
*&%+",F=VAE , $^-B@WB\JWD++;,A\*>AaA>@AJUBEJAJ=@CGXAIAJDFEJ
XBEJ?@=X?AI C@BHDEXBHU>A?A6>BXW IAJDFEJ*++;+Y?G?DJ?9>GEE OE*
CA@AEXA$$%%3$&3"&#%$!1*%(;
*&&+"董国秀$陶文沂;响应面法优化福鸽霉素发酵培养基*++;生
物加工过程$$%%3$#"#%($*(#;
*&$+"李相$刘云$杨江科;基于响应面设计脂肪酶 ,BaB1( 催化合
成甘油二酯的工艺优化*++;生物加工过程$$%%!$4 "(#%
&*&3;
*&+"刘建忠$熊亚红$翁丽萍$等;生物过程的优化*++;中山大学
学报%自然科学版$$%%$$1&"Y&#%&$*&4;
*&1+"TBE?FBHA@V/);/AJDFE GEI GEG>VJDJBCA`UA@DHAE?J*T+;@I
AI;,A\KB@W%+B8E SD>AVGEI YBEJ$&!!&;
%& 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"