全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&& 年 && 月 生"物"加"工"过"程 )8DEAJA+B=@EG>BC-DBU@BXAJJ0EFDEAA@DEF fB>;! ,B;# ,Ba;$%&&
IBD%&%;!#!2P;DJJE;$<#43;$%&&;%#;%%$收稿日期%$%&% <%# <&4
基金项目%国家重点基础研究发展计划"!4 计划#资助项目"$%%4)-4&1%##&国家重点基础研究发展计划"!4 计划#前期研究专项资助项目 "$%&%)-((%&1#&国家杰出青年基金资助项目"$%#$(#&!#&国家自然科学基金重点资助项目"$%3#%%#&中央高校基本科研业务费 专项资助项目"+RYe9%!%&# 作者简介%祝玉洪"&!3(#$男$山东济宁人$硕士研究生$研究方向%发酵工程&李江华"联系人#$副教授$0*HGD>%>D*PDGEF8=GgJB8=;XBH 不透明红球菌转化合成 ! 酮异己酸培养基优化 祝玉洪&$刘"龙&$周景文&$房"峻&$李江华&$堵国成&$陈"坚$
"&;江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室$无锡$&1& $$& $;江南大学 食品科学与技术国家重点实验室$无锡 $&1&$$ #
摘"要%利用基于统计学的方法对不透明红球菌"."$/$0$00),$10),# /YT1$(% 转化合成 ! 酮异己酸" O^)#的培 养环境进行优化( 采用 9>GXWA?*-=@HGE "9-#设计筛选获得对 O^)产量具有显著影响的关键营养因子% ",N 1 #$
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1
)麦芽膏和,G,[

( 通过最陡爬坡实验)-B`*-A8EWAE实验设计和 YLY软件回归分析建立了 O^)产量关
于 个关键营养因子的二次多项式模型$并以模型求解确定最佳培养条件"F2.#%",N 1 #$
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1
%c $$麦芽膏 $c1$$
,G,[

&c1( 在此培养条件下$O^)的理论最高产量为$c!3 HF2.$在验证实验中 O^)最高产量为$c! HF2.$比 优化前"c4$ HF2.#提高了 #c1 倍(
关键词%
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酮异己酸&优化&不透明红球菌&统计学分析
中图分类号%5!!c!4""""文献标志码%L""""文章编号%$<#43"$%&&#%# <%%%# <%(
R0G.3I29F.I.S5F.2/724J.21L/F-01.127
!
HT0F2.12:59425F0JL
0"$1$2$22),$32),U!R VQBWC
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K0L M24G1%
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*WA?BDJBXGU@BG?A& BU?DHD7G?DBE& ."$/$0$00),$10),& J?G?DJ?DXJGEG>VJDJ
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酮异己酸" O^)#是生物体内一种具有重要
作用的支链
!
酮酸$在新陈代谢和氧化还原状态 的维持过程中起着中心作用*& <1+ ( O^)能够抑制蛋 白质的降解*&+$抑制胰高血糖素的分泌*$+ )糖原异 生)减缓肌肉蛋白的分解以及促进胰岛素的分 泌*+$这些有利于生物体蛋白质的沉积)改善血浆
内氨基酸的平衡和蛋白质的合成( O^)可以节省机
体内氮的利用$在肌肉合成方面起重要作用*1+ ( O^)还可作为食品调味剂$是发酵香肠的主要风味
物质*(+ ( 因此$O^)在医药)饲料)食品等行业有着 重要的应用前景( 国外采用氰化物化学合成法制备 O^)*#+$工艺
路线复杂( 采用生物转化技术制备 O^)$国内外尚 处于起步阶段$生产工艺研究较少( 本文利用
9>GXWA?*-=@HGE"9-#设计$筛选获得对不透明红球 菌生长过程具有显著影响的关键营养因子$再通过
最陡爬坡试验逼近响应面区域$最后利用响应面分 析"eYT#和 YLY 软件回归分析建立 O^)产量的关 键营养因子的二次多项式模型$并通过模型求解确
定最佳培养条件*4 <3+ $以提高 O^)的产量和生产 强度( D?材料与方法 DND?菌株 不透明红球菌"."$/$0$00),$10),#/YT1$(%$购于美国标准菌种收藏所"Lb))#( DNB?培养基 斜面培养基"F2.#%酪蛋白胰腺提取物 &(c%$大
豆胰腺提取物 (c%$,G)>(c%$琼脂 &(c%(
种子培养基"F2.#%酪蛋白胰腺提取物 &4c%$大 豆胰 腺 提 取 物 c%$ 葡 萄 糖 $c($ ,G)>(c%$^$
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$c(( 发酵培养基"F2.#%葡萄糖 &%c%$酵母膏 (c%$胰蛋白胨 (c%$^
$N9[ 1 %c($ N^
$9[ 1 %c($TFY[
1
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$Y[ 1 c%$- 丙氨酸 &c%(
DNQ?培养方法
菌株经斜面活化后$接种于装有 &%% H.种子培 养基的 (%% H.摇瓶中$摇床振荡培养 &( 8 "% l)
&(% @2HDE#$然后将种子液按 (h的接种量接至装有 (% H.发酵培养基的$(% H.摇瓶中$摇床振荡培养$1 8 "%l)&(% @2HDE#( 发酵结束后取发酵液于
1 l下冷冻离心"3 %%% @2HDE)( HDE#$离心结束后 用蒸馏水洗涤 & 次$收集菌体(
DNV?转化方法
取 %c( F湿菌体$加入$ H.3% HHB>2.的b0L2
N)>缓冲液"UN4c##重悬$再加入$ H.&% F2.的
- 亮氨酸底物溶液$% l反应 % HDE$然后加入
& H.三氯乙酸溶液"&%% F2.#终止反应( 将转化液
在 1 l)&% %%% @2HDE 下离心 &% HDE$取上清液测 定 O^)( DNW?K),的测定 采用高效液相色谱法测定 O^)( 取$ H.的转化
液$用 %c1($
H孔径的滤膜过滤$滤液即为待测试样( 色谱条件%LFD>AE?&$%% 型高效液相色谱仪$LFD>AE? Y-*L_色谱柱 "1c# o$(% HH$($
H#$流动相为 %c%& HB>2.的",N 1 #$
N9[
1
"UN$c(%#和甲醇的混 合溶液"两者的体积比为 !%p&%#$流速%c3 H.2HDE$柱温 ( l$进样量 $%$
.$检测波长$% EH(
DN@?实验设计
&c#c&"9>GXWA?*-=@HGE试验设计
根据发酵培养基配方的 3 种组分进行 &$次实 验"5m&$#(
&c#c$"最陡爬坡试验 根据筛选出的影响 O^)产量的显著因素的正 负效应值$确定各因素的爬坡方向和变化步长$最 快逼近响应值的最佳区域( &c#c"响应面分析法 采用-B`*-A8EWAE 设计法$对显著因素进行进
一步研究$以获得影响 O^)产量的最佳培养 基*! <&%+ ( 根据相应的试验设计表进行试验后$用响
应面试验结果$建立二次多项式回归模型$对数据
进行二次回归拟合$分析各因素的主效应和交互效 应$最后在一定水平范围内求取最佳值( 响应面方
法已成功应用于许多生物过程培养基和操作条件
的优化*&& <&$+ ( B?结果与讨论 BND?,源对K),发酵过程的影响 分别以 &% F2.的葡萄糖)果糖)半乳糖)麦芽 糖)蔗糖)乳糖)糊精)可溶性淀粉)玉米淀粉和麦芽 糊精作为)源$筛选最适)源$实验结果见图 &( 由 图 & 可知$果糖为最适)源(
BNB?$源对K),发酵过程的影响 以果糖作为)源$分别以 ( F2.的牛肉膏)蛋白
胨)胰蛋白胨)酵母膏)麦芽膏)玉米浆),G,[

)
",N
1
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$Y[ 1 ),N 1 )>和 ,^[ 作为 ,源进行最适 , 4"第 # 期 祝玉洪等%不透明红球菌转化合成 ! 酮异己酸培养基优化 &葡萄糖&$果糖&半乳糖&1麦芽糖&
(蔗糖&#乳糖&4糊精&3可溶性淀粉&!麦芽糊精
图 D?,源对K),产量的影响
O.;=D?#70:F127:54J2/1234:012/K),942G3:F.2/
源的筛选$实验结果见图$( 由图 $可知$发酵产
O^)的最适,源为玉米浆$麦芽膏次之( BNQ?X65:T0FH834I5/试验 在最适)),源的基础上$选用 5 m&$的 9-试 验设计( 为了增加准确性$设置 $个空白作为误差 分析项$对影响 O^)产量的 3 个因素进行考察( 每
个因素取高"j&#和低"<&#$个水平$$个水平的差 """"" &牛肉膏&$蛋白胨&胰蛋白胨&1酵母膏&(麦芽膏&
#玉米浆&4,G,[

&3",N
1
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$Y[ 1 &!,N 1 )>&&% ,^[ 图 B?$源对K),产量的影响
O.;=B?#70:F127/.F42;0/1234:012/K),942G3:F.2/
值不能过大$以防掩盖了其他因素的重要性$高水
平是低水平的 &c$( 倍*&+ ( 试验设计及结果如表 & 所示( 运用 YLY 软件分别计算各因素的效应值$并
对各因素效应进行 7检验$选择置信度较高的因素 作为显著因素进一步考察$结果见表 $( 由表$ 可
知$对 O^)发酵过程有显著影响"置信度大于 !(h# 的因素有",N 1 #$
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)麦芽膏和,G,[

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表 D?X65:T0FH834I5/试验设计及响应值"4YDB#
E5J60D?#Z904.I0/F56G01.;/5/G40192/10A5630127X65:T0FH834I5/"4YDB#
序号
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&$<& <& <& <& <& <& <& <& <& <& &1c#$
3 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
表 B?X65:T0FH834I5/试验主效应分析
E5J60B?*/56L1.127F-0I5./070:F724X65:T0FH834I5/
因素 7 大于7的概率 重要性排列
果糖 &c433 $$%c$1 (!& 4 玉米浆 <&c1#! %c3% 1( 3 麦芽膏 <3c!%$ 4$ %c%4& $& $ 误差项 1c1$$ # %c&11 %#4
",N
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$Y[ 1 <$%c&3$3 %c%& (&4 & ,G,[ <3c1(# !3 %c%41 !$!
误差项 <(c1#( $& %c&&($&&
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$<4c#!3 3# %c%3$ $1 BNV?最陡爬坡试验 响应面拟合模型只有在考察的临近区域里才能 充分近似真实情况$所以应先逼近最大产量区域后再
建立有效的拟合模型*&1+ ( 根据9-法筛选出的显著
因子效应大小设计它们的步长$进行最陡爬坡试验设 计$寻找最大区域( 试验设计及结果如表 所示( 由
表 可知%最大产酸区在第 1次实验附近$故以实验 1 的条件为响应面实验因素水平的中心点( 表 Q?最陡爬坡试验设计及结果 E5J60Q?U01.;/5/G40136F1271F00901F5::0/F0Z904.I0/F1 序 号 " "麦芽膏#2 "F!. <& # " "",N 1 #$
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( $%c$ %c3 &4c$3 # & %c& %c1 &#c$
BNW?响应面分析试验设计筛选重要因素的最优浓
度水平
$c(c&"响应面分析试验 根据得到的最大响应值区域$对影响 O^)产量的
个显著因素进行响应面试验设计$以",N 1 #$
Y[
1
)麦
芽膏和,G,[

个重要因素为自变量$O^)产量为应 变量( 响应面试验设计及结果见表 1( 表 V?响应面试验设计及结果 E5J60V?,0/F456:2I921.F0G01.;/5/G:2440192/G./; 40136F1 实 验 号 = & " "",N 1 #$
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$" "麦芽膏#2 "F!. <& # = " ",G,[ #2 "F!. <& # @2 "HF!. <& # & <&"%c$# <&"$# %"%c3#$%c(3
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( %"%c# <& <&"%c3# &3c3%
# % <& &"&c## $c4( 4 % & <&$%c1#
3 % & & &1c#4
! <& %"# <& $%c14 &% & % <& &(c% && <& % &$&c4
&$& % & &1c&& & % % %$$c&% &1 % % %$$c( &( % % %$c11
$c(c$"二次回归模型拟合
以试验结果建立描述响应量与自变量关系的
二次多项式回归模型$运用 YLY 软件对试验数据回 归拟合$得到二次多项式回归模型%
@m<1&c&1 ( j&(%c&33 &=
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$"&# 4m%c&%& 3 q%c&$失拟不显著( 模型的决定
系数.$为 %c!$ $说明回归方程的拟合程度较好( 所以$该模型可以用于 O^)产量响应值变化的预测
和分析(
$c(c"响应面分析及最优培养基成分确定 利用 YLY软件对回归模型进行响应面分析$考
察所拟合的响应曲面的形状$得到各响应面立体分 析图和相应等高图$见图 k图 (( 由图及软件分析
可知$回归方程存在稳定点( 通过岭嵴分析"@DIFA GEG>VJDJ#得到极大值所对应的各主要因素"= & )=$
)
=

#的编码值分别为 "<%c(3)<%c!1) %c#! #$即 ",N 1 #$
Y[
1
)麦芽膏和 ,G,[

的最佳质量浓度分别
为 %c$)$c1$和 &c1 F2.$在此条件下 O^)的理论
最高产量为 $c!3 HF2.( !"第 # 期 祝玉洪等%不透明红球菌转化合成 ! 酮异己酸培养基优化 图 Q?"$"
V
#
B
!+
V
与麦芽膏交互影响K),产量的
曲面和等高线
O.;=Q?#70:F127"$" V # B !+ V 5/GI56F0ZF45:F 2/K),942G3:F.2/ 图 V?"$"
V
#
B
!+
V
与$5$+
Q
交互影响K),产量的
曲面和等高线
O.;=V?#70:F127"$" V # B !+ V 5/G$5$+ Q 2/K),942G3:F.2/ 图 W?麦芽膏与$5$+ Q 交互影响K),产量的 曲面和等高线 O.;=W?#70:F127I56F0ZF45:F5/G$5$+ Q 2/K), 942G3:F.2/ 为验证所建立模型的有效性$在优化条件下进
行验证实验( O^)产量为 $c! HF2.$与理论预测
值基本吻合$表明本文所建立的模型是合理有效 的$可用于 O^)发酵过程的分析与预测(
Q?结论
对不透明红球菌转化合成 O^)的培养基进行了
优化研究$最佳培养条件"F2.#%",N 1 #$
Y[
1
%c $$麦 芽膏 $c1$$ ,G,[

&c1( 在此培养条件下$O^)的理 论最高产量为$c!3 HF2.$在验证实验中 O^)最高 产量为$c! HF2.$与理论预测相符$同时与优化前
相比"c4$HF2.#$ O^)产量提高到 #c1倍(
参考文献%
* & +"/GEDA>M$TGXWAE7DAS$0>D7G6A?8 /$A?G>;0CAX?JBC ! *WA?BDJBXG* U@BG?AGEI BC>A=XDEABE ED?@BFAE HA?G6B>DJH UBJ?BUA@G?DaAUG* ?DAE?J*++;L@X8 -DBX8AH-DBU8VJ$&!3& $$!!"&#%(4*#$; * $ +"NADJJDFN$R@6GE ^L$NGJ?AI?^ $A?G>;TAX8GEDJHBC?8ADEJ=* >DE*@A>AGJDEFGX?DBE BC ! *WA?BDJBXGU@BG?AGEI @A>G?AI ! *WA?BGXDI GEDBEJ*++;TB>98G@H$$ %%($#3"1#%&%!4*&&%(; * +"NB>7AY$9GE?AE R;Y?=IDAJBE ?8A@B>ABC6A?G*XA>HA?G6B>DJHDE
?8ADEJ=>DEB?@BUDXACAX?BCG>U8G*WA?BDJBXGU@BDXGXDI*++;-DBX8DH
-DBU8VJLX?G$&!4!$(33"$#%$&&*$&3; * 1 +",DJJAE Y$]GDI>AVb/$ZDHHA@HGE /e;)B>BJ?@G>HD>W CG?UA@* XAE?GFAGEI UDFUA@CB@HGEXAG@AAE8GEXAI 6VCAAIDEF?8A>A=XDEA HA?G6B>D?A6A?G*8VI@B`V*6A?G*HA?8V>6=?V@G?A?BJB\J*++;+LEDH YXD$&!!1$4$%$&*$4;
* ( +".G@B=?=@A*b8DaAV@G?)$TBE?A>T);0CAX?JBCAEaD@BEHAE?G>CGX* ?B@JBE >A=XDEAXG?G6B>DJH6V!%5$607&%+)81+,0+0$#*++;OE?+ ]BBI TDX@B6DB>$$%%$3&"#%&44*&31;
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酮酸)
$酮酸酯及$
酮酰胺
的合成进展*++;合成化学 $$%%&$!"(#%!%*!#; * 4 +"欧宏宇$贾士儒;YLY 软件在微生物培养条件优化中的应用 *++;天津轻工业学院报$$ %%&"&#%&1*&3;
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JDH=>G?DBE GJG?BB>CB@6DBU@BXAJJIAJDFE GEI BU?DHD7G?DBE*++;
9@BXAJJ-DBX8AH $$%%%$(%(!*((%; * ! +"]A@AD@GY .)$-@=EJe0$]A@AD@GNY$A?G>;-B`*-A8EWAE IA* JDFE%GE G>?A@EG?DaACB@?8ABU?DHD7G?DBE BCGEG>V?DXG>HA?8BIJ*++; LEG>V?DXG)8DHDXGLX?G$$ %%4$(!4%&4!*&3#; *&%+",F=VAE ,$^-B@WB\JWD++;,A\*>AaA>@AJUBEJAJ=@CGXAIAJDFEJ
XBEJ?@=X?AI C@BHDEXBHU>A?A6>BXW IAJDFEJ*++;+Y?G?DJ?9>GEE OE*
CA@AEXA $$%%3$&3"&#%$!1*%(; *&&+"董国秀$陶文沂;响应面法优化福鸽霉素发酵培养基*++;生 物加工过程$$ %%3$#"#%($*(#;
*&$+"李相$刘云$杨江科;基于响应面设计脂肪酶 ,BaB1( 催化合 成甘油二酯的工艺优化*++;生物加工过程$$%%!$4 "(#%
&*&3;
*&+"刘建忠$熊亚红$翁丽萍$等;生物过程的优化*++;中山大学 学报%自然科学版$$%%$$1&"Y&#%&$*&4;
*&1+"TBE?FBHA@V/);/AJDFE GEI GEG>VJDJBCA`UA@DHAE?J*T+;@I
AI;,A\KB@W%+B8E SD>AVGEI YBEJ$&!!&;
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