全 文 ：第 ! 卷第 " 期
"##$ 年 $ 月
生 物 加 工 过 程
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· $!9 ·
核酸酶 :! 催化水解热变性 ;<=的研究
吴永宏，肖明芳，吕9 浩，应汉杰!
（南京工业大学 制药与生命科学学院，南京 ">###?）
摘9 要：用桔青霉菌株 @7#"（!"#$%$&&$’( %$)*$#’( @7#"）发酵制得的核酸酶 :> 催化水解热变性 ;<=，在研究温度、
底物浓度、3A、酶加入量等因素对水解结果的影响的实验基础上，通过正交实验获得最佳的工艺条件：温度 $B C，
3A DE $，;<=质量浓度 FE # 6 G H，酶加入量 FI，脱氧核苷酸的得率 ?"I。在此基础上推导出其催化米氏常数 +( J
$E B>B K ># L" 6 G H。
关键词：核酸酶 :>；水解；热变性 ;<=；优化；米氏常数
中图分类号：MB>FN ?9 9 9 9 文献标识码：=9 9 9 9 文章编号：>DO" L !DOB（"##$）#" L ##$! L #$
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08\’4 4,(Y’\’,( _/* ,^\/’()Y \&.,-6& ,.\&,6,(/0 \)*\，\&/\ _/* \)Z3)./\-.) $B C，3A DE $，\&) Z/** 4,(S
4)(\./\’,( ,1 ;<= FE # 6 G H，\&) 4,(4)(\./\’,( ,1 )(‘8Z) FI N ]&) 8’)0Y ./\) ,1 ;<= _/* ?"I N 2/*)Y ,(
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L" 6 G HN
:’, ;)1%(：(-40)/*) :>；&8Y.,08*’*；&)/\SY)(/\-.)Y ;<=；,3\’Z’‘/\’,(；7’4&/)0’* 4,(*\/(9 9 核酸酶 :>（5%!E >E !#E >）是一种含锌金属酶，
由桔青霉（!"#$%$&&$’( %$)*$#’(）发酵制得，可以水解
b<=和热变性 ;<=的磷酸二酯键而得到 $cS核苷酸
和 $cS脱氧核苷酸［>S!］。脱氧尿嘧啶核苷酸和脱氧胞
嘧啶核苷酸的衍生物具有良好的抗病毒效果［F］，脱
氧核苷酸在临床上主要用于医治白血球细胞减少
症，对再生障碍性贫血、血小板减少、肝炎等病症也
有较好的疗效［$］。用核酸酶 :> 催化水解热变性
;<=制取脱氧核苷酸是制备这类药物的有效方法
之一。目前国内对脱氧核苷酸还没有规模化制备，
而且对热变性 ;<= 的水解或脱氧核苷酸的应用基
础研究也鲜见报道。本文对核酸酶 :> 催化水解热
变性 ;<=的反应条件做了深入研究，为工业开发应
用提供了可靠的参考数据。
!< 材料与方法
>E >9 主要药品及仪器
脱氧核糖核酸（;<=），中国医药（集团）上海化
学试剂公司；脱氧胸腺嘧啶核苷酸（]7:），脱氧胞
嘧啶核苷酸（Y%7:），脱氧鸟嘌呤核苷酸（YV7:），
! 收稿日期："##$S#FS#>
基金项目：教育部跨世纪优秀人才培养基金，江苏省教育厅“!!!”工程基金项目
作者简介：吴永宏（>?O>S），硕士研究生，研究方向：生物工程。
联系人：应汉杰，5SZ/’0：8’(6&/(W’)>!Fd >D!N 4,Z万方数据
! · "#! · 生物加工过程 第 $ 卷第 % 期
脱氧腺嘌呤核苷酸（&’()），*+,-.公司。
/0102* 3"44 型紫外可见分光光度计，上海天
美科学仪器有限责任公司；5671!. 回转式恒温调
速摇瓶柜，上海欣蕊自动化设备有限公司；89:;-.<
高效液相色谱仪，89:;-.<公司。
=> %! 分析方法
核酸酶 )=的活力测定法（紫外法）。
将 => ? -@的底物溶液（含有质量分数为 =A左
右的 BC’，4> % -DE F @ G5 "> % 的醋酸缓冲液）于 H4
I恒温水浴 =4 -+< 后，加入 4> = -@ 经适当稀释的
酶液，H4 I保温 =" -+< 后加入 %> 4 -@ 核酸沉淀剂
（4> %"A钼酸铵1%> "A过氯酸），冰水浴 %4 -+< 后离
心、取上清夜用蒸馏水稀释一定倍数，测定其于 %J4
<-处的吸光值为 !%J4。以先加沉淀剂者作为对照，
其它操作同前。在上述条件下，每 -+< 所生成的核
苷酸量在 %J4 <- 处的吸光值的差值为 => 4 时定义
为 = 个酶活力单位 K。其计算公式如下：
酶活力（K）L
#!%J4 " # " $
4M = N =" L %> JH#$#!%J4
OC’浓度的检测：用定磷法［J］检测。
水解产物中 # 种脱氧核苷酸的检测方法：用高
效液相色谱仪检测，色谱条件如下：色谱柱：江苏淮
阴汉邦科技有限公司制 @+:PQDRGP9Q S=3 柱 " #> J
-- N %"4 --，" #-；流动相：’：%4 --DE F @ 的
（C5#）%5)T#溶液（用重蒸水配制）；8：甲醇，梯度洗
脱。流速：= -@ F -+<；检测波长：%"# <-；进样量：%4
#@。
=> $! 实验方法
=> $> =! 菌! 株
本实验室保存的经过离子注入的桔青霉诱变菌
株 2(4%。
=> $> %! 核酸酶 )= 的发酵制备
=> $> %> =! 培养基!
斜面培养基：麦芽汁培养基。
液体种子培养基（, F @）：葡萄糖 "4，蛋白胨 "，
U5%)T#4> "，U%5)T#·$5%T 4> "，(,*T# 4> #，S.SE%
4> #，G5 J> "。
初始发酵培养基（ , F @）：液体种子培养基 V
W<*T#·H5%T 4> #，G5 J> "。
=> $> %> %! 液体种子液培养
%"4 -@三角瓶装 "4 -@液体种子培养基，接入
= :-%大小的桔青霉菌块，于 %"4 Q F -+<、%? X $4 I条
件下培养 %# P。
=> $> %> $! 酶源制备
%"4 -@三角瓶装 "4 -@ 初始发酵培养基培养
基，按 =4A（体积分数）的接种量接种，于 %3 I、%"4
Q F -+<条件下发酵培养 %# P。
=> $> %> #! 核酸酶 )= 的分离纯化
收集“=> $> %> $”的发酵液，抽滤除去固形物，滤
液用截留分子量 =4 444 的中空纤维膜超滤至原滤
液体积的 = F =4，测酶活，放入冰箱 # I冷藏待用。
=> $> $! 热变性 OC’的制备
称取一定量的 OC’溶解于一定体积的水中，搅
拌溶解完全后，加热至沸腾，保持 =" -+< 后取出，迅
速冷却至室温。
=> $> #! 核酸酶 )= 催化水解热变性 OC’
取一定体积的“=> $> $”法得到的热变性 OC’，
调节其 G5，用定磷法［J］检测其浓度，放置水浴，在某
一温度下预热 $4 -+<，加入一定量的核酸酶 )=（本
文所用核酸酶 )= 的酶活都为 = "44 K），混匀。反应
一段时间后取出，放入冰浴，吸取 = -@水解液，稀释
一定的倍数，用高效液相色谱仪检测。
!" 结果与讨论
%> =! 核酸酶 )=催化热变性 OC’的水解过程曲线
# , F @ 热变性 OC’，G5 为 "> 4，加入酶活为 =
"44 K的 =4A的核酸酶 )= 液（体积分数），水解温度
为 H4 I，其水解过程曲线见图 =。反应 = P 后产生
的
—)—&S()；—%—Y()；—*—&7()；—$—&’()；—(—ZDZ.E
图 =! 水解过程曲线（4 X =34 -+<）
[+,> =! Y+-9 :DKQR9 D\ &9D]^&7()、&’() 浓度的降低可能与发酵制备的核酸酶
)= 提取液中含有少量的磷酸单酯酶有关。在一定
条件下，磷酸单酯酶能够切除脱氧核苷酸中的磷酸
生成脱氧核苷，这导致了 &7()、&’()浓度的降低。万方数据
! "##$ 年 $ 月 吴永宏等：核酸酶 %& 催化水解热变性 ’()的研究 · $$! ·
在四种脱氧核苷酸当中，*+,% 的初始生成速度最
快，在 -# ./0 后基本已经进入稳定期，其次为
*),%，*1,%的生成速度最慢。当水解 &## ./0 后，
四种脱氧核苷酸的生成总量全都趋于稳定。
"2 "! 酶促水解条件的研究
"2 "2 &! 底物质量浓度对水解的影响
不同质量浓度的热变性 ’()，34 为 $2 #，加入
酶活为 & $## 6的核酸酶 %& 液（体积分数），水
解温度为 7# 8，其水解产物9时间曲线见图 "。
—(—&$: $ ; < =；—&—>: ? ; < =；—*—-: - ; < =；—$—@: "$ ; < =
图 "! 不同底物浓度水解产物9时间曲线
A/;2 "! BCD DEEDFG HE /0/G/IJ K6LKGMIGD FH0FD0GMIG/H0 H0 GCD CN*MHJNK/K
由图 " 可以发现在实验范围内，不同质量浓度
的底物 ’() 在水解 &## ./0 时酶解得率基本在
?#5，其得率随底物质量浓度变化相差不大。这一
现象说明在实验浓度范围内反应体系中不存在底物
抑制现象。
"2 "2 "! 酶浓度对酶解结果的影响
当底物质量浓度为 "2 ? ; < =，34 为 >2 #，温度为
7# 8，核酸酶 %&（体积分数）液加入量分别为 "5、
-5、>5、?5、时水解9时间曲线见图 @。
—%—"5；—*—-5；—#—>5；—(—?5；—&—
图 @! 不同初始酶浓度的水解曲线
A/;2 @! BCD DEEDFG HE GCD FH0FD0GMIG/H0 HE D0ON.D H0 GCD CN*MHJNK/K
由图 @ 可见酶的浓度由 "5增至 -5，水解率有
明显提高。当酶浓度大于 -5时，水解率并不随着
酶浓度的增加而明显提高。因此，水解过程只需要
加入 -5的酶液量足以保证所需要的水解。
"2 "2 @! 34对水解结果的影响
底物质量浓度为 -2 7" ; < =，酶活为 & $## 6的核
酸酶 %& 加入量 -5（体积分数），温度为 7# 8，底物
溶液初始 34 分别为 $2 #、$2 $、>2 $、72 $ 时，其水解9
时间曲线见图 -。
—)—34 $: #；—%—34 $: $；—+—34 >: $；—$—34 7: $
图 -! 34对核酸酶 %&催化 ’()水解的影响
A/;2 -! BCD DEEDFG HE 34 H0 GCD CN*MHJNK/K
由图 - 可知，在 &-? ./0 时，初始 34 72 $ 的水
解结果最低，初始 34 $2 # P >2 $ 之间的水解的结果
很接近。说明较高的初始 34 降低了核酸酶 %& 的
酶活，34 $2 # P >2 $ 的水解环境对保持核酸酶 %& 的
酶活较适宜。
"2 "2 -! 温度对于水解结果的影响
底物质量浓度为 "2 $" ; < =，34 为 >2 #，酶加入
量 -5（体积分数），实验温度分别为 $#、$?、7# 和 77
8，水解反应 &## ./0时结果见图 $。
图 $! 温度对水解脱氧核酸的影响
A/;2 $! BCD DEEDFG HE GD.3DMIG6MD H0 3MH*6FG/H0 HE *DHQN06FJDHG/*DK万方数据
! · "#! · 生物加工过程 第 $ 卷第 % 期
由图 " 可知，水解反应的最佳温度为 "& ’，此
时 "()脱氧核苷酸的产率最高。在 ** ’时，水解的
得率最低，这可能与较高温度下酶蛋白的失活（导
致酶的催化活性降低）有关。
%+ $! 正交实验确定核酸酶 ,- 催化热变性 ./0 水
解的优化条件
根据上述单因素实验的结果，选取 12（!）、温
度（’）（"）、热变性 ./0质量浓度（3 4 5）（#）、酶加
入量（体积分数）（$）做 %6（$
7）正交实验。实验结
果及分析如下。
表 -! 正交实验安排、结果及分析
89:;< -! =<>?;@ AB AC@DA3AE9; 实验
列号
!
温度
"
12
#
./0
质量浓度
$
酶加入量
酶解
得率
酶解得
率减去 *I
- "& "+ " 7+ I % &7+ & -7+ &
% "& #+ " -I+ I 7 &# -#
$ "& *+ " -&+ $ -I *&+ 7 &+ 7
7 "I "+ " -I+ I -I &I -I
" "I #+ " -&+ $ % *#+ " #+ "
# "I *+ " 7+ I 7 ** *
* #" "+ " -&+ $ 7 &- --
& #" #+ " 7+ I -I &7+ " -7+ "
6 #" *+ " -I+ I % &I -I
&- $6+ % $"+ & $#+ $ $-+ $
&% %$+ " $* $# $7
&$ $"+ " %"+ 7 %"+ 6 $%+ 6
’- -$+ I# --+ 6$ -%+ - -I+ 7$
’% *+ &$ -%+ $$ -% --+ $$
’$ --+ &$ &+ 7# &+ #$ -I+ 6#
极差 "+ %$ $+ 7* $+ 7* I+ 6
优方案 !- "% #- $%
由表 - 可知，温度对水解的结果影响最大，12
和 ./0浓度对水解的结果影响程度相当，酶加入量
的影响最低。最好的水解条件为 !-"%#-$%。按照
这个条件实验，最终的水解收率达到 6%J。
%+ 7! 核酸酶 ,- 催化热变性 ./0水解的酶学性质
取不同浓度的热变性 ./0，12为 #+ "，加入 7J
的核酸酶 ,- 液（体积分数），水解温度为 "& ’，其
水解反应开始阶段结果见图 #。
由图 #，* 可知，在实验的浓度范围内，随着底物
初始质量浓度的增加，指数反应期反应速度也随之
增加，在底物初始质量浓度为 I K $I 3 4 5 时，随底物
质量浓度的增加，反应速率呈线性增加。表明核酸
酶 ,- 催化热变性 ./0的水解遵循一级反应规律，
底物浓度与酶促反应速度的关系符合米氏（LGMD9<)
;G>)L*H9F［+］
&H N［+］
表
述核酸酶 ,- 催化热变性 ./0 的水解反应。其中 (
为初速度，*H9F为最大反应速度，［+］为底物质量浓
度，&H为米氏常数。对反应速率与底物质量浓度用
O808PO8PQ数学软件中的最小二乘法进行非线性拟
合，其拟合的 , R I+ 66&，可以得到 *H9F R -+ 7** S
-I T-3 4（5·HGE），&H R "+ &-& S -I
T% 3 4 5。
—)—%6U " 3 4 5；—&—%I 3 4 5；—*—--U & 3 4 5；
—#—&U &" 3 4 5；—(—"U 6 3 4 5
图 #! 不同浓度初始底物酶解时间曲线
VG3+ #! 8D< ?:>@C9@< MAEM?M@> XG<;W
图 *! 不同初始质量浓度底物的水解速率图
VG3+ *! 8D< M?CY< AB DXWCA;X>G> Y<;AMG@X
!" 结" 论
用桔青霉 PLI%（-./01022034 10560/34）发酵制得
的核酸酶 ,-（分离纯化后酶活为 - "II ?）催化水解
热变性 ./0，通过正交实验获得了最佳的水解条
件：温度 "& ’，12 #+ "，./0 质量浓度 7+ I 3 4 5，酶
加入量为 7J时，脱氧核苷酸的得率为 6%J。动力万方数据
! "##$ 年 $ 月 吴永宏等：核酸酶 %& 催化水解热变性 ’()的研究 · $*! ·
学研究结果表明核酸酶 %& 催化米氏常数 !+ ,
$- .&. / &# 0" 1 2 3。
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京：北京大学出版社，&SST，&*TO&*X：
"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
"*#O"*$C
（上接第 TT 页）
!" 结" 论
本文尝试了不同功能基团的聚苯乙烯树脂进行
’O海因酶的固定化，结果表明氨基树脂功能基为伯
氨基和仲氨基效果较好。从酶活回收率，固定化酶
的使用寿命，聚苯乙烯树脂价格等方面综合考虑，认
为采用聚苯乙烯树脂 ’S" 所制备的固定化酶具有
应用价值。采用该树脂制备固定化酶的最优条件
是：酶质量浓度 X +1 2 +3、温度 "$ ]、时间 &" A。所
得固定化酶的最适作用温度 T$ ]，最适作用 IB 为
.- $，且作用温度及适宜作用 IB 较广，!+为游离酶
的 &- . 倍，且储存稳定性、操作稳定性较好。T$ ]
下进行连续反应，其半衰期为 && E。
参考文献：
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发酵液中的有机酸［P］C分析化学，"##U，U&（&"）：&TSXO&TSSC
［.］! 王训遒，蒋登高，周彩荣C高效液相色谱法测定丁二酸、戊二酸
和己二酸［P］C化学工业与工程技术，"##"，"U（X）：UXOU*C
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